王軒宇，闕華發(fā)（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

據(jù)報道，全世界約有4.15 億人患有糖尿病，另約有1.93 億潛在糖尿病患者未被診斷[1]。我國成人糖尿病患者人數(shù)已超過1.14 億[2]。糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）是一種嚴重的糖尿病并發(fā)癥，糖尿病患者終生患腳潰瘍的風(fēng)險高達25%[3]。DFU 患者截肢率和死亡率高，死亡率約為未患有DFU 的糖尿病患者的兩倍[4]。DFU 復(fù)發(fā)率高，3年后復(fù)發(fā)率大于50%[5]。糖尿病患者因局部缺血、神經(jīng)病變、感染等因素協(xié)同作用而導(dǎo)致足潰瘍發(fā)生。此外，年齡、性別、吸煙史、足部溫度等因素也影響DFU 的發(fā)生發(fā)展[6-8]。目前，DFU的外治主要以局部清創(chuàng)和新型敷料為主，但由于其發(fā)病機制尚不明確，臨床治療缺乏靶向性，因此DFU 仍然是慢性難愈性潰瘍領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。

細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是由膠原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和其他糖蛋白組成的非細胞三維高分子網(wǎng)絡(luò)[9]。既往的研究中，人們常注重探究細胞內(nèi)環(huán)境和成分的改變對疾病的影響，而ECM 對疾病的影響不夠重視。隨著細胞分離技術(shù)和分子生物學(xué)的進步，人們逐漸認識到ECM 不僅是支持細胞的框架，還提供重要的生物化學(xué)與生物物理學(xué)信息，對細胞形態(tài)、生長、分裂、分化和凋亡起重要的調(diào)控作用。當(dāng)前，ECM 已證實與免疫、炎癥、創(chuàng)面愈合、血管生成、惡性轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)[10]。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)ECM 在DFU 的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起到了重要作用。本文對一些主要ECM 組分及其相關(guān)酶類與抑制劑在DFU 的發(fā)生與修復(fù)中的作用與可能機制進行重點綜述。

1 ECM 穩(wěn)態(tài)在DFU 創(chuàng)面愈合中的作用

ECM 是一種高度動態(tài)的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，其蛋白組分與相關(guān)酶類以及酶類相關(guān)抑制劑的組成、含量、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生物活性共同構(gòu)成ECM 穩(wěn)態(tài)，是細胞微環(huán)境的重要組成部分。維持ECM 穩(wěn)態(tài)無論是在組織發(fā)育還是在組織的疾病與再生中都至關(guān)重要，因而越來越受到重視。DFU 創(chuàng)面愈合既涉及細胞遷移、增殖與分化，也涉及ECM 沉積和重塑等生物學(xué)過程。在DFU 微環(huán)境中，深入探究ECM 穩(wěn)態(tài)重塑在DFU 傷口愈合的作用與機制可為以ECM為分子靶標的DFU 治療策略提供新的研究方向。

DFU 進展特征區(qū)別于普通創(chuàng)面愈合過程，表現(xiàn)為炎癥期延長，增殖期有限，重塑不規(guī)則等[11-13]。ECM 作為結(jié)構(gòu)支撐和細胞相互作用的重要媒介，是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵促進者。在傷口愈合過程中，斷裂的原纖維被ECM 酶降解，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），包括膠原酶和明膠酶等，新的ECM 原纖維也被合成和修飾來實現(xiàn)肌肉等組織再生[14-15]。即ECM 重構(gòu)涉及ECM 退化、產(chǎn)生和成熟之間的平衡，以及MMPs 和金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）的平衡。而在DFU 傷口愈合過程中，涉及的炎癥因子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等過度分泌以及ECM 調(diào)控基因、ECM 相關(guān)酶類異常表達，平衡傾向于產(chǎn)生更多降解的、不可溶性的原纖維，導(dǎo)致ECM 穩(wěn)態(tài)紊亂。DFU 中主要ECM及其相關(guān)酶類的變化情況見表1及表2。

表1 DFU 進程中主要ECM 分子的變化情況Tab 1 Change of major ECM components in the DFU process

表2 DFU 進程中ECM 相關(guān)酶類及其抑制劑的變化情況Tab 2 Change of ECM related enzymes and their inhibitors in the DFU process

在糖尿病中，高糖環(huán)境和其他變化引起炎癥因子過度釋放及氧化應(yīng)激性損傷，MMPs 的產(chǎn)生增加，高表達的MMPs 進一步加重炎癥，同時MMPs/TIMPs 比值增加，導(dǎo)致ECM 穩(wěn)態(tài)改變，ECM 片段過度累積[27-28]。此外，高糖導(dǎo)致糖基化引起晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的蓄積也會改變ECM 的結(jié)構(gòu)和功能，糖基化導(dǎo)致分子間交聯(lián)的形成，這顯著改變了ECM 的生物力學(xué)特性，并導(dǎo)致真皮成纖維細胞的細胞周期停滯和凋亡[29-31]。而ECM 的病理狀態(tài)，進一步影響細胞黏附與增殖及細胞正常生物功能，導(dǎo)致DFU 創(chuàng)面經(jīng)久難愈。ECM 穩(wěn)態(tài)在DFU 中的作用模式見圖1。

圖1 ECM 穩(wěn)態(tài)在DFU 進程中的作用模式示意圖Fig 1 Mode of ECM steady state in the DFU process

2 ECM 及其酶類在DFU 治療中的作用

2.1 ECM 在DFU 治療中的作用

透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）是皮膚ECM的主要成分，以酯化的形式存在于許多真皮基質(zhì)中。HA 在創(chuàng)面愈合的增殖階段影響細胞的遷移、增殖、炎癥反應(yīng)和血管生成等多種過程，在傷口愈合和組織修復(fù)過程中處于關(guān)鍵地位[32]。Lee等[33]為了確認HA 在DFU 治療中的唯一有效性，使用不含其他物質(zhì)的HA 敷料進行了一項前瞻性研究，將34 位患者隨機分為HA 敷料組和常規(guī)敷料組兩組，發(fā)現(xiàn)HA 敷料組的完全治愈率顯著高于常規(guī)敷料組，潰瘍愈合速度更快。這些研究顯示，HA 作為ECM 的主要成分，純外源性HA 敷料治療DFU 有效。

膠原蛋白（collagen）是一種主要ECM 組分，也是皮膚的重要組成部分，可促進成肌纖維細胞分化與纖維化，從而保留天然ECM 結(jié)構(gòu)并促進愈合[34]。Colak 等[35]將64 例Wagner 2 級或以上DFU 患者分為膠原組（34 例）和生理血清組（30例），治療12周后，生理血清組17例患者（56.6%）完全愈合，膠原組25 例完全愈合（73.5%）。與生理血清組相比，膠原蛋白組平均愈合時間更短、創(chuàng)面愈合率明顯更高，提示在DFU 的治療中使用膠原蛋白敷料可以有效縮短愈合時間。

2.2 以ECM 酶類為靶點的DFU 防治

MMP-9 等酶高表達及MMPs/TIMPs 比例失衡是導(dǎo)致DFU 創(chuàng)面難愈的主要原因，以MMPs為靶標設(shè)計抑制劑有望成為DFU 防治新策略。ND-336 能選擇性抑制MMP-9，同時不影響MMP-8 活性，可通過降低炎癥，增強血管生成和使傷口重新上皮化來加速糖尿病傷口的愈合，從而逆轉(zhuǎn)病理狀態(tài)，有效促進DFU 創(chuàng)面愈合[36]。ND-336 和活性重組MMP-8 復(fù)合物的局部應(yīng)用進一步增強了愈合效果，這一策略在DFU 的愈合中具有很大的前景[37]。

高選擇性MMP 抑制劑已被證實在DFU 的治療中具有巨大潛力。然而，MMPs 之間結(jié)構(gòu)的相似性使得選擇性MMPs 抑制劑的藥物設(shè)計極具挑戰(zhàn)。隨著多組學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)進步，應(yīng)用于靶標和藥物間關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的構(gòu)建，結(jié)合分子對接技術(shù)進行高精度預(yù)測，可為尋找高特異性的MMPs 抑制劑提供解決方案。

3 ECM 穩(wěn)態(tài)在DFU 創(chuàng)面愈合中可能的機制

ECM 通過連接特定的跨膜受體，激活或改變細胞形態(tài)和細胞骨架動力學(xué)特性，影響細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)細胞的生長、遷移和細胞命運，介導(dǎo)多種生理和病理過程。傷口愈合是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及復(fù)雜的ECM 分子和細胞間的相互作用。目前，缺乏DFU 的發(fā)病機制制約了人們對ECM 在DFU 創(chuàng)傷愈合中的理解，現(xiàn)有研究主要集中在ECM 組分及其酶類變化導(dǎo)致DFU創(chuàng)面難愈，以及ECM 相關(guān)成分防治DFU 有效性與安全性的評價，而關(guān)于ECM 分子在DFU 的作用機制缺乏深入研究，本文綜合當(dāng)前的研究結(jié)果，將ECM 穩(wěn)態(tài)在DFU 中可能的機制進行以下探討。

3.1 新生血管生成

血管生成在傷口愈合中起核心作用，新生血管生成機制受損是DFU 傷口難以愈合的主要因素。ECM 包括基質(zhì)蛋白及其降解性金屬蛋白酶，是微環(huán)境的主要組成部分，在血管重塑過程中表現(xiàn)出復(fù)雜的動態(tài)變化[38]?；啄ぃ˙M）是ECM中的細膩、納米級和柔軟的薄片，它直接影響皮膚完整性和神經(jīng)肌肉結(jié)構(gòu)，從而影響皮膚脂肪形成和纖維化[39]。BM 是支撐毛細血管形態(tài)結(jié)構(gòu)和維持血管動態(tài)平衡所必需的物質(zhì)。通過去除包含生長因子的細胞成分和脂質(zhì)殘留物純化獲得的無細胞脂肪提取物（cell-free fat extract，Ceffe），能顯著促進體外培養(yǎng)的真皮成纖維細胞的增殖。在小鼠皮膚中，Ceffe 顯著增加了真皮的厚度、增殖細胞的數(shù)量和毛細血管的密度[40]。骨ECM-仿生納米纖維系統(tǒng)顯著改善了內(nèi)皮細胞的附著和增殖，并上調(diào)血管生成標記（CD31）的表達，其在體內(nèi)還通過上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hif-1α），血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），膠原蛋白1（Col1）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的mRNA 和蛋白表達，顯著促進了血管生成、肉芽組織形成以及膠原基質(zhì)重塑和表皮分化，從而有效促進糖尿病傷口的愈合[41]?？梢姡珼FU 組織內(nèi)ECM 合成與降解的失衡影響血管生成和毛細血管完整性可能是導(dǎo)致創(chuàng)面難愈的主要原因，外源性ECM 對DFU 新生血管形成有積極意義。

3.2 氧化應(yīng)激水平

氧化還原信號通過影響ECM 的結(jié)構(gòu)與功能調(diào)節(jié)傷口愈合。糖尿病中正常的氧化還原信號被破壞，導(dǎo)致自由基（如ROS）生成和清除之間關(guān)系失衡。研究發(fā)現(xiàn)DFU 患者的病灶周圍皮膚組織處于嚴重的氧化應(yīng)激狀態(tài)，皮膚核因子-E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)活性降低，氧化性DNA 損傷增加[42]。臨床標本檢測結(jié)果表明，與對照組相比，DFU 組組織中過氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（NO）含量增加，高糖水平可能通過激活PKCβ-p66shc 途徑誘導(dǎo)細胞和組織氧化應(yīng)激損傷[43]。

3.3 細胞行為與功能

骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞（EPCs）募集減少，成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移降低是DFU 愈合不良的主要特征。ECM 對這些細胞的功能與行為產(chǎn)生重要影響。ECM 連接特定的跨膜受體，激活改變細胞形狀和細胞骨架動力學(xué)的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)細胞的生長和活力、細胞遷移，對塑造發(fā)育和協(xié)調(diào)組織行為至關(guān)重要。體外研究表明纖連蛋白能保持EPCs 干細胞特征并擴增，而明膠和膠原蛋白則將EPCs 導(dǎo)向成熟的內(nèi)皮表型，這些ECM 可通過調(diào)節(jié)EPC 為骨髓重建和新血管生成提供條件[44]。外源性膠原蛋白膜能促進成纖維細胞遷移[45]。HA 由成纖維細胞與角質(zhì)形成細胞動態(tài)產(chǎn)生，細胞外HA 與細胞表面受體CD44 的相互作用在這些細胞生理中起重要調(diào)節(jié)作用[46]?？梢?，DFU 環(huán)境下的ECM 組成和結(jié)構(gòu)的紊亂損害了細胞行為與功能，引起損傷局部組織穩(wěn)態(tài)失衡，最終造成愈合困難。

3.4 炎性細胞因子水平

糖尿病患者體內(nèi)長期高血糖發(fā)揮累積作用，導(dǎo)致感染后炎癥細胞因子水平升高，細胞毒性介質(zhì)分泌增加，從而導(dǎo)致持續(xù)的炎癥狀態(tài)和傷口上皮功能異常[47]。DFU 創(chuàng)面組織MMPs 分泌增加，其水解產(chǎn)物ECM 片段增多。而大量ECM 片段及其受體與體內(nèi)炎癥發(fā)生顯著有關(guān)[48]。此外，在炎癥過程中ECM 片段表達上也可以激活免疫細胞，從而使炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生[49]。這種異常表達的ECM 與炎癥反應(yīng)之間相互影響、相互促進作用模式導(dǎo)致DFU 創(chuàng)面長期在較高的炎癥水平，以致遷延難愈。

3.5 生長因子水平

生長因子是一類生物活性多肽，包括血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮生長因子（epidermal growth factor）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）等，影響多種細胞的增殖和遷移，成纖維細胞和炎癥細胞的血管生成和趨化，在加速和促進傷口愈合過程中起著重要作用，生長因子也有助于防止細胞凋亡，并影響ECM 的產(chǎn)生和重塑[50]。糖尿病患者VEGF-A 和胎盤生長因子（PlGF）等生長因子表達水平與DFU的發(fā)生成負相關(guān)[51]。ECM 有利于維持生長因子活性，DFU 創(chuàng)面組織ECM 穩(wěn)態(tài)遭到破壞，導(dǎo)致生長因子受體的調(diào)節(jié)降低和生長因子的快速退化，從而影響患者傷口愈合。

4 問題與展望

長期以來，人們普遍傾向于將ECM 簡單視為一種結(jié)構(gòu)組分，將機體重要病理生理改變解釋歸于單純的細胞功能與活動的變化。隨著對ECM的機械性能與生物力學(xué)研究的逐漸深入，以及對整聯(lián)蛋白、CD44、盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體等細胞表面受體的廣泛研究，人們對其與細胞之間的復(fù)雜相互作用逐漸有了清晰認識，明確了ECM 組分調(diào)節(jié)信號級聯(lián)與細胞骨架構(gòu)型等功能在細胞形態(tài)發(fā)生和穩(wěn)態(tài)維持等方面的重要性，強調(diào)了其在急慢性創(chuàng)面愈合中的關(guān)鍵作用。靶向ECM 組件（例如蛋白聚糖和糖胺聚糖，MMPs 和TIMPs 等）有望成為慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)創(chuàng)新防治的新策略。

目前，DFU 的治療主要有傷口清創(chuàng)，減壓，重塑血管和防治感染等方法。除這些傳統(tǒng)療法外，新的治療方法如重組生長因子，皮膚替代品，細胞因子刺激物或抑制劑，MMPs 抑制劑，神經(jīng)肽，血管生成刺激物等[52]，以及未來的治療策略包括干細胞的療法，基因療法，應(yīng)用血管緊張素受體類似物等已成為DFU 防治研究的熱點。這些新型DFU 的治療方法中，通過干預(yù)生長因子、炎性因子、MMPs、血管生成以及干細胞等療法需要通過調(diào)節(jié)ECM 組件或ECM 功能支持來實現(xiàn)。提示，ECM 組件在DFU 的傳統(tǒng)或新型療法中都起著舉足輕重的作用，以ECM 為靶點的DFU 防治研究具有重要學(xué)術(shù)意義與應(yīng)用價值。

然而，目前掌握的有關(guān)蛋白酶和生物活性ECM 片段數(shù)據(jù)是有限，另外蛋白酶和ECM 片段通常存在時間短，且局部濃度低，因此，尚缺乏對ECM 完整的生物學(xué)信息的了解[53-54]。此外，ECM 的特定受體、ECM-受體間相互作用機制研究均不夠充分，ECM 穩(wěn)態(tài)失衡引起細胞外微環(huán)境的改變是如何調(diào)控細胞的生長，代謝，遷移，增殖和分化等生命活動，以及調(diào)節(jié)組織或器官的功能機制尚未闡明。因此，缺乏對ECM 完整的生物學(xué)信息的了解，局限了ECM 對DFU 作用及其機制的詮釋。隨著先進檢測與分析技術(shù)的快速進步，如基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄物組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等方法，通過組織質(zhì)譜、雙光子顯微鏡和低溫電子顯微鏡，以及基于衍射和X 射線的光譜技術(shù)，能準確而有效地分析低豐度物質(zhì)的時空分布，有助于系統(tǒng)地詮釋ECM 功能與活動，以及細胞-ECM 間復(fù)雜的生物學(xué)作用。這些方法可以應(yīng)用于ECM 在DFU 中作用與機制研究，為開發(fā)更有效的DFU 防治策略提供新的思路與方向。