程曉妮，倪健，潘亞磊*，唐志書*，周瑞，蘇潔，張海潮，宋忠興（.陜西中醫(yī)藥大學/陜西中藥資源產業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育）/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽7083；.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 0488）

正源方是由西洋參、當歸、南沙參、仙鶴草等組成的臨床經驗方，由參脈散[1]和當歸補血湯[2]兩個經典方劑加減化裁而成，具有扶正解表、生血止血之功效，以湯劑在臨床運用于治療惡性腫瘤放化療引起的氣血虧虛證中具有良好療效，可有效緩解患者放化療引起的毛發(fā)脫落，皮膚紅疹、斑疹、紫癜等不良反應，并且能有效改善血虛患者白細胞、血小板總數(shù)，從而改善機體狀態(tài)[3]。本文研究采用環(huán)磷酰胺（CTX）所致小鼠損傷模型，通過觀察正源方不同工藝對小鼠的一般狀態(tài)、體質量變化、外周血常規(guī)、血清超氧化物歧化酶（SOD）、血清丙二醛（MDA）、小鼠臟器指數(shù)及肝臟和股骨切片的病理變化，評價正源方兩種工藝獲得的制劑前體藥物對CTX 損傷小鼠的保護作用。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級昆明小鼠49 只，雄性，體質量（25±5）g [成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（川）2020-030]；動物顆粒飼料（成都達碩實驗動物有限公司）；動物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學陜西中藥資源產業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心SPF 級動物飼養(yǎng)室[SYXK（陜）2017-004]。

1.2 試藥

正源方由西洋參、當歸、南沙參、仙鶴草、重樓組成（以上飲片由西安盛興中藥飲片有限責任公司提供）。地榆升白片（成都地奧集團天府藥業(yè)股份有限公司）；環(huán)磷酰胺（Sigma 公司）；SOD 試劑盒和MDA 試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。

1.3 儀器

全自動血液細胞分析（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；5910R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；HH-S4A 水浴鍋（北京科偉永興儀器公司）；TS100-F 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 正源方前處理工藝

2.1.1 工藝Ⅰ制法 稱取西洋參250 g、仙鶴草250 g、當歸80 g、南沙參125 g 和重樓100 g，共805 g，加 16 倍量的水煎煮 2 次，每次 2 h，過濾，合并濾液后濃縮至2 L，經噴霧干燥裝置制成工藝Ⅰ粉末185 g，備用。經計算工藝Ⅰ所制備的粉末每g 含生藥量為4.35 g。

2.1.2 工藝Ⅱ制法 取仙鶴草250 g 和當歸80 g，共330 g，用 14 倍量的 50% 乙醇回流提取，提取3次，每次1 h，濃縮成450 mL 稠膏；藥渣與南沙參125 g，用 16 倍量的水提取，提取2 次，每次2 h，濃縮成600 mL 稠膏；西洋參 250 g（超微粉碎 30 min）和重樓 100 g（超微粉碎 40 min）與上述稠膏混合，65℃ 烘干粉碎制成工藝Ⅱ粉末 455 g，備用。經計算工藝Ⅱ所制備的粉末每g 含生藥量為1.77 g。

2.2 動物分組及造模

將所有小鼠按照體質量隨機分為空白組，模型組，地榆升白片組，工藝Ⅰ組，工藝Ⅱ低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組7 只小鼠。工藝Ⅰ組給藥劑量計算方法：以正源處方成人每日臨床常用劑量97 g，除以成人體質量60 kg，乘以小鼠和人換算系數(shù)9.1，再除以工藝Ⅰ制備粉末所含的生藥量4.35，計算得工藝Ⅰ組給藥劑量為3.38 g/（kg·d）。同法計算地榆升白片組給藥劑量為0.18 g/（kg·d），工藝Ⅱ高、中、低劑量組給藥劑量分別為8.30、4.15、2.08 g/（kg·d）。

小鼠每日灌胃所需藥液現(xiàn)用現(xiàn)配，根據(jù)小鼠體質量，稱量每組小鼠每日灌胃所需藥物粉末，按照每10 g 小鼠灌胃體積0.1 mL，加入適量蒸餾水，超聲制備成溶液或混懸均勻的溶液后灌胃。正常組和模型組灌胃給予蒸餾水，其余各組灌胃給予相應劑量藥液，連續(xù)給藥14 d。除空白組外，其余各組小鼠于第 4、5、6、7日連續(xù)4 d 腹腔注射CTX [0.07 g/（kg·d）]進行造模。14 d 后，腹腔注射水合氯醛麻醉處死小鼠，取材測定相應指標。

2.3 觀測小鼠生存情況和體質量變化

每日觀察小鼠的毛色、飲食及活動等狀態(tài)，并于第 1、3、7、10、14日稱量小鼠體質量，并作記錄。

2.4 動物外周血常規(guī)測定

小鼠末次給藥 2 h 后進行眼眶取血，使用全自動血液細胞分析儀測定外周血常規(guī)白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）以及血小板（PLT）水平。

2.5 檢測 SOD 和 MDA 水平

采用試劑盒檢測正源方制劑對模型小鼠血清SOD 和 MDA 的影響。

2.6 臟器指數(shù)測定

解剖獲取各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎和胸腺，使用生理鹽水將臟器清洗干凈，再用濾紙沾干生理鹽水，稱重后計算臟器指數(shù)。

2.7 HE 染色

解剖獲取各組小鼠的肝臟和股骨，用 10% 甲醛固定，股骨進行脫鈣處理。肝臟和股骨遠端石蠟包埋切片（5 μm），常規(guī)方法脫蠟，進行 HE 染色，顯微鏡下觀察組織病理改變。

2.8 統(tǒng)計分析

分析采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）和 GraphPad Prism Version 5（GraphPad Software，CA，USA）。全部數(shù)值用±SD 表示。多組間采用單因素方差分析進行檢驗統(tǒng)計，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同工藝對 CTX 損傷小鼠生存情況的影響

觀察結果顯示，造模前各組小鼠精神狀態(tài)較好，毛色光澤，飲水量較多；造模后，模型組小鼠從實驗第 10日開始逐漸出現(xiàn)精神萎靡，皮毛粗糙并存在頭部顯著脫毛等現(xiàn)象。與模型組比較，給藥組小鼠精神狀態(tài)較好，毛皮脫落較模型組輕。

3.2 不同工藝對 CTX 損傷小鼠體質量變化的影響

各組動物體質量變化見表1所示，在第14日，模型組小鼠的體質量較空白組降低（P＜0.001），表明CTX 會影響小鼠的正常發(fā)育；工藝Ⅰ組以及工藝 Ⅱ中、高劑量組小鼠相比模型組的體質量升高（P＜0.05 或P＜0.01）。

表1 小鼠14 d 體質量變化Tab 1 Body mass change in mice in 14 days

3.3 不同工藝對 CTX 損傷小鼠外周血常規(guī)的保護作用

小鼠外周血常規(guī)變化見表2。與空白組比較，模型組WBC 含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，地榆升白片組、工藝Ⅱ低劑量組和中劑量組可提高CTX 損傷小鼠的WBC 含量（P＜0.05或P＜0.01），表明正源方工藝Ⅱ組可以在一定濃度范圍內保護因CTX 導致的小鼠體內的WBC 降低。各組RBC 和PLT 無顯著差異。

表2 不同工藝對 CTX 損傷小鼠外周血常規(guī)的保護作用Tab 2 Protective effect of different processes on the peripheral blood in mice with cyclophosphamide-induced injury

3.4 不同工藝對CTX 損傷小鼠臟器的影響

各組小鼠臟器指數(shù)見表3，結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠脾臟腫大，這可能是注射CTX 引起機體的免疫應激，促進其脾臟的亢進，引起脾臟腫大。工藝Ⅰ組和工藝Ⅱ低、中劑量組可以顯著降低模型組小鼠脾臟指數(shù)（P＜0.05 或P＜0.01）。各組間心、肝、肺、腎和胸腺的臟器指數(shù)無顯著性差異。說明地榆升白片組和正源方各組對CTX 損傷小鼠的脾臟有顯著保護作用。工藝Ⅱ高劑量組小鼠胃腸道藥物粉末蓄積現(xiàn)象嚴重，表現(xiàn)為小鼠胃腸內容物顯著增多。

表3 不同工藝對 CTX 損傷小鼠臟器指數(shù)的影響Tab 3 Effect of different processes on the organ index of mice with cyclophosphamide-induced injury

3.5 不同工藝對CTX 損傷小鼠的肝組織病理形態(tài)的影響

如圖1所示：與空白組相比，模型組可見組織中有較多肝細胞輕度水腫，胞質疏松淡染（綠箭頭），有髓外造血灶（紅箭頭），胞質中可見較小的圓形空泡（藍箭頭），偶見肝細胞點狀壞死，核溶解（黑箭頭）；地榆升白片組、工藝Ⅰ組和工藝Ⅱ各劑量組均能在一定程度上減輕上述肝組織病理學損傷，肝細胞結構完整，排列整齊。提示正源方可明顯改善CTX 損傷引起的肝組織損傷。

圖1 肝臟HE 染色Fig 1 HE staining of liver

3.6 不同工藝對CTX 損傷小鼠的股骨組織病理形態(tài)的影響

如圖2所示：模型組小鼠股骨的骨小梁數(shù)目減少，骨組織連接度降低，骨組織比例下降。工藝Ⅰ組和工藝Ⅱ各劑量組小鼠骨小梁的數(shù)目、骨組織連接度、骨組織比例都有明顯的提高。提示正源方對CTX 損傷模型引起的股骨骨小梁丟失具有一定的保護作用。地榆升白片組作用不顯著。

圖2 股骨HE 染色Fig 2 HE staining of femur

3.7 不同工藝對CTX 損傷小鼠血清的SOD 和MDA 影響

各組小鼠血清的SOD 和MDA 含量見表4，結果顯示，與空白組比較，模型組 SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，工藝Ⅰ組和工藝Ⅱ各劑量組的SOD 水平上升（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），工藝Ⅰ組和工藝Ⅱ低、中劑量組 MDA 水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。初步表明正源方可以提高CTX 損傷小鼠血清的抗氧化作用。

表4 不同工藝對CTX 損傷小鼠血清的SOD 和MDA 影響Tab 4 Effect of different processes on serum SOD and MDA in CTX-injured mice

4 討論

CTX 化學損傷法是免疫抑制造模方法之一[4]。CTX 是一種烷化劑，是臨床上常用的免疫抑制藥物，可殺傷淋巴細胞，抑制B 細胞的特異性抗體反應，同時可損傷機體的免疫器官，抑制骨髓造血功能，從而影響免疫應答的各個階段，導致機體免疫功能低下[4-5]。因此，研究能減少或拮抗CTX 毒副作用的藥物，具有十分重要的意義。

正源方原湯劑每日一劑的臨床應用生藥量為97 g，由西洋參、仙鶴草、當歸、南沙參等組成，日服用劑量較大，加之方劑化學成分復雜，不同的制備工藝對藥物的臨床療效有很大影響[6]，為了保障其與湯劑應用一致性；同時，為保證貴細藥西洋參、重樓藥物“全成分”充分利用，結合制劑需要，擬考慮將其部分粉碎，亦可發(fā)揮“藥輔同源”之用途。本研究對比了傳統(tǒng)水提干燥制備的工藝Ⅰ和采用新技術制備的工藝Ⅱ獲得的制劑前體藥物對CTX 損傷小鼠保護作用。工藝Ⅱ處理技術是根據(jù)文獻資料所報道的方中各味中藥有效成分、有效部位的理化特性以及正源方的功效作用，結合在前期化學成分研究和藥理學活性研究的基礎上[7-8]，對正源方采用部分藥材超微粉碎＋水醇雙提方法進行工藝制備。超微粉碎技術可以改變藥材的均勻性，提高有效成分的溶出量、藥理作用，達到提高制劑品質。劉穎等[8]發(fā)現(xiàn)超微七白散比普通粉末對抗黃體酮造成豚鼠皮膚損傷、氧化應激等得到更好的保護作用。

本文采用CTX 化學損傷法建立動物模型，研究了兩種工藝獲得的制劑前體藥物對CTX 損傷小鼠的一般狀態(tài)、外周血常規(guī)、組織臟器及血清中SOD 和MDA 含量變化的影響。結果顯示，兩種工藝獲得的前體藥物均可保護CTX 損傷小鼠的一般狀態(tài)，但工藝Ⅱ中劑量組可增加外周血WBC 含量，工藝Ⅰ組無顯著性差異；正源方各組能夠有效保護CTX 損傷小鼠的脾臟、肝臟和骨組織。脾臟是體內重要的免疫器官，當感染或損傷時脾臟隨之發(fā)生明顯的變化，脾臟指數(shù)通常可以作為反映免疫功能變化的指標，與模型組相比，兩組工藝獲得制劑前體藥物夠降低因外界刺激導致機體免疫應激而引起的脾臟指數(shù)的增大，降低 CTX 對臟器的損傷，與前期研究結果基本一致[7]。CTX 會造成紅細胞緩慢性的氧化損傷[9]，通過檢測小鼠血清中的 SOD 和 MDA 水平，兩組工藝獲得制劑前體藥物均能夠升高 SOD 水平，降低 MDA 水平，初步表明正源方可以保護機體免受氧化應激損傷。正源方工藝Ⅱ中劑量組較工藝Ⅰ組提高WBC 作用更優(yōu)，其余觀測指標兩組效果相當，表明工藝Ⅱ中劑量組與工藝Ⅰ組在治療 CTX 損傷時藥效相當。實驗發(fā)現(xiàn)，工藝Ⅱ中劑量組總體優(yōu)于工藝Ⅱ高劑量組，一方面可能是因為超微粉碎使藥物的有效成分較好地分散、溶解在胃液中，且與胃黏膜的接觸面積變大，提高藥理作用[10-11]；另一方面可能是由于藥材進行超微粉碎后有毒有害的成分暴露出來，或藥液中水不溶性粉末過多，影響胃腸道的蠕動、黏膜吸收以及激素的分泌[12]，從而導致高劑量組藥材的毒理作用增加[11-12]。

綜上所述，正源方兩組工藝獲得制劑前體藥物對CTX 小鼠損傷具有一定的保護作用，工藝Ⅱ中劑量組比工藝Ⅰ的藥理作用較為顯著，但實驗發(fā)現(xiàn)，工藝Ⅱ組藥物吸收后可能影響胃腸道的蠕動、黏膜吸收以及激素的分泌藥物，出現(xiàn)了部分的毒副反應，相關的藥理作用和毒性副作用等均需要臨床實踐的檢驗和進一步的研究。