蔣振偉，楊旭萍，蔣艷，凌靜，董露露，鄒素蘭，陳榮，胡楠（常州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 常州 213003）

霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）是由青霉菌發(fā)酵生成的有機弱酸，在體內(nèi)通過抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶的活性，阻斷嘌呤核苷酸的合成，抑制T、B 淋巴細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[1]。MPA 在體內(nèi)主要通過尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate glucuronyl-transferase，UGT）代謝為葡萄糖醛酸化物（MPA-glucuronide，MPAG）和?；钠咸烟侨┧峄铮╝cyl-MPAglucuronide，AcMPAG）[2]，各化合物結(jié)構(gòu)見圖1。MPA 的藥動學(xué)個體間差異較大，且濃度與療效和不良反應(yīng)有關(guān)[2]，治療藥物監(jiān)測具有重要意義。MPAG、AcMPAG 與MPA 游離藥物濃度、肝腸循環(huán)及二次峰濃度等有密切關(guān)聯(lián)[3-4]，因此測定上述三者血藥濃度于MPA 血藥濃度監(jiān)測、指導(dǎo)臨床合理用藥有實際意義。現(xiàn)有的關(guān)于MPA 及其代謝物血藥濃度測定的方法基本是測定其中的單一化合物。同時測定MPA、MPAG、AcMPAG 有助于提高測定效率和藥物檢測時效。本研究建立了同時測定血漿中三者濃度的LC-MS/MS 法。

圖1 MPA、MPAG、AcMPAG 及MPA-d3 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of MPA，MPAG，AcMPAG and MPA-d3

1 材料

1.1 儀器

Jasper HPLC 液相色譜儀，Triple Quad 4500MD三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB SCIEX，美國），Vortex-Genie 2 渦旋混合器（Scientific industries，美國），5417R 低溫高速離心機（Eppendorf，德國），Direct-Q 純水儀（Millipore，美國），BT25S 電子分析天平（Sartorius，德國）。

1.2 試藥

MPA（純度：98%， 批號：3-BKG-19-1）、MPAG（純度：96%，批號：2-FAI-5-1）、AcMPAG（純度：95%，批號：6-PQY-99-1）（Toronto Research Chemicals 公司），內(nèi)標(biāo)MPA-d3（純度：98%，批號：3-ACA-246-4，Cmass 公司）。甲醇（色譜純，Merck公司）；甲酸和乙酸銨（分析純，Sigma-Aldrich 公司）；純水由Milli-Q 超純水系統(tǒng)制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kinetex C18（3 mm×100 mm，2.6 μm，Phenomenex，USA），流動相A：水（0.1%甲酸，10 mmol·L－1乙酸銨），流動相B：甲醇（0.1%甲酸），梯度洗脫：0～0.8 min，60%A；0.8～3.8 min，0%A；3.8～4 min，60%A；4～5 min，60%。流速：0.55 mL·min－1，柱溫：40℃。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI 正離子檢測模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描。各成分選用的離子對和DP、CE 電壓如下：

MPA：m/z321.0 →303.2，75 V 和15 V；MPAG：m/z514.0 →303.3，30 V 和18 V；AcMPAG：m/z514.0 →207.0，30 V 和50 V；內(nèi)標(biāo)MPA-d3：m/z324.1 →306.0，110 V 和15 V。

2.3 對照品儲備液的配制

取MPA 5 mg、MPAG 2.5 mg、AcMPAG 0.5 mg，加入適量甲醇溶解，配制成MPA、MPAG 及AcMPAG 質(zhì)量濃度分別為5、5、0.5 mg·mL－1的對照品儲備液。分別取對照品儲備液適量，混合配制成MPA、MPAG 及AcMPAG 質(zhì)量濃度分別為0.5、2、0.4 mg·mL－1混合對照品儲備液。

2.4 血漿樣品處理

取血漿50 μL，加入5 μL 內(nèi)標(biāo)MPA-d3（10 μg·mL－1），再加入200 μL 甲醇-乙腈溶液（9∶1），渦旋震蕩3 min，16 400 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL，加入50%甲醇溶液180 μL，渦旋30 s，16 400 r·min－1離心10 min，取上清液100 μL 進樣。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 專屬性 取6 份不同來源的人空白血漿、加入對照品儲備液的人血漿樣品、用藥后的血漿樣品按照“2.4”項下方法處理分析。結(jié)果MPA、MPAG、AcMPAG 和內(nèi)標(biāo)（MPA-d3）的保留時間分別為2.8、2.39、2.58 和2.79 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)在待測物保留時間內(nèi)無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 血漿中MPA、MPAG、AcMPAG 和內(nèi)標(biāo)MPA-d3 的LC-MS/MS 色譜圖Fig 2 LC-MS/MS chromatogram of MPA，MPAG，AcMPA and MPA-d3 in the plasma

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限 精密量取混合對照品儲備液適量，加甲醇稀釋成含MPA（2、4、10、25、50、100、250、500 μg·mL－1），MPAG（10、20、50、125、250、500、1250、2500 μg·mL－1），AcMPAG（0.8、1.6、4、10、20、40、100、200 μg·mL－1）的混合工作溶液。取混合工作液5 μL，加入空白血漿45 μL，制備標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按“2.4”項下方法處理。以待測物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比Y為縱坐標(biāo)，待測物質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，以加權(quán)（W＝1/χ2）最小二乘法進行線性回歸運算，結(jié)果MPA 標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y＝3.754X＋0.3733（r＝0.9926）；MPAG標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y＝0.4653X＋0.1271（r＝0.9941）；AcMPAG 標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y＝0.2891X＋4.441×10－4（r＝0.9942）；MPA、MPAG、AcMPAG 的定量限分別為0.2、1、0.08 μg·mL－1。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度 取混合對照品儲備液，配制成含MPA（5、80、400 μg·mL－1）、MPAG（25、400、2000 μg·mL－1）和AcMPAG（2、32、160 μg·mL－1）的低、中、高濃度的質(zhì)控工作液。取混合質(zhì)控工作液5 μL，加入空白血漿45 μL，按“2.4”項下方法處理，每個濃度取6 份，在2周內(nèi)測定3 次。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算日內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

表1 MPA、MPAG、AcMPAG 的準(zhǔn)確度及精密度(n ＝6)Tab 1 Accuracy and precision of MPA，MPAG and AcMPAG (n ＝6)

2.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取“2.5.3”項下3個濃度的質(zhì)控QC 工作液，進樣測得待測物峰面積比值A(chǔ)1。取空白血漿進行預(yù)處理后的上清液，加入低、中、高濃度的混合質(zhì)控樣品（包括內(nèi)標(biāo)），每個濃度6 份，測得待測物峰面積比值A(chǔ)2。峰面積比A1/A2可求得3 種濃度待測物的提取回收率。取不同人空白血漿6 份，加入低，中，高濃度質(zhì)控樣品溶液，每個濃度6 個待測樣品，按“2.4”項下方法處理，測得待測物峰面積比值A(chǔ)3，基質(zhì)效應(yīng)為A2/A3，結(jié)果MPA、MPAG 和AcMPAG 的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)RSD均符合方法學(xué)要求。

2.5.5 穩(wěn)定性 考察了室溫穩(wěn)定性，4℃穩(wěn)定性，凍融穩(wěn)定性及進樣器穩(wěn)定性。取“2.5.3”項下3個濃度的質(zhì)控工作液各5 μL，每個濃度6 份，加入人空白血漿，分別在室溫下放置6 h；在4℃下放置24 h；在－80℃，反復(fù)凍融3 次，按“2.4”項下方法處理后進樣測定，結(jié)果MPA、MPAG 和AcMPAG 質(zhì)量濃度的RSD均在±15%范圍內(nèi)，表明MPA 及其代謝物在本實驗條件下穩(wěn)定。

2.6 藥動學(xué)研究

7 例腎移植患者，術(shù)后免疫抑制劑方案均采用他克莫司（FK506）＋霉酚酸酯（MMF）＋糖皮質(zhì)激素三聯(lián)用藥。MMF 在腎移植術(shù)前12 h 內(nèi)開始口服1000 mg bid；術(shù)中及術(shù)后1 d 靜脈滴注甲基強的松龍500 mg·d－1，術(shù)后第2日或者第3日減為250 mg·d－1，后口服潑尼松片40 mg/（kg·d），逐漸減量至10～20 mg/（kg·d），他克莫司劑量為0.07～0.15 mg/（kg·d）bid。于本方案治療1 周后，于末次給藥后0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 采集血漿樣本測定MPA、MPAG 和AcMPAG 濃度。用WinNonlin 軟件的非房室模型進行擬合求算Cmax、tmax、t1/2、AUC及平均駐留時間（MRT）等藥動學(xué)參數(shù)。實驗數(shù)據(jù)以mean±SD 表示，結(jié)果見表2及圖3。

表2 7 例腎移植患者服用霉酚酸酯后MPA 和代謝物的藥動學(xué)參數(shù)Tab 2 Pharmacokinetic parameters of MPA and metabolites after the oral administration of MMP in 7 renal transplant patients

圖3 腎移植患者口服霉酚酸酯后MPA、MPAG、AcMPAG 的血藥濃度-時間曲線Fig 3 Mean plasma concentrations-time curve of MPA，MPAG and AcMPAG in renal transplantation patients after the oral administration of MMP

3 討論

目前臨床上應(yīng)用的MPA 類藥物主要有霉酚酸酯（MMF）腸溶片和霉酚酸鈉腸溶片（ECMPS）[5]，MMF 是無活性的前體藥物，口服后經(jīng)胃腸道吸收，水解生成活性代謝產(chǎn)物MPA。霉酚酸類藥物具有非線性藥動學(xué)特征，在不同患者體內(nèi)藥動學(xué)差異較大，需要通過血藥濃度監(jiān)測調(diào)整給藥劑量。MPA 的血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）的理想范圍在30～60 μg·h·mL－1，大于60 μg·h·mL－1時易發(fā)生胃腸道、骨髓抑制等相關(guān)不良反應(yīng)，而小于30 μg·h·mL－1時發(fā)生急性排斥反應(yīng)的風(fēng)險增加[6]。研究表明代謝物MPAG 會影響MPA 的藥動學(xué)特征，AcMPAG可能與MPA 的毒副作用有關(guān)[7-8]。MPAG 會與MPA 競爭蛋白結(jié)合影響MPA 的游離濃度。AcMPAG 可能通過抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、白細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放表現(xiàn)出生物活性，服用MMF 后引起的白細(xì)胞減少和胃腸道功能紊亂可能與 AcMPAG 相關(guān)[9]。因此對MPA及其代謝物的檢測具有一定的臨床意義。

目前國內(nèi)外測定MPA 及其代謝物的方法主要有HPLC 法、LC-UV 法以及酶放大免疫法（EMIT）[10]。免疫法方便快捷，但是特異性不強，測定MPA 及其代謝物時，會與AcMPAG 發(fā)生交叉反應(yīng)使MPA 濃度偏高。HPLC 法具有較高的靈敏度和特異性，是測定MPA 及其代謝物的一種標(biāo)準(zhǔn)方法，但檢測過程耗時較長。本實驗選擇LC-MS/MS 測定MPA 及其代謝物濃度，相較于HPLC 和EMIT 法，LC-MS/MS 法不需要使用昂貴的抗體，可以縮短測定時間，樣本處理方法簡單，同時具有更好的特異性和靈敏度。

在方法優(yōu)化過程中嘗試了多種流動相，包括水-甲醇、 水-乙腈、 水（0.01%甲酸，10 mmol·L－1乙酸銨）-甲醇（0.01%甲酸）、水（0.1%甲酸，5 mmol·L－1乙酸銨）-甲醇（0.1%甲酸），最終選擇流動相A：水（0.1%甲酸，10 mmol·L－1乙酸銨），流動相B：甲醇（0.1%甲酸），通過加入甲酸和乙酸銨使得MPA 及其代謝物的色譜峰形和響應(yīng)值得到改善。對于洗脫方式，嘗試了等度洗脫與梯度洗脫，相對等度洗脫，梯度洗脫有更好的峰形以及分離度。通過調(diào)整初始有機相比例得到了較為合適的保留時間，避免與雜質(zhì)共同洗脫從而減少了基質(zhì)效應(yīng)的干擾。筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大部分研究對于MPA、MPAG 和AcMPAG 母離子的選擇都是[M-H]－離子[11-14]，而在質(zhì)譜條件摸索時發(fā)現(xiàn)MPA 的[M ＋H]＋離子，MPAG 和AcMPAG 的[M ＋NH4]＋離子也有很好的響應(yīng)，能夠滿足MPA 血藥濃度測定的需要。MPAG 和AcMPAG 都是霉酚酸的葡萄糖醛酸化代謝物，互為同分異構(gòu)體具有相同的分子量，劉曉雪等[11]建立的肝移植患者血漿MPA及其代謝物的LC-MS/MS 檢測方法中MPAG 和AcMPAG 共用同一個離子對，筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)了兩種代謝物的不同的離子對，每個代謝物在各自的離子對下都具有較高的響應(yīng)，可以更好地對MPAG 和AcMPAG 進行定性和定量。對于內(nèi)標(biāo)的選擇，本實驗選擇穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)MPA-d3，相對于吲哚美辛內(nèi)標(biāo)[11]，MPA-d3 的理化性質(zhì)與待測物最相近，表現(xiàn)為相似的回收率、離子化效率和色譜保留行為，并且無內(nèi)源性干擾，受到基質(zhì)效應(yīng)的干擾更小。