曹丹，趙崇軍，王海燕，衛(wèi)博文，蔣楊雨，林瑞超*，李健*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京0488；.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 0488）

地菍別稱(chēng)地稔、地茄子、地葡萄、鋪地錦等，為野牡丹科野牡丹屬植物地菍?zhuān)∕elastoma dodecandrumLour.）的干燥全草。民間使用廣泛，為畬族常用藥材，畬民多稱(chēng)嘎狗?；蚣S桶板[1]。地稔具有清熱化濕、祛瘀止痛、收斂止血之功效。現(xiàn)代藥理研究表明，地菍提取物有鎮(zhèn)痛消炎、降血糖、調(diào)血脂、止血、抗氧化、抗肝炎等作用[2-4]。地菍含有多種化學(xué)成分，主要有黃酮類(lèi)、甾體類(lèi)、萜類(lèi)、鞣質(zhì)、多糖類(lèi)、有機(jī)酸等化合物[5]。然而，目前關(guān)于地菍有效成分的深入研究相對(duì)較少，因此，針對(duì)地菍建立快速的分析方法，對(duì)于地菍藥理活性物質(zhì)的深入研究及開(kāi)發(fā)利用具有重要參考價(jià)值。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS）具有高分辨率、高靈敏度和高分離度等優(yōu)點(diǎn)，可在缺少對(duì)照品的情況下對(duì)復(fù)雜中藥成分進(jìn)行定性分析，近年來(lái)已迅速成為中藥材成分分析領(lǐng)域的重要研究方法[6]。本文采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)結(jié)合UNIFI 天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)地菍提取物中小分子成分進(jìn)行快速、全面的分析，為進(jìn)一步提升地菍藥材的質(zhì)量控制和闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、Q-TOF MS 串聯(lián)飛行時(shí)間四級(jí)桿質(zhì)譜儀（Waters 公司），BT224S 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器）。

1.2 試藥

地菍?zhuān)ú勺愿＝ǎ?hào)：20140421，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉春生教授鑒定野牡丹科植物Melastoma dodecandrumLour.的干燥全草）。乙腈（色譜純，F(xiàn)isher），甲酸（分析純，北京化工廠），亮氨酸-腦啡肽（對(duì)照品，Sigma 公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）～0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～1 min，2%A；1～10 min，2%～30%A；10～12 min，30%～100%A；12～13 min，100%A；13～13.5 min，2%A；13.5～15 min，2%A），柱溫：40℃；流速：0.4 mL·min－1；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；毛細(xì)管電壓：正離子模式3.0 kV，負(fù)離子模式2.5 kV；錐孔電壓：40 V；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；錐孔氣：150 L·h－1；脫溶劑氣：800 L·h－1；實(shí)時(shí)校正標(biāo)準(zhǔn)物：亮氨酸腦啡肽（[M ＋H]＋＝556.2771，[M-H]－＝554.2615）。

2.3 供試品溶液的制備

取地菍粉末（過(guò)60 目篩）4.0 g，精密稱(chēng)定，置250 mL 圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流提取3 h，放冷至室溫，再稱(chēng)定質(zhì)量，用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取5 mL 置10 mL 量瓶中，加蒸餾水至刻度，13 000 r·min－1離心5 min，上清液即為供試品溶液。

2.4 數(shù)據(jù)處理及譜庫(kù)檢索方法

采用UNIFI 軟件對(duì)正、負(fù)離子模式下地菍提取液LC-MS/MS 的Raw data（MSe 采集模式，含全部一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜峰信息）進(jìn)行分析，結(jié)合已報(bào)道的化學(xué)成分建立地菍成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，檢索Waters UNIFI 軟件中天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)，UNIFI 軟件通過(guò)母離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素峰度模型、子離子精確質(zhì)量數(shù)等參數(shù)自動(dòng)匹配中藥數(shù)據(jù)庫(kù)里已有化合物，誤差小于5 ppm，至少匹配上1 個(gè)子離子，且一級(jí)質(zhì)譜響應(yīng)值大于10 000 篩選鑒定結(jié)果，軟件自動(dòng)產(chǎn)生提取離子流圖、一級(jí)質(zhì)譜匹配結(jié)果和二級(jí)碎片匹配結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS 分析地菍提取液總離子流圖

采用UPLC-Q-TOF/MS 對(duì)地菍提取液的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，得到地菍提取液（＋）ESIMS 和（－）ESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖（見(jiàn)圖1）。

圖1 正（A）、負(fù)（B）離子模式下地菍提取液總離子流圖Fig 1 Total ion chromatogram of Melastoma dodecandrum Lour.extraction in positive（A）and negative（B）ion mode

3.2 地菍化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)查閱文獻(xiàn)[7-25]、使用UNIFI 軟件對(duì)正、負(fù)離子模式下地菍提取液LC-MS/MS 的Raw data（MSe 采集模式）進(jìn)行分析，檢索Waters UNIFI 軟件中天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合文獻(xiàn)資料、Chemspider等數(shù)據(jù)庫(kù)以及質(zhì)譜裂解規(guī)律等，推斷可能的化學(xué)成分及其裂解過(guò)程，對(duì)地菍的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類(lèi)，并對(duì)主要碎片離子信息進(jìn)行歸屬，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 地菍化學(xué)成分鑒定結(jié)果Tab 1 Identification of chemical constituents of Melastoma dodecandrum Lour.

3.2.1 黃酮類(lèi)成分裂解規(guī)律分析 黃酮類(lèi)化合物在MS/MS 正離子模式下，易得到[M ＋H]＋的分子離子峰。黃酮苷會(huì)失去糖基產(chǎn)生[M ＋H-glc]＋的特征性苷元碎片離子，游離的黃酮苷元主要有兩種裂解方式，方式Ⅰ：苷元C 環(huán)的逆-狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（RDA）裂解產(chǎn)生m/z153 和m/z134的碎片離子；方式Ⅱ：苷元還可以裂解產(chǎn)生m/z137 和m/z109 質(zhì)譜碎片信息。以木犀草素-7-O-葡萄糖苷為例，對(duì)黃酮類(lèi)化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行探討，木犀草素-7-O-葡萄糖苷可能的裂解途徑如圖2所示，與文獻(xiàn)[7]木犀草素-7-O-葡萄糖苷對(duì)照品碎片一致，推測(cè)峰13 為木犀草素-7-O-葡萄糖苷。

圖2 木犀草素-7-O-葡萄糖苷裂解途徑Fig 2 Fragmentation pathway of luteolin-7-O-glucoside

峰6、11、15～20、22～25 為黃酮或黃酮醇類(lèi)化合物，正/負(fù)離子模式下，分子離子峰m/z依次是611.1594 [M ＋H]＋，595.1277 [M ＋H]＋，447.0923 [M ＋H]＋，449.1071 [M ＋H]＋，617.1133 [M ＋H]＋，609.1445[M-H]－，465.1036[M ＋H]＋，433.1133 [M ＋H]＋，433.1135 [M ＋H]＋，465.1021 [M ＋H]＋，595.1657 [M ＋H]＋，287.0549 [M ＋H]＋，黃酮苷失去糖基后，形成的黃酮苷元易產(chǎn)生正離子模式m/z153，負(fù)離子模式m/z151 及m/z109 的特征碎片，結(jié)合文獻(xiàn)[7-14]，推測(cè)峰6、11、15～20、22～25 依次為nelumboroside A、山柰酚-3-O-鼠李糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（峰13 的同分異構(gòu)體）、desmanthin-1、蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、牡荊素、異牡荊素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（峰19 的同分異構(gòu)體）、山柰酚-3-O-刺槐二糖苷和山柰酚。

峰7 的分子離子峰為m/z593.1293 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生m/z305.0661 [M-H-C15H13O6]－，m/z287.0543 [M-H-C23H21O8]－，m/z153.0188 [C7H5O4]－等特征峰，查閱文獻(xiàn)[15]，推測(cè)其為表沒(méi)食子兒茶素（4，8）-沒(méi)食子兒茶素。峰10 的分子離子峰為m/z457.0772 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生m/z169.0141 [C7H6O5]－的特征峰，查閱文獻(xiàn)[16]，推測(cè)其為表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸酯。

3.2.2 鞣質(zhì)類(lèi)成分裂解規(guī)律分析 鞣質(zhì)是由沒(méi)食子酸葡萄糖（多元醇）酯或其衍生物聚合物組成的多元酚。其MS/MS 易失去H2O、CO2、CO和glc 等碎片峰，通過(guò)失去六羥基聯(lián)苯二甲?；℉HDP，m/z301），沒(méi)食子?；?galloyl，m/z152）而發(fā)生裂解，HHDP 和沒(méi)食子酸（m/z169）也是鞣質(zhì)的特征碎片。以casuarinin 為例，推測(cè)鞣質(zhì)類(lèi)化合物可能的裂解途徑（見(jiàn)圖3），峰12在負(fù)離子模式下，其分子離子峰為m/z935.0798[M-H]－，失去一分子H2O 產(chǎn)生碎片離子917.0691[M-H-H2O]－，失去一分子HHDP 產(chǎn)生633.0734[M-H-HHDP]－的碎片離子，失去一分子沒(méi)食子?；a(chǎn)生153.0179 [-galloyl]－的碎片，查閱文獻(xiàn)[10]，推測(cè)其為casuarinin。

圖3 Casuarinin 的裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of casuarinin

峰4 的分子離子峰為m/z783.0686 [M-H]－，失去一分子H2O 產(chǎn)生碎片離子765.0578 [M-HH2O]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生481.0631 [M-H-HHDP]－和沒(méi)食子酸169.0140 [C7H5O5]－的碎片離子，查閱文獻(xiàn)[17]，推測(cè)其為英國(guó)櫟鞣花酸。峰5 的分子離子峰為m/z783.0688 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生603.0636 [M-H-C8H5O5]－，481.0621 [M-HHHDP]－，300.9989 [HHDP]－的碎片離子，查閱文獻(xiàn)[18]，推測(cè)其為二逆沒(méi)食子?；咸烟?。峰9 的分子離子峰為m/z933.0716 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生915.0691 [M-H-H2O]－，783.0684 [M-Hgalloyl]－，631.0738 [M-H-HHDP]－的碎片離子，查閱文獻(xiàn)[19]，推測(cè)其為栗木鞣花素。峰14 的分子離子峰為m/z937.0924 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生785.0745 [M-H-galloyl]－，300.9987 [HHDP]－查閱文獻(xiàn)[20]，推測(cè)其為tellimagrandin Ⅱ。峰21的分子離子峰為m/z951.0896 [M-H]－，失去1 分子H2O 產(chǎn)生933.0637 [M-H-H2O]－， 結(jié)合300.9992 [HHDP]－和169.0142 [C7H5O5]－的特征碎片，查閱文獻(xiàn)[21]，推測(cè)其為老鸛草素。

3.2.3 有機(jī)酸和其他成分裂解途徑推測(cè) 峰2 的分子離子峰為m/z331.0671 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn) 生211.0250 [M-H-C4H9O4]－，169.0142 [M-Hglc]－等特征峰（見(jiàn)圖4），查閱文獻(xiàn)[10]，推測(cè)其為單沒(méi)食子酰葡萄糖。

圖4 單沒(méi)食子酰葡萄糖的裂解途徑Fig 4 Fragmentation pathway of galloylglucose

峰3 的分子離子峰為m/z169.0134 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生125.0235 [M-CO2]－特征峰，查閱文獻(xiàn)[10]，推測(cè)其為沒(méi)食子酸。峰8 的分子離子峰為m/z355.0304 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生169.0141[M-H-C7H6O6]－特征峰，查閱文獻(xiàn)[22]，推測(cè)其為訶子次酸。峰26的分子離子峰為m/z717.1457 [MH]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生519.0924 [M-H-C9H11O5]－，321.0403[M-H-C18H21O10]－，161.0246[M-HC27H25O13]－等特征峰，查閱文獻(xiàn)[23]，推測(cè)其為丹酚酸B。

峰27 的分子離子峰為m/z453.3353 [M ＋H]＋，二級(jí)掃描產(chǎn)生261.1840 [M ＋H-C13H19O]＋，219.1744 [M ＋H-C15H21O2]＋等碎片離子，查閱文獻(xiàn)[24]，推測(cè)其為靈芝酸S。峰28 的分子離子峰為m/z517.3173 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生485.3381[M-H-OH-CH3]－，471.3114 [M-H-COOH]－，171.1023 [C9H15O3]－等特征峰，查閱文獻(xiàn)[25]，推測(cè)其為2-羥基商陸酸。

峰1 的分子離子峰為m/z665.2199 [M-H]－，二級(jí)掃描產(chǎn)生647.2039 [M-H-H2O]－，485.1512[M-H-rha]－，179.0558 [C6H11O6]－等特征峰，查閱文獻(xiàn)[26]，推測(cè)其為水蘇糖。

4 討論

目前，關(guān)于地菍的化學(xué)成分研究較少，查閱已報(bào)道的文獻(xiàn)[5]，僅分離純化得到78 個(gè)化合物。為進(jìn)一步分析地菍中的化學(xué)成分，本課題組前期已分析鑒定出地菍中109 種物質(zhì)[10]，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)本次試驗(yàn)中有6 個(gè)成分（沒(méi)食子酸、單沒(méi)食子酰葡萄糖、牡荊素、蘆丁、casuarinin 和山柰酚）與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致。本文采用了與之不同的提取方式，提取的化合物多以極性成分（鞣質(zhì)、黃酮苷、酚酸等）為主，既對(duì)已分離得到的地菍中化合物進(jìn)行了驗(yàn)證，又補(bǔ)充和豐富了地菍中的化學(xué)成分，為完善地菍藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

比較正、負(fù)離子模式下的地菍提取液總離子流圖發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物的一級(jí)質(zhì)譜中正離子模式下的響應(yīng)優(yōu)于負(fù)離子，且正離子模式下其MS/MS 碎片更為穩(wěn)定、更具有特征性，因此，選擇正離子模式下對(duì)黃酮類(lèi)進(jìn)行分析；鞣質(zhì)和酚酸類(lèi)物質(zhì)在一級(jí)質(zhì)譜中負(fù)離子模式下的響應(yīng)優(yōu)于正離子，在負(fù)離子模式下碎片較為豐富，特征碎片強(qiáng)度較高，因此，選擇在負(fù)離子模式下對(duì)鞣質(zhì)和酚酸類(lèi)進(jìn)行分析，故本文同時(shí)選擇正、負(fù)離子模式對(duì)地菍的化學(xué)成分進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)， 通過(guò)檢索Waters UNIFI 軟件中天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)、Chemspider 數(shù)據(jù)庫(kù)等，結(jié)合文獻(xiàn)資料以及質(zhì)譜裂解規(guī)律，初步鑒定出28 個(gè)化學(xué)成分，包括15 個(gè)黃酮、6 個(gè)鞣質(zhì)、4 個(gè)酚酸、2 個(gè)三萜和1 個(gè)寡糖，其中16 種成分為首次在地菍中發(fā)現(xiàn)。由于天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)質(zhì)譜信息有限和質(zhì)譜無(wú)法鑒定同分異構(gòu)體，本研究尚有含量較高成分未指認(rèn)，需進(jìn)一步分離鑒定，增加對(duì)照品進(jìn)行驗(yàn)證，也為未來(lái)繼續(xù)研究地菍中新成分提供了方向。