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        鹽酸小檗堿多晶型的制備、表征及其對自制片劑溶出行為的影響

        2021-10-09 08:15:42閆富龍祝宇龍彭燦安徽中醫(yī)藥大學藥學院合肥23002藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室合肥23002中藥復方安徽省重點實驗室合肥23002安徽省中醫(yī)藥科學院藥物制劑研究所合肥23002
        中南藥學 2021年9期

        閆富龍,祝宇龍,彭燦,2,3,4*(.安徽中醫(yī)藥大學藥學院,合肥 23002;2.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室,合肥 23002;3.中藥復方安徽省重點實驗室,合肥 23002;4.安徽省中醫(yī)藥科學院藥物制劑研究所,合肥 23002)

        近年來,隨著對藥物研究的深入,研究者發(fā)現(xiàn)在藥物的藥物成分、手性、結構、純度等因素固定時,藥物在質量和療效上仍然存在著不穩(wěn)定現(xiàn)象。經大量實驗后發(fā)現(xiàn)了多晶型這一重要影響因素[1]。多晶型現(xiàn)象是指固體藥物在結晶過程中因為條件的差異,分子在晶胞中對稱規(guī)律的不同,使得藥物分子之間、藥物分子與溶劑分子之間相互作用力或結合方式以及空間結構等發(fā)生變化,從而使藥物晶體出現(xiàn)兩種或兩種以上的空間群和晶胞參數[2-4]。不同的晶型具有不同的機械學、熱力學、物理學和化學特性,尤其是對難溶性藥物來說,不同晶型的轉變會影響其在體內的溶解和吸收,進而影響藥物的生物利用度、療效,甚至產生不良反應,影響用藥安全[5-7]。我國是一個仿制藥大國,并且仿制企業(yè)繁多,同一品種可能被多家企業(yè)仿制,而藥物的多晶型會直接影響藥品的有效性、安全性和質量[8]。因此,固體藥物多晶型的研究對藥物的開發(fā)上市至關重要。

        鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride)是一種天然異喹啉類生物堿,又稱為黃連素,主要來源于黃連、黃柏、三顆針等小檗科等4 科10 屬藥用植物[9-11]。目前鹽酸小檗堿可以由植物提取和人工合成兩種途徑獲得[12],在臨床上常用于治療細菌性瘧疾、腸胃炎等疾病[13-14],效果顯著?,F(xiàn)代藥理學研究證明,其還有降血脂[15]、降血糖[16]、抗腫瘤[17-19]和抗心律失常[20]等藥理作用,具有廣泛的應用前景。

        目前國內外對于鹽酸小檗堿片劑的研究,大部分集中于質檢分析、含量測定以及輔料對鹽酸小檗堿溶出度的影響等方面,而對其晶型的研究很少[21-23]。羅小飛等[24]發(fā)現(xiàn)不同溶劑中析出的鹽酸小檗堿溶解度不同,經X 衍射分析發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿也存在多種晶型現(xiàn)象。晶型研究對于鹽酸小檗堿藥效發(fā)揮尤為重要,本文應用單一溶劑重結晶法制備鹽酸小檗堿不同晶型,比較不同晶型自制片在不同溶出介質中的溶出行為,為改善鹽酸小檗堿溶出與藥物臨床應用提供科學依據。

        1 材料

        1.1 試藥

        鹽酸小檗堿對照品(含量:86.8%,批號:160901,中國食品藥品檢定研究院);甲醇(北京百靈威科技有限公司);冰醋酸、鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司);磷酸鹽(天津市福晨試劑公司);三乙胺(批號:20191130,上海潤捷化學試劑有限公司);蒸餾水。淀粉(批號:S116028)、羧甲基淀粉鈉(CMS-Na,批號:C105666,阿拉丁有限公司);聚維酮 K30(PVP K30,批號:190506,安徽山河藥用輔料股份有限公司);聚山梨酯 80(薩恩化學技術有限公司),硬脂酸鎂(遼寧奧達制藥有限公司)。所有輔料均為藥用級輔料。

        1.2 儀器

        SmartLab3KW X-射線衍射儀(日本理學公司);S-3700N 掃描電子顯微鏡(日本島津公司);Spectrum 400 紅外光譜儀(英國PE 公司);Mettler TGA/DSC1 熱分析儀(瑞士梅特勒公司);高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司);超聲波清洗機(YL060S,濟南巴克超聲波科技有限公司);超純水機(milli-Q Synt hesis,millipore);十萬分之一電子天平(BT25S,墨多利斯科學儀器有限公司);循環(huán)水式真空泵;溶出試驗儀(ZRS-8L,天津天大天發(fā)科技有限公司);ZP29 旋轉式壓片機(上海天峰);YD-1 片劑硬度測試儀(天津市國銘醫(yī)藥設備有限公司)。

        2 方法與結果

        2.1 晶型樣品制備

        本研究采用單一溶劑重結晶法制備鹽酸小檗堿晶型樣品,鹽酸小檗堿原料藥晶型設為晶A 型,其他新制備得到的晶型依次命名為晶B 型至晶F 型。取鹽酸小檗堿原料藥300 mg 于潔凈容器中,少量多次加入總量為40 mL 的醋酸溶液、或100 mL 的乙酸乙酯溶液、或總量為25 mL 的二氯甲烷溶液、或總量為80 mL 的乙腈溶液、或總量為100 mL 的丙酮溶液,加熱,體系溫度均為20~100℃,磁力攪拌(速度控制在500~1200 r·min-1),反應1~5 h,使其完全溶解,得到黃色澄清溶液。溶液趁熱過濾,濾液置于40~60℃真空干燥環(huán)境下?lián)]發(fā)結晶,獲得淡黃色粉末分別為鹽酸小檗堿晶B型、鹽酸小檗堿晶C 型、鹽酸小檗堿晶D 型、鹽酸小檗堿晶E 型、鹽酸小檗堿晶F 型。

        2.2 鹽酸小檗堿不同晶型表征分析

        2.2.1 晶體粉末掃描電子顯微鏡法 使用碳雙面膠帶將樣品固定在黃銅樁上。然后設置電壓為15 kV,電流為119 μA,拍攝不同晶型粉末微觀照片。

        如圖1所示,5 種不同晶型的鹽酸小檗堿粉末呈現(xiàn)不同的微觀形狀。晶B 型和晶F 型呈現(xiàn)兩端漸變鋒利趨勢的針狀,晶F 型呈現(xiàn)相比于普通針狀更加狹長纖細的狹長針狀;晶E 型為不規(guī)則塊狀晶型,晶體兩端邊緣無明顯漸變鋒利趨勢,比較光滑;晶C 型為較為明顯的柱狀晶型,比表面積較大;晶D 型呈現(xiàn)為片狀晶體,與晶C 型柱狀晶型較為相似,但側面可以看出特別薄,其比表面積比柱狀小。

        圖1 鹽酸小檗堿晶5 種晶型的掃描電子顯微鏡圖Fig 1 SEM image of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

        2.2.2 差示掃描量熱法(DSC) 精密稱取不同晶型鹽酸小檗堿粉末樣品5~10 mg,置于40 μL 標準Al2O3坩堝中,鋪勻后壓蓋,放入差示掃描量熱儀中,以40 μL 標準Al2O3空坩堝為參比,在溫度范圍0~240℃,升溫速率10 ℃·min-1的條件下進行分析,記錄DSC 曲線。

        如圖2所示,樣品在二次升溫過程中無特征吸收峰,經觀察樣品升溫到240℃和300℃時均已完全碳化,所以185℃左右為鹽酸小檗堿粉末的熔點溫度,與相關文獻記載的190℃相符。除熔點吸收峰外,晶B 型和晶C 型DSC 圖譜中只存在100℃左右的吸收峰,說明該晶型鹽酸小檗堿粉末中只存在游離水;晶B 型和晶C 型DSC 圖譜中只存在150℃左右的吸收峰,說明該晶型鹽酸小檗堿粉末中只存在結合水;晶F 型在圖譜上存在100℃左右和150℃左右兩個特征吸收峰,說明多晶型鹽酸小檗堿粉末中存在游離水和結晶水。由于制備的鹽酸小檗堿粉末在實驗前已干燥5 h,說明該晶型粉末具有較強的吸濕性。

        圖2 鹽酸小檗堿5 種晶型的DSC 圖譜Fig 2 DSC spectrum of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

        2.2.3 傅里葉變換紅外光譜法 壓力作用因素可能會導致藥物晶型發(fā)生改變,本實驗采用衰減全反射法(ATR)紅外光譜法,藥物粉末直接進樣。光譜范圍:6000~650 cm-1,分辨率:4.00 cm-1,掃描次數:16 次。

        采用紅外光譜法對5 種晶型鹽酸小檗堿樣品進行表征,其紅外吸收光譜如圖3所示。5 種晶型在3649、3324、3047、2162、1505、1140、1109、1066、1018 cm-1等處均具有紅外光譜特征峰,其中紅外光譜特征峰的允許偏差為±2 cm-1。比較鹽酸小檗堿不同晶型樣品紅外吸收峰發(fā)現(xiàn),晶C型、晶D 型、晶E 型和晶F 型在3549 cm-1處無明顯吸收峰,表明可能發(fā)生了開環(huán)反應;晶B 型和晶C 型在1705 cm-1處存在吸收峰,表明存在羧基,可能來源于醋酸的羧基或乙酸乙酯的酯基。

        圖3 鹽酸小檗堿5 種晶型的紅外圖譜Fig 3 Infrared spectrum of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

        2.2.4 X 射線粉末衍射法 稱取一定量的5 種晶型樣品,進行粉末X 射線衍射檢測。檢測條件:使用CuKα輻射在40 mA 和40 kV 下運行,并在衍射束上配備石墨單色儀,以收集X 射線衍射圖案;在3°≤2θ≤80°的范圍內以步長0.01°記錄XRD 圖案,每步至少采集1000 個計數。平均晶體尺寸通過Scherrer 方程估算,其中積分寬度已針對儀器加寬進行了校正。儀器輪廓加寬源自對標準樣品獲得的XRD 數據的擬合。

        結果如圖4所示,鹽酸小檗堿5 種晶型在X射線粉末衍射圖譜上均有一定的差異。晶B 型鹽酸小檗堿在2θ=8.92 處出現(xiàn)了強衍射峰,且強度較高,并在2θ=47.3 處出現(xiàn)了為其他晶型所不具有的散射峰。晶C 型鹽酸小檗堿在2θ在8~10范圍內出現(xiàn)了雙強峰,晶D 型鹽酸小檗堿粉末在2θ為25.4、26.3 時無明顯散射峰,而在2θ為16.9、17.7 時處存在散射峰,表明晶D 型可能發(fā)生了鍵位變化或晶型變化。晶E 型鹽酸小檗堿在為2θ為10.1、11.3、11.8 處存在散射,說明晶E 型與其他晶型晶相不同,而晶F 型鹽酸小檗堿13.0~15.0內沒有出現(xiàn)衍射峰這與其他晶型不相同。X 射線衍射結果說明5 種鹽酸小檗堿晶型各不相同。粉末X 射線衍射分析法可用于不用晶型物質鑒別,是鹽酸小檗堿晶型鑒定的有效分析方法。

        2.3 鹽酸小檗堿片劑制備

        本實驗采用濕法制粒法,先將5 g 不同晶型鹽酸小檗堿粉末過100 目篩,置于研缽中,分別加入2.2 g 淀粉和3.55 g 含有聚山梨酯80 的80%乙醇溶液,充分攪拌均勻之后,制軟材,過80目篩,放置托盤中,105℃下干燥2 h,最后加入70 mg 羧甲基淀粉鈉和50 mg 硬脂酸鎂,混勻,隨之壓片(鹽酸小檗堿自制片規(guī)格為0.1 g/片)。然后對鹽酸小檗堿自制片進行了片劑質量檢查,包括片劑外觀、片重差異和片劑硬度等檢查。

        從5 種晶型鹽酸小檗堿自制片中各隨機選擇6 片進行觀察,外觀檢查結果如表1所示。片劑表面略有黑點出現(xiàn),經過分析,確定黑點是由輔料顏色加深造成的,這對片劑質量沒有影響。由于晶E 型粉末在壓縮時容易折斷,難以制成片劑,可能與晶E 型的不規(guī)則塊狀有關。所以后續(xù)研究中,晶E 型將不再納入研究范圍。從4 種晶型鹽酸小檗堿自制片中各隨機選擇20 片進行準確稱重,計算差異。鹽酸小檗堿粉末自制片片重差異見表2,差異范圍在90%~120%,符合藥典標準。從4 種晶型鹽酸小檗堿自制片中各隨機選擇6 片,用片劑硬度計測定片劑硬度,結果如表3所示,各片劑平均硬度在30~60 N,符合片劑標準。綜合所上,晶E 型鹽酸小檗堿粉末不符合壓片要求,其他4 種晶型粉末所制片劑均符合標準。

        表1 5 種晶型鹽酸小檗堿自制片劑外觀檢查(n =6)Tab 1 Appearance of 5 crystal forms of berberine hydrochloride tablets (n =6)

        表2 4 種晶型鹽酸小檗堿自制片片重差異(n =6)Tab 2 Weight of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets(n =6)

        表3 4 種晶型鹽酸小檗堿自制片硬度測試(n =6)Tab 3 Hardness test of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets (n =6)

        2.4 高效液相法測定溶出度

        采用HPLC 系統(tǒng),色譜柱為Unitary C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫為36 ℃。流動相為0.2%三乙胺的0.02 mol·L-1磷酸溶液-乙腈(65∶35,V/V),以1.0 mL·min-1的流速進行洗脫。檢測波長為346 nm,進樣量為10 μL。

        取鹽酸小檗堿對照品用甲醇溶液稀釋至1 mg·mL-1作為對照品儲備液在4 ℃下保存。取對照品儲備液逐級稀釋(5~100 μg·mL-1)后測定,以峰面積(Y)對質量濃度(X)建立標準曲線,Y=44.03X+9.982,R2=0.999。

        同時,基于課題組前期的研究[25],考察所建立HPLC 方法的方法學,包括特異性、線性、精密度、準確度、重復性和加樣回收率,結果均符合要求。

        2.5 藥物溶出度實驗

        分別取鹽酸小檗堿自制片各6 片,以超純水,pH 4.5 醋酸緩沖液,pH 6.8 磷酸鹽緩沖液為溶出介質,參照2015年版《中國藥典》鹽酸小檗堿片溶出度測定法(籃法)進行考察。溶出介質為1000 mL,轉速為120 r·min-1,溫度設置為(37±2)℃,分別在第5、10、15、20、30、45、60、120 min 取樣,用微孔濾膜過濾后,進樣。依據CFDA 頒布的《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》,連續(xù)兩點溶出量均達85%以上,且差值在5%以內,可作為考察截止時間點選擇的依據。從圖5a 中可以看出,在純水溶出介質中,晶F 型鹽酸小檗堿自制片較快溶解,能有良好的溶出行為;晶D 型自制片在90 min 內累計溶出量達到85%,晶B 型和晶C 型自制片在此溶出介質中溶出較慢。4 種自制片劑在醋酸緩沖液溶出介質的溶出曲線如圖5b 所示,晶B 型、晶D 型和晶F 型自制片能在較短時間內達到85%溶出量,表現(xiàn)出良好的溶出行為,而晶C型自制片溶出較慢。如圖5c 所示,晶D 型和晶F 型在磷酸緩沖液溶出較快,具有良好的溶出行為;晶B 型和晶C 型自制片在此溶出介質中溶出較慢;此外,晶D 型自制片溶出曲線在20~60 min 有一定的下降趨勢,可能是晶D 型鹽酸小檗堿發(fā)生了一定程度的降解行為。綜合考慮4 種不同晶型自制片在3 種溶出介質中的溶出行為,晶F 型自制片在所有介質中都有較快的溶出行為,而晶C 型自制片都表現(xiàn)出較慢的溶出,晶B 型和晶D 型自制片在3 種溶出介質中表現(xiàn)出不一致的溶出行為。

        圖5 4 種晶型鹽酸小檗堿片在超純水(a)、醋酸鹽緩沖液(b)、磷酸鹽緩沖液(c)的溶出曲線Fig 5 Dissolution curve of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets in ultrapure water (a), acetate buffer (b)and phosphate buffer (c)

        3 討論

        藥物多晶型現(xiàn)象對于藥物的研發(fā)具有極其重要的意義,約70%臨床使用的藥物為固體口服制劑,而且50%以上固體藥物存在多晶型現(xiàn)象。不同晶型藥物對藥物的吸濕性、穩(wěn)定性、生物利用度、藥效以及安全性等產生較大的影響[26]。由此固體藥物選擇一種合適的存在形式對于藥物應用顯得尤為重要。鹽酸小檗堿在臨床上以鹽酸小檗堿片為主要用藥劑型,本研究中采用單一溶劑重結晶法制備了鹽酸小檗堿5 種晶型,從晶型微觀、紅外光譜、熱分析以及物質結構分析等多個方面對鹽酸小檗堿多晶型進行表征,可以直觀且準確地描繪出鹽酸小檗堿多晶型在各個方面的差異,為鹽酸小檗堿多晶型后續(xù)研究提供數據參考。

        本實驗在前期優(yōu)化片劑制備工藝的基礎上,均采用最佳工藝條件進行制片,設置原料藥晶型為實驗設計單一變量,考察原料藥晶型因素對于片劑溶出度的影響。并依據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與指導原則》,根據藥物的理化性質,充分考慮體內環(huán)境因素的影響,應選擇不同pH 的溶出介質進行溶出度的考察。實驗中為模擬體內胃腸道環(huán)境,純水、pH 1.2 的鹽酸溶液、pH 4.5 的醋酸鹽緩沖液和pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液被選擇為4 種不同pH 的溶出介質。因在pH 1.2 的鹽酸溶液介質中,鹽酸小檗堿的穩(wěn)定性不好,且在5~100 μg·mL-1線性關系不符合要求,故后續(xù)研究中剔除了pH 1.2的鹽酸溶液的溶出介質?;诙嗑望}酸小檗堿的溶出行為結果,表明晶F 型自制片在所有介質中都有較快的溶出行為,而比表面積較大的晶C 型自制片在各介質中都表現(xiàn)出較慢的溶出。溶出速度從快到慢依次為針狀、片狀和柱狀,狹長針狀的溶出速度快于針狀。

        綜上所述,本文從藥物晶型表征以及研究其對片劑溶出度的影響,發(fā)現(xiàn)晶型單晶比表面積對藥物溶出行為產生顯著的影響。后續(xù)研究可關注藥物晶型、粒徑、形貌等屬性對溶出行為的影響,以更加精準地控制原料藥質量,并根據臨床對藥物釋放速度的需求,選擇不同晶型的原料藥制備所需制劑。

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