武小琰，張瀟，何旭暉，林建，楊倩

(南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇 南京 210095)

傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)為冠狀病毒科丙型冠狀病毒屬的典型代表種[1]，是影響世界養(yǎng)雞業(yè)的主要病原之一。該病毒引起的雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis)是一種接觸傳染性、病毒性呼吸道疾病[2]。IBV主要侵害家禽呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng)，臨床上對蛋雞的危害最為嚴重[3-4]。低于2周齡的雞感染IBV后可能引起輸卵管永久損傷，導致產(chǎn)蛋能力下降或喪失。9～18周齡的蛋雞感染IBV會引起產(chǎn)蛋率顯著下降(高達50%)，病程持續(xù)8周以上，常出現(xiàn)軟殼畸形蛋，蛋清呈水樣。IBV暴發(fā)后相當長的一段時間內(nèi)，雞蛋質(zhì)量低且蛋殼不平整，對養(yǎng)殖戶造成巨大損失。目前，研究的主要重點在于IBV的變異性、致病性及預(yù)防控制對策。IBV疫苗免疫保護效果并不理想，原因主要有兩點：其一，IBV基因組的RNA酶缺乏嚴密的校正功能，所以該病毒極易發(fā)生突變[5]；其二，該病毒的基因型、血清型復(fù)雜，不同血清型之間無交叉反應(yīng)或交叉反應(yīng)很小，所以IBV在全球范圍內(nèi)存在廣泛流行，影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展[6-7]。

IBV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長27.6 kb左右，至少有10個開放閱讀框(ORF)，編碼小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和纖突蛋白(S)4種主要結(jié)構(gòu)蛋白[8]。其中，S蛋白是決定IBV血清型的主要蛋白，對IBV的傳染性、致病性、組織嗜性起著決定性作用，同時能誘導機體產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體，是IBV的保護性抗原[9]。因此，S基因的核苷酸序列是IBV分離株分型的重要依據(jù)。S蛋白的抗原位點和高變區(qū)主要集中位于S1蛋白，當S1蛋白發(fā)生基因缺失、插入、重組或突變，就會出現(xiàn)新的血清學和基因型[10]。因此S1基因是研究IBV遺傳變異與進化的指示基因，分析S1基因序列有助分析IBV的流行趨勢[11]。

為了解江蘇省產(chǎn)蛋雞IBV的流行情況及發(fā)展態(tài)勢，為下一步的防控工作提供參考，本研究采集了江蘇省13個地級市的拭子樣品進行檢測。在此基礎(chǔ)上對呈IBV陽性的樣品進行病毒分離與鑒定，并對IBV分離株進行全基因測序和S1基因分析，初步明確了江蘇分離株遺傳演化特點，為下一步防控工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020年11月，對從江蘇省內(nèi)13個地級市20個家禽養(yǎng)殖場進行樣品采集。采集到雞咽拭子及泄殖腔拭子共計625份，其中泄殖腔拭子314份，咽拭子311份。樣品主要來自規(guī)?；B(yǎng)殖場，共有573份，其余來自散養(yǎng)戶的樣品共有52份。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Maker，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自康為世紀有限公司；瓊脂糖，購自翌圣生物科技(上海)有限公司；50×TAE Buffer、10×PBS，購自Biosharp公司；LB液體培養(yǎng)基；雞胚由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.3 采集拭子樣品的RT-PCR檢測

將采集的拭子樣品浸置于500 μL 1×PBS，渦旋振蕩20 s，于4 ℃靜置20 min，再次渦旋振蕩20 s，得到樣品拭子浸出液。取200 μL拭子浸出液，參照DNA/RNA快速提取試劑盒說明書提取核酸。檢測核酸濃度，去除核酸濃度低于檢出下限的樣品。根據(jù)GenBank上公開的IBV QX亞型序列及M41序列設(shè)計引物(表2)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以拭子樣品浸出液為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火15 s，72℃延伸2 min，進行35個循環(huán)72 ℃延伸10 min，得到PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表2 引物序列

1.4 病毒分離及RT-PCR鑒定

將本次試驗中RT-PCR鑒定為IBV陽性的樣品12 000 r/min，離心5 min，收集上清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后接種于11日齡的雞胚，接種病料后48 h后收取尿囊液。用TRIzol法提取尿囊液樣品核酸，參照諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用特異性引物進行PCR擴增，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取單一目的條帶，參照Gel Extraction Kit 快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行膠回收，回收產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測序。

1.5 病毒分離株的全基因組測序及序列分析

1.5.1 引物設(shè)計及合成

IBV基因組序列從5′→3′順序依次為：5′-UTR-1a-1b-S-3a-3b-3c(E)-M-5a-5b-N-UTR-3′，將其分為7個片段，根據(jù)GenBank中公布的IBV基因組序列，利用SnapGene軟件設(shè)計針對IBV全基因序列的7對特異性引物，引物信息見表3，引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.5.2 IBV分離株的全基因組序列分析

通過DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行拼接整理。以NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的18株IBV全基因序列作為本研究的參考毒株(表4)，通過MEGA-X軟件的Neighbor-Joining算法繪制基于全基因序列的進化樹，并使用BioEdit軟件進行核酸及氨基酸同源性比對。

表4 IBV參考毒株全基因的信息

1.5.3 IBV分離株基于S1基因的遺傳進化分析

從全基因組序列中截取S1基因序列。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載36株IBV S1基因序列作為本研究的參考毒株(表5)。通過MEGA-X軟件Neighbor-Joining算法構(gòu)建基于S1基因序列的系統(tǒng)進化樹。使用BioEdit軟件進行核苷酸序列和氨基酸序列同源性比對分析。

表5 IBV參考毒株S1基因的信息

2 結(jié)果與分析

2.1 采集拭子樣品的RT-PCR檢測

以江蘇省各地區(qū)拭子樣品為模板進行RT-PCR鑒定，擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測。QX亞型檢測結(jié)果顯示：產(chǎn)物呈單一條帶，大小約為211 bp，與目的條帶大小相符(部分樣本的擴增結(jié)果見圖1)。將目的條帶切膠回收，測序證實擴增產(chǎn)物為IBV QX亞型。M41未檢出。

M.DL2000 DNA Marker；1～23.部分拭子樣品；24.陰性對照

江蘇省13個地級市的IBV核酸檢出結(jié)果如表6所示，2020年11月共計625份樣品中，除去核酸濃度低于檢出下限的120份樣品，余下的505份樣品平均IBV QX亞型陽性檢出率為14.46%(73/505)。根據(jù)樣品采集地區(qū)進行分類，檢出率由高至低依次為無錫 100%(60/60)、常州 20%(8/40)、南京 8%(2/23)、鹽城 4.1%(3/72)，其余檢測點IBV核酸檢測無陽性結(jié)果。依據(jù)養(yǎng)殖類型來看，檢測出IBV核酸陽性的雞場均為規(guī)?；B(yǎng)殖場。

表6 IBV QX亞型核酸檢測陽性結(jié)果

2.2 IBV分離株全基因序列測序

采用本研究設(shè)計的IBV全基因7個片段設(shè)計的特異性引物，對IBV分離株雞胚尿囊液進行RT-PCR檢測，所得目的片段與預(yù)期大小一致。通過DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行拼接整理，確定本研究分離的IBV江蘇分離株全基因組大小為27 689 bp，其中S1基因的全長為1 620 bp，命名為NEWQXIBV。

2.3 IBV分離株全基因組序列分析

為了研究本試驗分離得到的IBV分離株與我國早期毒株以及與其他各國毒株之間的遺傳演化關(guān)系，將分離株的全基因序列與各參考毒株的全基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖2。分離毒株和所有參考毒株形成7個不同的進化分支(基因型)，分別為基因型GⅠ～GⅦ[12]，分離株與基因型GⅠ(類QX型)親緣關(guān)系最近。

▲本研究分離鑒定毒株。下同

2.4 IBV分離株基于S1基因的遺傳演化分析

根據(jù)分離株S1基因繪制的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖3。分離毒株和所有參考毒株形成7個不同的進化分支(基因型)，分別為基因型GⅠ～GⅦ型，分離株與GⅠ型(類QX型)親緣關(guān)系最近。通過同源對比發(fā)現(xiàn)，分離株與GⅠ型參考代表毒株QXIBV核苷酸和氨基酸的同源性分別為94%和96.2%(如圖4、圖5)。推導的氨基酸序列顯示，分離株S1基因裂解位點為HRRRR，與GⅠ分支所有參考毒株裂解位點一致，為中國IBV毒株所特有。

圖3 分離株S1基因與參考株全基因序列系統(tǒng)進化樹

圖4 IBV分離株與參考毒株S1基因氨基酸序列同源性比對分析

圖5 IBV分離株與參考毒株S1基因核苷酸序列同源性比對分析

3 討論

近年來，我國養(yǎng)雞業(yè)不斷向規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展，合理的養(yǎng)殖方式和及時的疫病監(jiān)測為家禽養(yǎng)殖提供了科學保障。隨著養(yǎng)殖戶防控意識提高，對養(yǎng)雞業(yè)造成影響的部分疫病已經(jīng)得到有效控制，但仍有一些傳染病對養(yǎng)雞業(yè)產(chǎn)生威脅。影響蛋雞養(yǎng)殖的傳染病病原通常存在于被感染家禽的消化道、呼吸道和內(nèi)臟組織器官中，因此病原可以隨病禽的眼、鼻、口腔分泌物及糞便排出，被污染的任何物體都可以傳播病原。了解傳染性支氣管炎的流行情況及發(fā)展態(tài)勢，才能有針對性的加強防控。為了解江蘇地區(qū)傳染性支氣管炎流行情況，本研究對江蘇省13個地級市的蛋雞雞群進行流行病學調(diào)查和分析。結(jié)果表明江蘇地區(qū)IBV QX亞型的平均陽性率為14.46%，而M41亞型未檢出，說明江蘇地區(qū)的IBV仍然以QX型為主。

自20世紀30年代被發(fā)現(xiàn)以來，IBV在幾乎所有的養(yǎng)雞國家存在。IBV不同的血清型和遺傳型的病毒已經(jīng)在世界范圍內(nèi)被鑒定出來，大多數(shù)情況下不具有交叉保護作用。截至目前，中國至少存在3種基因型[13]，16個譜系，超過70%的傳染性支氣管炎病例都是QX型的病毒引起[14]。目前我國使用的活疫苗屬于Mass血清型，該疫苗自1960年研制成功并應(yīng)用至今[15]，被證明是所有傳染性支氣管炎疫苗中效果最好、保護范圍最廣的疫苗，但該血清型與我國流行的QX型同源性較差[2]，傳染性支氣管炎極難得到有效控制。

本研究通過SPF雞胚接種和雞胚尿囊液的RT-PCR鑒定，于江蘇省各地區(qū)IBV陽性的樣品中分離病毒，并對其全基因進行序列測序，得到1株全長27 689 bp的IBV全基因組序列。基于S1基因進行核苷酸和氨基酸同源性比對，結(jié)果表明IBV分離株序列與GⅠ-19譜系(QX型)參考毒株間核酸和氨基酸同源性最高，為94%和95.4%，且具有相同的HRRRR裂解位點特征，屬于基因型Ⅰ(類QX型)。本研究結(jié)果表明，江蘇省地區(qū)流行IBV毒株為國內(nèi)優(yōu)勢基因型毒株，現(xiàn)有Mass型疫苗可能難以起到免疫保護作用，因此有必要對江蘇省IBV進行持續(xù)的流行病學監(jiān)測。建議蛋雞養(yǎng)殖場做好防控，選擇針對流行毒株的本地疫苗，可有效提高疫苗免疫保護率，減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟損失。