趙少若,梁嚴(yán)予,鄭丁丁,王彥偉,郝麗影, 逄文強(qiáng), 鄧均華*, 田克恭,*

(1. 洛陽(yáng)普泰生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000；2. 國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471000)

非洲豬瘟(African swine fever)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV) 引起的一種烈性、傳染性強(qiáng)的動(dòng)物疫病，可感染所有品種和年齡的家豬、野豬，發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)100%，癥狀與傳統(tǒng)豬瘟相似，以全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征[1-3]。非洲豬瘟于1921年在非洲肯尼亞首次被發(fā)現(xiàn)，此后傳入歐洲和美洲多個(gè)國(guó)家，2000年后在臨近中國(guó)的俄羅斯、烏克蘭陸續(xù)暴發(fā)。2018年我國(guó)沈陽(yáng)市首次報(bào)道非洲豬瘟疫情，隨后全國(guó)各地陸續(xù)發(fā)生，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失[4-5]。

ASFV為非洲豬瘟科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是一種獨(dú)特又復(fù)雜的病毒，可感染軟蜱，同時(shí)在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中復(fù)制[6-8]。ASFV為有囊膜的二十面體對(duì)稱(chēng)的雙股DNA病毒，外形為正六邊形，直徑175～215 nm，基因大小介于170～190 kb之間，包含151個(gè)開(kāi)放閱讀框，基因組編碼150～200個(gè)蛋白[9-11]。目前對(duì)ASFV病原特性和致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)并不充分，仍無(wú)有效的治療或預(yù)防措施，為了更深入地研究該病毒，研究者們已經(jīng)確認(rèn)了多個(gè)ASFV結(jié)構(gòu)蛋白，p11.5是結(jié)構(gòu)蛋白中的一種，產(chǎn)生于病毒感染的晚期，分子量為12～13 kDa，是病毒的結(jié)構(gòu)組成部分之一[12]，但是目前針對(duì)該蛋白的報(bào)道較少。本研究通過(guò)構(gòu)建重組原核質(zhì)粒pET28a-SUMO-p11.5進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)重組蛋白SUMO-p11.5進(jìn)行純化，制備了針對(duì)p11.5蛋白的單克隆抗體，為p11.5蛋白生物學(xué)功能的研究、ASFV致病機(jī)制及診斷試劑產(chǎn)品的研發(fā)提供了重要的生物材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pET28a-SUMO質(zhì)粒，由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心構(gòu)建并保存；限制性?xún)?nèi)切酶和T4 DNA連接酶，購(gòu)自ThermoFisher Scientific；Bicinchoninic acid(二喹啉甲酸，簡(jiǎn)稱(chēng)BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗鼠IgG，購(gòu)自Sigma公司；豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)96孔抗原板由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心提供；液體石蠟，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；小鼠單抗Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定用ELISA試劑盒，購(gòu)自洛陽(yáng)佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；非洲豬瘟參考陽(yáng)性血清、ASFV 96孔抗原板來(lái)源于歐盟非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室(Centro de Investigación en Sanidad Animal，CISA-INIA，Madrid，Spain)。

1.3 表達(dá)菌株的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中ASFV SY-18毒株全基因序列(GenBank:MH766894.1)，運(yùn)用在線軟件(http://www.jcat.de/)對(duì)基因序列進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成p11.5基因序列，堿基序列414 bp。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ，上游引物為p11.5-BamHⅠ-F：5′-CGGGGGATCCATGGAAGCTGTTCT-3′(下劃線為酶切位點(diǎn)BamHⅠ),下游引物為p11.5-XhoⅠ-R：5′-GCCGCTCGAGTTAACCTTCTTTGATGTT -3′(下劃線為酶切位點(diǎn)XhoⅠ)。以合成的pUC57-ASFV p11.5為模板，用引物p11.5-BamHⅠ-F和p11.5-XhoⅠ-R進(jìn)行p11.5基因的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的目的基因進(jìn)行膠回收純化，用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ對(duì)純化后的目的基因和pET28a-SUMO載體分別進(jìn)行酶切消化，消化后的目的基因和載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，37 ℃靜置培養(yǎng)10～12 h至單菌落清晰可辨。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，即為重組蛋白SUMO-p11.5的表達(dá)菌株。

1.4 重組蛋白SUMO-p11.5的表達(dá)與純化

取2 mL大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-SUMO-p11.5菌種，接種至200 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫?fù)u床，220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.8～1.0時(shí)，加入終濃度0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)溶液誘導(dǎo)，28 ℃培養(yǎng)12 h。收集菌液，離心后棄掉上清，菌體沉淀用高壓勻質(zhì)機(jī)破碎后，離心收集上清和沉淀，分別制備蛋白電泳樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況。菌體裂解上清液中加入0.01 mol/L咪唑，使用0.45 μm濾器過(guò)濾后，采用鎳柱親和層析法進(jìn)行蛋白純化，純化后的蛋白用SDS-PAGE檢測(cè)，并經(jīng)光譜掃描法確定其純度，以及BCA法進(jìn)行蛋白定量后，將純化蛋白進(jìn)行分裝后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組蛋白SUMO-p11.5的Western blot鑒定

純化的重組蛋白SUMO-p11.5進(jìn)行SDS-PAGE后，將凝膠用半干式轉(zhuǎn)膜法電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)。轉(zhuǎn)印的NC膜用含5%脫脂奶粉的PBST封閉，4 ℃封閉過(guò)夜，一抗為非洲豬瘟參考陽(yáng)性血清，1∶500稀釋后室溫孵育1 h，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG，1∶2 500稀釋后室溫孵育1 h，避光條件下加入DAB顯色液，進(jìn)行顯色觀察結(jié)果。

1.6 單克隆抗體的制備

1.6.1 動(dòng)物免疫及間接ELISA篩選方法的建立

取4～6周齡雌性BALB/c小鼠，背部皮下多點(diǎn)免疫重組蛋白SUMO-p11.5，免疫劑量為100 μg/只。首次免疫，使用弗氏完全佐劑與重組蛋白SUMO-p11.5等體積混合乳化；第二次及之后免疫，使用弗氏不佐劑與重組蛋白SUMO-p11.5等體積混合乳化。免疫間隔2周，三免后7 d采血，用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。包被純化的重組蛋白SUMO-p11.5于酶標(biāo)板，將蛋白濃度稀釋至0.5 μg/mL，100 μL/孔，將待檢小鼠血清進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮难遄鳛橐豢?，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，37 ℃孵育1 h；用PBST洗板4次，加入二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，按1∶10 000稀釋?zhuān)?00 μL/孔；洗板4次，分別加入顯色劑A液、B液，50 μL/孔，37 ℃孵育15 min；最后加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，50 μL/孔，在酶標(biāo)儀上讀數(shù)。當(dāng)陰性對(duì)照OD450 nm<0.2時(shí)試驗(yàn)成立，S/N(待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm)≥2.1判為陽(yáng)性，S/N<2.1判為陰性，以陽(yáng)性孔對(duì)應(yīng)的最高稀釋度作為待檢血清的抗體效價(jià)。選擇抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行沖擊免疫，小鼠腹腔注射純化的重組蛋白SUMO-p11.5，100 μg/只，3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.6.2 細(xì)胞融合及篩選

細(xì)胞融合前1 d取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，將狀態(tài)良好的SP2/0細(xì)胞，與小鼠脾細(xì)胞以1∶10的比例混合，以聚乙二醇(PEG)1500作為融合劑，按常規(guī)步驟進(jìn)行操作[13]，融合后的細(xì)胞鋪于準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞上。8～10 d后取96孔板細(xì)胞上清，用1.6.1建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將大腸桿菌重組蛋白BL21/pET28a-SUMO包被酶標(biāo)板作為非特異對(duì)照板，包被濃度均為0.5 μg/mL，小鼠融合血清作為陽(yáng)性對(duì)照。以重組p11.5蛋白檢測(cè)孔的OD值與非特異蛋白對(duì)照孔OD值的差值，作為該孔的A值，選擇A值較高的細(xì)胞孔，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，3～5次亞克隆后待雜交瘤細(xì)胞上清陽(yáng)性率為100%，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)均一狀態(tài)較好時(shí)，對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及凍存，并收集細(xì)胞上清。

1.6.3 腹水的制備

取6～8月齡BALB/c經(jīng)產(chǎn)母鼠，腹腔注射無(wú)菌液體石蠟，0.5 mL/只。7 d后對(duì)小鼠腹腔注射0.5 mL細(xì)胞密度為30萬(wàn)/mL的雜交瘤細(xì)胞。待小鼠腹部明顯膨大時(shí)，從腹部抽取腹水，12 000 r/min離心10 min，收集上清于-80 ℃保存。

1.7 單克隆抗體的鑒定

1.7.1 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

采用1.6.1建立的間接ELISA法測(cè)定腹水效價(jià)，同時(shí)用大腸桿菌重組蛋白BL21/pET28a-SUMO包被酶標(biāo)板，作為非特異對(duì)照。將梯度稀釋后的腹水作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，按照上述操作方法進(jìn)行檢測(cè)，將對(duì)照值高的單克隆抗體棄掉，進(jìn)一步排除非特異。

1.7.2 單克隆抗體亞類(lèi)的鑒定

按照亞類(lèi)鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，對(duì)獲得的單克隆抗體輕重鏈進(jìn)行亞類(lèi)鑒定。

1.7.3 單克隆抗體特異性鑒定

使用CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PEDV制備的96孔抗原板，檢測(cè)單克隆抗體的特異性。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，CSFV、PRRSV為相應(yīng)的陽(yáng)性血清(由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心提供)，PRV、PCV2、PEDV為相應(yīng)的陽(yáng)性單克隆抗體[14-16]，并用PBS作為陰性對(duì)照，按間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)常規(guī)步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.7.4 單克隆抗體IFA鑒定

將商品化ASFV 96孔抗原板取出回溫后，用PBS潤(rùn)洗1次，分別加入一定稀釋倍數(shù)的腹水，并設(shè)置陰性對(duì)照孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h；PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育50 min；PBS洗滌3次后，孔內(nèi)加入適量PBS于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用p11.5 F/R引物以合成的p11.5基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為414 bp的目的片段(圖1)，與預(yù)期大小一致。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-p11.5進(jìn)行雙酶切鑒定，核酸電泳可觀察到載體條帶和目的條帶(圖2)，說(shuō)明目的基因與載體正確連接。經(jīng)測(cè)序鑒定分析，結(jié)果與p11.5目的基因堿基序列一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M. DNA Marker; 1. p11.5基因

M. DNA Marker;1. pET28a-SUMO-p11.5雙酶切

2.2 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定

經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，與誘導(dǎo)前相比，IPTG誘導(dǎo)后的菌體破碎液上清有明顯目的蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白SUMO-p11.5分子量大約在30 kDa，且為可溶性表達(dá)(圖3)。采用鎳柱親和層析法純化上清中的可溶蛋白，純化后蛋白純度約90%(圖4A)。經(jīng)Western blot鑒定，表達(dá)的重組蛋白SUMO-p11.5能夠與ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)，顯示出特異性的條帶(圖4B)，結(jié)果表明重組蛋白SUMO-p11.5具有良好的反應(yīng)原性。

M. 蛋白分子量Marker;1. 誘導(dǎo)前的大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-SUMO-p11.5菌體破碎液上清;2. 誘導(dǎo)后的大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-SUMO-p11.5菌體破碎液上清

2.3 單克隆抗體制備及效價(jià)檢測(cè)

經(jīng)過(guò)篩選獲得4株能穩(wěn)定性分泌抗p11.5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1G6、3D2、5F2、5E12，將這4株雜交瘤細(xì)胞制備了小鼠腹水，并進(jìn)行ELISA效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果顯示，制備的腹水ELISA效價(jià)均不低于1∶102.4×104。

2.4 單克隆抗體亞類(lèi)鑒定

對(duì)制備的單克隆抗體進(jìn)行亞類(lèi)鑒定，3株單克隆抗體重鏈亞類(lèi)為IgG1，1株重鏈為IgG2a，輕鏈亞類(lèi)均為κ。

2.5 單克隆抗體特異性鑒定

取CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PEDV 96孔抗原板分別檢測(cè)4株單克隆抗體，結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照孔均可見(jiàn)明顯的熒光，陰性對(duì)照孔和單克隆抗體檢測(cè)孔均無(wú)可見(jiàn)熒光，結(jié)果表明4株單克隆抗體均不與CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PEDV發(fā)生反應(yīng)，以單克隆抗體1G6示例(圖5)。

A,B,C,D,E. 相應(yīng)病毒抗體檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照；F,G,H,I,J. PBS處理陰性對(duì)照；K,L,M,N,O. 單克隆抗體1G6與不同病毒反應(yīng)結(jié)果

2.6 單克隆抗體與ASFV反應(yīng)性鑒定

利用商品化ASFV 96孔抗原板，對(duì)獲得的4株單克隆抗體進(jìn)行IFA鑒定，同時(shí)將非ASFV源單克隆抗體作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示4株單克隆抗體均能在熒光顯微鏡下觀察到特異性的綠色熒光，陰性對(duì)照孔無(wú)綠色熒光，以單克隆抗體1G6示例(圖6)。

A. 單克隆抗體1G6;B. 陰性對(duì)照

3 討論

目前非洲豬瘟已在30多個(gè)國(guó)家發(fā)生流行，并有繼續(xù)擴(kuò)大蔓延的趨勢(shì)，該病傳染性強(qiáng)，患豬出現(xiàn)高熱、食欲廢絕、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官?lài)?yán)重出血等臨床癥狀，具有發(fā)病病程短、病死率高等特征[17-18]。鑒于該病的嚴(yán)重危害性，OIE將其列為法定報(bào)告的烈性傳染病之一，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。由于ASFV的復(fù)雜性和特殊性，目前尚無(wú)有效的治療藥物和商品化疫苗，一旦發(fā)病，只能依靠隔離、撲殺、限制流通來(lái)防止疫情蔓延。因此，建立快速而有效的檢測(cè)方法是防止非洲豬瘟發(fā)生大范圍暴發(fā)的有效手段[19-20]。

非洲豬瘟常采用如紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、直接免疫熒光試驗(yàn)、核酸檢測(cè)試驗(yàn)、IFA、ELISA等方法進(jìn)行診斷[21]，國(guó)際上缺乏相關(guān)特異性試劑，對(duì)非洲豬瘟的防控帶來(lái)許多困難。ASFV病毒復(fù)制是調(diào)控病毒基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)關(guān)，極早期和早期基因在病毒復(fù)制前進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而中期和晚期基因在病毒復(fù)制開(kāi)始后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)。p11.5基因比較穩(wěn)定，在病毒DNA合成開(kāi)始后被翻譯，因此屬于晚期病毒基因類(lèi)別。該蛋白在感染細(xì)胞中定位于病毒工廠，并組裝進(jìn)入病毒顆粒，是病毒的結(jié)構(gòu)組成部分，在感染細(xì)胞中非常豐富，因此，p11.5具有作為診斷抗原的潛質(zhì)[22]。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出ASFV p11.5蛋白，且為胞質(zhì)內(nèi)可溶性表達(dá)。經(jīng)過(guò)Western blot分析，重組蛋白可以和ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，有良好的反應(yīng)原性。以重組蛋白p11.5蛋白免疫小鼠制備了4株針對(duì)該蛋白的單克隆抗體，間接ELISA方法檢測(cè)獲得的單克隆抗體效價(jià)均不低于1∶102.4×104。經(jīng)單克隆抗體亞類(lèi)鑒定，3株單克隆抗體重鏈亞類(lèi)為IgG1，1株重鏈亞類(lèi)為IgG2a，輕鏈亞類(lèi)均為κ。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，4株單克隆抗體均不與CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PEDV反應(yīng)，但均能與ASFV反應(yīng)，表明制備的單克隆抗體具有良好的特異性與反應(yīng)性。

本研究成功表達(dá)了可溶性的ASFV p11.5蛋白并制備了針對(duì)p11.5的單克隆抗體，經(jīng)鑒定具有較高的效價(jià)且特異性良好，為p11.5蛋白的結(jié)構(gòu)功能等基礎(chǔ)研究，以及ASFV免疫類(lèi)診斷試劑產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了重要的生物材料。