李思，蔣蔚，盧春慧，程婷婷,，孫衛(wèi)東，王權(quán)*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

氟喹諾酮類藥物已廣泛運(yùn)用于人[1-2]與動(dòng)物[3-4]疾病的治療當(dāng)中，其中鹽酸二氟沙星、鹽酸沙拉沙星為獸類專用藥[5]。二氟沙星可通過(guò)脫甲基作用生成其活性代謝產(chǎn)物沙拉沙星，從而起到抗菌效果[6]。沙拉沙星是由美國(guó)雅培公司在1995年上市，并獲得FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)可用于食用動(dòng)物的氟喹諾酮類藥物[7]。臨床上以鹽酸沙拉沙星的形式用藥，因其抗菌譜廣、藥效良好，所以被廣泛用于畜禽及水產(chǎn)類的細(xì)菌感染防治[8-9]。此外，鹽酸沙拉沙星價(jià)格低廉，是畜禽養(yǎng)殖戶的用藥首選，又由于不規(guī)范用藥或?yàn)E用的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，易導(dǎo)致畜禽體內(nèi)細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)[10]，通過(guò)食物鏈對(duì)消費(fèi)者的神經(jīng)系統(tǒng)、葡萄糖代謝、皮膚等造成潛在的危害[11]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部已明文規(guī)定了二氟沙星、沙拉沙星在雞肉當(dāng)中的最大殘留量分別為300 μg/kg、10 μg/kg[12]，美國(guó)已經(jīng)全面禁止了氟喹諾酮類藥物在養(yǎng)殖領(lǐng)域的使用[13]。國(guó)內(nèi)外用于沙拉沙星殘留檢測(cè)的方法主要包括：免疫分析方法[14]、高效液相色譜法(HPCL)[15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/MS)[16-17]、超高效液相色譜法(UPCL)[18]等，其中后3種方法需要復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)的樣品前處理，而且檢測(cè)儀器昂貴，不適用于市場(chǎng)上大量樣品的快速檢測(cè)。免疫分析方法當(dāng)中主要包括酶聯(lián)免疫分析方法(ELSIA)[19]、膠體金免疫層析法(GICA)[20]、熒光免疫分析法(IFA)[21]、化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法(chemiluminescence enzyme-linked immunoassay，CLEIA)[22]，具有快速、高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)，可滿足市場(chǎng)上大批量快速檢測(cè)的需求。本研究中建立的直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法(dc-CLEIA)，是將化學(xué)發(fā)光與酶聯(lián)免疫分析方法結(jié)合在一起，利用酶標(biāo)記抗體，待免疫反應(yīng)結(jié)束后，以酶催化化學(xué)發(fā)光底物，根據(jù)其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行定性及定量分析。此方法不僅可以縮短檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，而且還能提高檢測(cè)靈敏度。

1 材料與方法

1.1 主要材料

沙拉沙星單克隆抗體(SAR-Ab)及包被抗原(SAR-1-OVA)，均由本實(shí)驗(yàn)室制備；鹽酸沙拉沙星，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；二氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星等氟喹諾酮類藥物，均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，購(gòu)自上海滿雪生物科技有限公司；高碘酸鈉(NaIO4)、四氫硼酸鈉(NaBH4)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；化學(xué)發(fā)光底物A液、B液，均購(gòu)自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；超高性能發(fā)光檢測(cè)儀(BioTek?)。

1.2 酶標(biāo)沙拉沙星抗體(McAb-HRP)的合成與鑒定

1.2.1 McAb-HRP的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法，采用改良過(guò)碘酸鈉法合成SAR-Ab辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物(McAb-HRP)。稱取6 mg HRP溶解于1 mL去離子水中，再加入300 μL NaIO4溶液(0.1 mol/L)，混勻，室溫下避光反應(yīng)20 min。將反應(yīng)后的混合液使用醋酸鈉溶液(1 mmol/L，pH=4.4)透析過(guò)夜，透析后的HRP溶液用碳酸鹽緩沖液(CBS,0.2 mol/L，pH=9.5)調(diào)節(jié)pH至 9.5 作為A液。取6 mg SAR-Ab溶于CBS(0.01 mol/L，pH=9.5)中作為B液，將A液與B液混合，室溫避光攪拌反應(yīng)2 h。 加入80 μL NaBH4溶液(4 mol/L)，混勻，室溫避光反應(yīng)1.5 h。再將反應(yīng)產(chǎn)物以PBS(0.01 mol/L，pH=7.4)溶液于4 ℃透析 3 d，最后，與等體積甘油混合保存于-20 ℃。

1.2.2 McAb-HRP的鑒定

在220～440 nm范圍內(nèi)進(jìn)行對(duì)SAR-Ab、HRP、McAb-HRP的PBS溶液進(jìn)行紫外光譜掃描鑒定，對(duì)比三者之間的最大吸收峰的位移及其吸收曲線變化，鑒定McAb-HRP是否偶聯(lián)成功。同時(shí)采用直接ELISA鑒定偶聯(lián)物McAb-HRP的效價(jià)，采用棋盤法，向酶標(biāo)板中縱向包被SAR-1-OVA及OVA，橫向加入不同稀釋度的酶標(biāo)抗體McAb-HRP，經(jīng)ELISA常規(guī)操作，測(cè)得其效價(jià)。

1.3 dc-CLEIA檢測(cè)方法的建立

1.3.1 包被原濃度與酶標(biāo)抗體稀釋比工作濃度確定

首先采用棋盤法，縱向包被不同濃度的包被原(SAR-1-OVA)，橫向包被不同稀釋度的酶標(biāo)抗體(McAb-HRP)，根據(jù)RLU值，初步選擇數(shù)值在1×106左右的包被原濃度以及酶標(biāo)抗體稀釋度作為初步工作濃度。采用二因子交叉試驗(yàn)，在初步的工作濃度上下分別選擇3個(gè)不同的包被抗原及酶標(biāo)抗體濃度，使沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 ng/mL，對(duì)不同濃度的沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液作dc-CLEIA，繪制各包被原及酶標(biāo)抗體工作濃度下的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其靈敏度IC50(即50%抑制率時(shí)對(duì)應(yīng)的沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品濃度)的值，根據(jù)IC50的值選擇最佳工作濃度并建立標(biāo)曲。

1.3.2 檢測(cè)步驟

用CBS(pH=9.6，0.05 mol/L)將包被原SAR-1-OVA稀釋到所需濃度，加入化學(xué)發(fā)光板中100 μL/孔，4 ℃孵育過(guò)夜，1×PBST洗板3遍，間隔5 min。5%脫脂乳200 μL/孔，37 ℃ 孵育 2 h，1×PBST洗板3遍，間隔5 min。洗板后加入50 μL稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)和50 μL McAb-HRP，置于37 ℃ 孵育1.5 h，1×PBST洗板3遍，間隔5 min。加入100 μL/孔的化學(xué)發(fā)光的底物液(A液∶ B液=1∶1)，5 min內(nèi)，用超高性能發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)，讀取化學(xué)發(fā)光值(RLU值)。

1.4 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)最佳工作條件結(jié)果，以沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以結(jié)合率B/B0作為縱坐標(biāo)(B表示某一濃度沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品抑制時(shí)對(duì)應(yīng)的RLU值，B0表示空白樣品對(duì)應(yīng)的RLU值)，建立沙拉沙星直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 精密度試驗(yàn)

用不同濃度的鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)，以McAb-HRP與包被原SAR-1-OVA結(jié)合率的批內(nèi)誤差和批間誤差來(lái)評(píng)價(jià)此方法的精密度。在同一次試驗(yàn)中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度做5組重復(fù)，以其批內(nèi)變異系數(shù)表示其批內(nèi)精密度；在不同的時(shí)間連續(xù)做5次，以其批間變異系數(shù)表示其批間精密度。

1.6 特異性試驗(yàn)

取13種氟喹諾酮類藥物以及4種其他抗生素作為競(jìng)爭(zhēng)抑制物，進(jìn)行dc-CLEIA。擬出各藥物的抑制曲線，并計(jì)算出其半數(shù)抑制量(IC50)。最后，按公式得出各競(jìng)爭(zhēng)抑制藥物與SAR-Ab的交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率=(沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品的IC50/其他競(jìng)爭(zhēng)抑制藥物的IC50)×100%。

1.7 最低檢出限(LOD)試驗(yàn)

1.8 樣品前處理

將雞胸肉用組織勻漿機(jī)打成均質(zhì)的糊狀。取4 g均質(zhì)樣本于50 mL離心管中加入乙腈-二氯甲烷混合液(乙腈∶二氯甲烷=1∶4)16 mL，充分渦旋5 min，15 ℃，5 000 r/min，離心10 min，取8 mL有機(jī)相至干燥容器中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2 mL 0.02 mol/L PBS溶解干燥的殘留物，加入2 mL正己烷，充分混合30 s，15 ℃，5 000 r/min，離心5 min，去除上層，取下層PBS液體用于檢測(cè)分析。

1.9 添加回收試驗(yàn)

在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，根據(jù)高、中、低的添加濃度原則，向空白雞肉樣品中加入不同濃度的沙拉沙星藥物，每個(gè)濃度設(shè)置5組平行試驗(yàn)。按照1.8的樣品處理方法，采用dc-CLEIA方法檢測(cè)實(shí)際樣品中的藥物濃度，最后根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算出各添加濃度的回收率和變異系數(shù)。

回收率=(實(shí)際濃度的平均值/添加濃度)×100%；變異系數(shù)=(實(shí)際濃度的標(biāo)準(zhǔn)差/實(shí)際濃度的平均值)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶標(biāo)抗體McAb-HRP的鑒定

2.1.1 紫外掃描鑒定

取SAR-Ab、HRP和McAb-HRP的PBS溶液，在220～440 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，紫外掃描結(jié)果見圖1，譜圖顯示SAR-Ab在波長(zhǎng)278 nm處有個(gè)最大吸收峰，HRP在403 nm處有個(gè)最大吸收峰，McAb-HRP則分別在277和402 nm處各有個(gè)最大吸收峰，可初步判斷酶標(biāo)抗體偶聯(lián)成功。

圖1 McAb-HRP偶聯(lián)紫外掃描分析

2.1.2 間接ELISA鑒定及其效價(jià)測(cè)定

運(yùn)用間接ELISA鑒定McAb-HRP是否偶聯(lián)成功，結(jié)果如表1，包被SAR-1-OVA孔的OD450較包被OVA孔大，說(shuō)明酶標(biāo)抗體可以與SAR-1-OVA特異性結(jié)合，并且能與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)發(fā)生顯色反應(yīng)，由此進(jìn)一步證明了酶標(biāo)抗體偶聯(lián)成功，且在包被原SAR-1-OVA濃度為2.5 μg/mL時(shí)，酶標(biāo)抗體效價(jià)達(dá)到了1∶32 000。

表1 McAb-HRP鑒定結(jié)果

2.2 dc-CLEIA檢測(cè)方法的建立

2.2.1 最佳包被抗原濃度及最佳酶標(biāo)抗體稀釋度的確定

根據(jù)初步選擇的包被抗原濃度1.25 μg/mL及酶標(biāo)抗體稀釋度1∶8 000，進(jìn)一步選取3個(gè)包被抗原濃度2.5、1.25、0.625 μg/mL以及3個(gè)酶標(biāo)抗體稀釋度1∶4 000、1∶8 000、1∶12 000，同時(shí)使沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 ng/mL，根據(jù)dc-CLEIA的操作步驟，進(jìn)行藥物競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，最后根據(jù)RLU值，計(jì)算出在不同包被原濃度及酶標(biāo)抗體稀釋比下的IC50，結(jié)果如表2。在包被原濃度為1.25 μg/mL，酶標(biāo)一抗的稀釋度為1∶8 000時(shí)，IC50最低，故選其為最佳工作條件。

表2 不同包被抗原濃度及酶標(biāo)抗體稀釋度下的IC50

2.2.2 dc-CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖2，沙拉沙星在線性范圍濃度0.312～20 ng/mL內(nèi)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其結(jié)合率與沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，回歸方程為y=-0.373x+0.688(R2=0.985)，經(jīng)計(jì)算，其IC50為3.19 ng/mL。

圖2 沙拉沙星dc-CLEIA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度試驗(yàn)

用不同濃度的鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制，對(duì)所得的RLU值進(jìn)行批內(nèi)和批間變異系數(shù)分析，來(lái)表示此方法的精密度。變異系數(shù)=[SD的平均值/(1.414×平均結(jié)合率)]×100%。沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品各濃度下的結(jié)合率和變異系數(shù)見表3。經(jīng)計(jì)算，平均批內(nèi)變異系數(shù)為4.68%，平均批間變異系數(shù)為6.13%，平均批內(nèi)批間變異系數(shù)均低于7%，由此說(shuō)明該方法精密度良好。

表3 dc-CLEIA批內(nèi)批間誤差

2.4 特異性試驗(yàn)

由表4可知，SAR-Ab與二氟沙星的交叉率較高，與其他10種氟喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)率均低于8%，與其余4種其他抗生素的交叉反應(yīng)率極低，表示SAR-Ab能特異性的識(shí)別沙拉沙星與二氟沙星。

表4 SAR-Ab特異性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.5 二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以二氟沙星不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以結(jié)合率B/B0作為縱坐標(biāo)，建立了二氟沙星直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3。二氟沙星在線性范圍濃度0.312～20 ng/mL內(nèi)，其結(jié)合率與二氟沙星不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，回歸方程為：y=-0.369x+0.719(R2=0.994)，經(jīng)計(jì)算，其IC50為3.94 ng/mL。

圖3 二氟沙星 dc-CLEIA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 最低檢出限試驗(yàn)

表5 各空白值檢測(cè)結(jié)果

2.7 添加回收試驗(yàn)

在空白雞肉中，分別添加沙拉沙星和二氟沙星，在0.312～20 ng/mL的線性范圍內(nèi)，均設(shè)置20、5、2.5、0.5 μg/kg 4個(gè)添加濃度，作dc-CLEIA檢測(cè)，結(jié)果見表6。經(jīng)計(jì)算得出沙拉沙星在雞肉中的回收率為88.2%～108.3%，其變異系數(shù)≤10.28%；二氟沙星在雞肉中的回收率為93.36%～102.7%，其變異系數(shù)≤13.4%。

表6 添加回收試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究采用改良的過(guò)碘酸鈉法，合成偶聯(lián)物McAb-HRP，經(jīng)紫外掃描及直接ELISA 鑒定偶聯(lián)成功，且在包被抗原SAR-1-OVA濃度為2.5 μg/mL時(shí)，酶標(biāo)抗體的效價(jià)達(dá)到了1∶32 000，說(shuō)明偶聯(lián)效率較高。通過(guò)棋盤法，確定了最佳包被抗原濃度以及最佳酶標(biāo)抗體稀釋度分別為1.25 μg/mL、1∶8 000，在此基礎(chǔ)上建立了dc-CLEIA分析方法，其標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線y=-0.373x+0.688 (R2=0.985)，靈敏度IC50為3.19 ng/mL，樣品最低檢出限為1.25 μg/kg。劉儒彪等[24]制備的沙拉沙星ELISA檢測(cè)試劑盒的靈敏度IC50為4.11 ng/mL，其最低檢出限為2.06 ng/mL。根據(jù)穆國(guó)冬[25]建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-24.566x+94.216，R2=0.998，可計(jì)算出其靈敏度IC50為3.81 ng/mL，其最低檢出限為1.55 ng/mL。由此可看出本研究中建立的dc-CLEIA分析方法，靈敏度高于ELISA方法。本試驗(yàn)建立的dc-CLEIA檢測(cè)方法，其精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，其批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于7%，由此說(shuō)明此方法重復(fù)性良好。而特異性結(jié)果顯示，除與二氟沙星的交叉反應(yīng)率高達(dá)80.96%外，與其他氟喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)率均低于8%，而這正是因?yàn)槔承鞘嵌承堑幕钚源x物。這兩種氟喹諾酮類藥物不同于其他氟喹諾酮類藥物的地方在于前者在其N1位上帶有一個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，從而對(duì)整個(gè)藥物分子的空間結(jié)構(gòu)影響較大，故制備的SAR-Ab對(duì)二氟沙星的交叉反應(yīng)率較其他氟喹諾酮類藥物高出許多。由此建立了二氟沙星的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為0.312～20 ng/mL，線性方程為y=-0.369x+0.719(R2=0.994)，靈敏度IC50為3.94 ng/mL。最后在雞肉樣本中對(duì)沙拉沙星和二氟沙星進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，結(jié)果顯示，沙拉沙星在雞肉中的回收率為88.2%～108.3%，其變異系數(shù)≤10.28%；二氟沙星在雞肉中的回收率為93.36%～102.7%，其變異系數(shù)≤13.4%。由此表明，本試驗(yàn)建立的dc-CLEIA分析方法精密度、特異性良好，靈敏度高。

化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法具備靈敏度高、特異性強(qiáng)，且能快速大量的檢測(cè)，無(wú)需復(fù)雜耗時(shí)的樣品前處理，能滿足市場(chǎng)大量檢測(cè)需求，其次化學(xué)發(fā)光值能夠達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)，測(cè)定范圍更寬?；瘜W(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法可分為直接法和間接法，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。本研究中建立的dc-CLEIA方法的靈敏度相較于本實(shí)驗(yàn)室建立的間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法(ic-CLEIA)的靈敏度1.45 ng/mL低，但也完全能滿足國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對(duì)于沙拉沙星樣品殘留檢測(cè)要求，dc-CLEIA優(yōu)點(diǎn)在于省去了酶標(biāo)二抗的孵育時(shí)間，故在檢測(cè)時(shí)間上優(yōu)于ic-CLEIA。而ic-CLEIA因?yàn)橛幸豢购兔笜?biāo)二抗反應(yīng)的放大效應(yīng)，所以其靈敏度明顯優(yōu)于dc-CLEIA。在實(shí)際的運(yùn)用當(dāng)中，可根據(jù)兩種方法的優(yōu)點(diǎn)來(lái)選擇具體的檢測(cè)方法。