張續(xù)勐，黎頌超，蔡穎宇，王金輝，江丹莉*

(1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院， 廣東 廣州 510225；2. 廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510225)

我國(guó)是水禽養(yǎng)殖大國(guó)，廣東省又是我國(guó)水禽養(yǎng)殖大省，憑借珠江三角洲的地理優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)鴨養(yǎng)殖量也呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。產(chǎn)肉量是衡量鴨生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，目前鴨的養(yǎng)殖模式大多采取半開放養(yǎng)殖模式，水體中極易滋生大腸桿菌和沙門菌[2]。在水體溫度較高或養(yǎng)殖密度較高的養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)容易發(fā)生大腸桿菌和沙門菌的大量增殖[3]，這也就使得水體和鴨血液中細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)濃度也隨之上升。

LPS是一種熱穩(wěn)定毒素，革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，LPS很難從細(xì)胞壁脫落，當(dāng)細(xì)菌死亡時(shí)它會(huì)通過(guò)溶解、破壞細(xì)胞來(lái)脫落，并通過(guò)作用于動(dòng)物細(xì)胞等而發(fā)揮其毒性。LPS具有特殊組成結(jié)構(gòu)和生物活性部位，是常見誘導(dǎo)急性感染和炎癥反應(yīng)的主要因素。進(jìn)入機(jī)體后可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥因子，繼而引發(fā)機(jī)體一系列免疫反應(yīng)，在免疫應(yīng)激狀態(tài)下，動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能將受到影響，合成代謝降低，分解代謝增強(qiáng)，免疫力下降，甚至嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體損傷。這種反應(yīng)對(duì)鴨的生長(zhǎng)性能有著不利的影響[4]。

有不少研究者曾就LPS對(duì)家禽的影響進(jìn)行探究。馬邯生等[4]研究顯示，用100、500、1 000 μg/kg體重LPS分別在16、18、20日齡注射肉仔雞，顯著降低了肉仔雞的采食量和日增重。江丹莉等[5]研究顯示，對(duì)29日齡的山麻鴨每7 d注射1 mg LPS后，飼料回報(bào)率降低，生長(zhǎng)相關(guān)激素水平降低。而本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)3～9日齡馬崗鵝分2組隔日注射200 和100 μg LPS，2組鵝在試驗(yàn)前期采食量均顯著降低。LPS處理顯著降低了雛鵝生長(zhǎng)速度，高劑量組中尤為顯著[6]。

此前，學(xué)者們主要關(guān)注點(diǎn)在于LPS對(duì)水禽的致炎性影響，鮮有對(duì)外源性LPS處理下雛鴨肌纖維發(fā)育的變化進(jìn)行探究。而雛鴨所處的時(shí)期，是肌肉生長(zhǎng)過(guò)程中的重要階段。因此，本試驗(yàn)將通過(guò)定期腹腔皮下注射法，探索不同濃度LPS對(duì)山麻鴨早期生長(zhǎng)、血清激素、肝、脾及肌纖維發(fā)育的影響，為揭示環(huán)境內(nèi)毒素對(duì)山麻鴨早期生長(zhǎng)發(fā)育的影響提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

7日齡健康山麻鴨由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鐘村農(nóng)場(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試雛鴨已進(jìn)行常規(guī)免疫。挑選24只體重相近(110±10)g的健康雌性山麻鴨，隨機(jī)平均分為4組(高濃度LPS組，高濃度對(duì)照組，低濃度LPS組，低濃度對(duì)照組)進(jìn)行籠養(yǎng)。每日進(jìn)行基礎(chǔ)飼糧喂養(yǎng)。自7日齡起，高濃度LPS組每隔2 d注射含有500 μg/kg LPS(血清型 O55:B5，Sigma公司)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)緩釋劑0.5 mL，高濃度對(duì)照組每隔2 d注射PVP 緩釋劑0.5 mL(由于第1次注射雛鴨反應(yīng)較大，因此高濃度對(duì)照和高濃度組第1次注射間隔為4 d，其后為2 d)，低濃度LPS組每天注射含有200 μg/kg LPS的生理鹽水0.5 mL，低濃度對(duì)照組每天注射0.5 mL生理鹽水，注射方法采用腹腔皮下注射，注射劑量參考團(tuán)隊(duì)前期在馬崗鵝雛鵝試驗(yàn)中的濃度[6]，并根據(jù)注射時(shí)期、頻率和物種的不同進(jìn)行了調(diào)整。試驗(yàn)期間記錄每組山麻鴨的采食量和每只體重。由于注射頻率不同，為了減少雛鴨應(yīng)激，所有試驗(yàn)組體重測(cè)量的頻率按照高濃度組注射頻率進(jìn)行。出生后的早期山麻鴨主要進(jìn)行肌纖維肥大的過(guò)程，因此為了關(guān)注外源性LPS對(duì)山麻鴨肌纖維肥大過(guò)程的影響，于22日齡時(shí)進(jìn)行采樣。對(duì)每只山麻鴨使用電子體重秤測(cè)量雛鴨體重，對(duì)雛鴨進(jìn)行翅下靜脈采血，每只采集血液2 mL，離心后取約0.5～1 mL血清備用。每只試驗(yàn)用雛鴨通過(guò)頸動(dòng)脈放血法進(jìn)行屠宰后，取相同部位的約1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm體積的腿肌和肝臟，以及完整的脾臟放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)備用，另外取相同體積的腿肌于凍存管中，放入液氮備用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 內(nèi)毒素含量的測(cè)定

采用鱟試劑法測(cè)量血清中內(nèi)毒素含量。所有檢測(cè)步驟均按EC80545S試劑盒說(shuō)明書規(guī)范操作。試劑盒購(gòu)自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司。

1.3.2 激素含量的測(cè)定

采用ELISA 方法檢測(cè)血清中白介素6(IL-6)(XY-ELA0201)和生長(zhǎng)激素(GH)(XY-ELA1911)含量。所有檢測(cè)步驟均按試劑盒說(shuō)明書規(guī)范操作。試劑盒購(gòu)自上海心語(yǔ)生物科技有限公司。

1.3.3 HE染色

HE染色主要進(jìn)行如下步驟：4%多聚甲醛放置24～48 h進(jìn)行組織固定；將肌肉放入包埋盒中脫水，70%乙醇(2 h)，80%乙醇(2 h)，95%乙醇(30 min)，無(wú)水乙醇(2.5 h)，50%無(wú)水乙醇+50%透明劑(30 min)，透明劑(2.5 h)，50%透明劑+50%石蠟(30 min)，石蠟(5 h)；將脫水后的組織放入鋼包埋盒中，用包埋機(jī)加入融化的石蠟，并在制冷平臺(tái)上凝固成蠟塊；將蠟塊固定在石蠟切片機(jī)上，用4 μm的厚度切片；將漂浮在37 ℃水面上的切片用載玻片撈到玻片正中位置，隨后放在50 ℃烘片機(jī)上烘干；將有石蠟切片的載玻片放入透明劑中10 min脫蠟；將載玻片在100%、95%、85%、70%、50%的乙醇、PBS以及純水中各浸泡2 min，并不時(shí)震蕩；將載玻片放入蘇木素中1～5 min，純水沖洗1 min，加入活化劑30 s，純水沖洗1 min，伊紅染色30 s～2 min，自來(lái)水沖洗1 min；玻片自然風(fēng)干后，滴20 μL中性樹脂于載玻片標(biāo)本中心，用鑷子蓋上載玻片。用正置熒光顯微鏡 (ZEISS, ImagerZ1)進(jìn)行觀察拍攝并采集圖片。

1.3.4 肌纖維密度和橫截面積檢測(cè)

利用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)統(tǒng)計(jì)HE染色腿肌橫切面圖片。每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)400倍視野進(jìn)行拍照。拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野。保證每張照片的背景光一致。每張片子隨機(jī)挑選5個(gè)肌纖維，測(cè)量肌纖維的直徑(mm)，并求出平均值。統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中的纖維數(shù)和測(cè)量肌纖維的總橫截面積(mm2)，求出單位面積內(nèi)肌纖維數(shù)量(個(gè)/mm2)。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

對(duì)腿肌分化期特異表達(dá)的基因肌細(xì)胞生成素(Myog)和肌球蛋白重鏈1(Myh1)進(jìn)行鑒定。采用TRIzol法提取組織總RNA，并用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 鴨Myog的PCR上游引物序列為5′-CCCGAGCACTGCCCCGGGCAAT-3′，下游引物序列為5′- CGCTCCTGCTGGTTGAGGCTGCTG-3′；Myh1的PCR上游引物序列為 5′- CTCCTCACGCTTTGGTAAAT-3′，下游引物序列為 5′-GCTCTGGCTTCTTGTTGGAC-3′。本試驗(yàn)采用GAPDH作為內(nèi)參基因，上游引物序列為5′-TCTGTCGTGGACCTGACCTGC-3′，下游引物序列為5′-GCCAGCACCCGCATCAAA-3′。在LightCycler480 Ⅱ上進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以每只雛鴨個(gè)體作為重復(fù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)分析使用SPSS 20軟件，Student’st計(jì)算組間差異，統(tǒng)計(jì)分析采用雙側(cè)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源性LPS對(duì)雛鴨采食量的影響

由圖1可見，低濃度注射外源性LPS降低了雛鴨7～9、15～16和20日齡的采食量；高濃度LPS組，雛鴨采食量在每次注射后第1天均有下降，但一般能在第2天有較大恢復(fù)，注射高濃度外源性LPS降低了雛鴨7、10～11以及13～19日齡的采食量。

圖1 不同濃度外源性LPS對(duì)山麻鴨采食量的影響

2.2 外源性LPS對(duì)雛鴨體重的影響

由圖2可見，低濃度LPS組對(duì)雛鴨體重的影響較小，與對(duì)照組沒(méi)有差異(P>0.05)，而高濃度LPS組從11日齡開始，除了第18日齡外，體重均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

與同濃度對(duì)照組比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同

2.3 外源性LPS對(duì)山麻鴨血清生化指標(biāo)的影響

由圖3A可知，低濃度LPS組和高濃度LPS組血液中的內(nèi)毒素含量都略高于相應(yīng)的對(duì)照組，但沒(méi)有達(dá)到顯著性差異(P>0.05)。GH含量低濃度對(duì)照組略高于低濃度LPS組，但沒(méi)有達(dá)到顯著性差異(P>0.05)，而高濃度組中LPS組和對(duì)照組差異較小(圖3B)。血清中IL-6在低濃度對(duì)照組含量略高于其他3組，但沒(méi)有達(dá)到顯著性差異(P>0.05，圖3C)。

圖3 不同濃度LPS處理對(duì)山麻鴨血清生化指標(biāo)的影響

2.4 外源性LPS對(duì)山麻鴨肝臟、脾臟的影響

從22日齡取樣的肝臟、脾臟HE染色結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，低、高濃度LPS組與對(duì)照組相比，肝細(xì)胞均排列緊密，大小基本一致，肝組織結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化，但高、低濃度LPS組均有數(shù)量不等的空泡樣變，特別是高濃度LPS組空泡較多(圖4)。

箭頭指示空泡狀變化；標(biāo)尺=20 μm

對(duì)照組中山麻鴨脾臟組織結(jié)構(gòu)排列規(guī)律，白髓中毛細(xì)血管和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密，紅髓中的淋巴細(xì)胞較少，淋巴鞘被淋巴細(xì)胞圍繞。在低濃度LPS注射后，組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)相對(duì)疏松的現(xiàn)象，白髓中血管和內(nèi)皮細(xì)胞連接開始疏松，紅髓中的紅細(xì)胞發(fā)生了溶血，紅色顆粒增加，淋巴鞘旁的淋巴細(xì)胞開始導(dǎo)出遷移，這些現(xiàn)象在高濃度LPS組中更加明顯(圖5)。

Wp.白髓；Rp.紅髓；L.淋巴細(xì)胞。箭頭指示髓中淋巴細(xì)胞遷移和紅細(xì)胞溶血；標(biāo)尺=20 μm

2.5 外源性LPS對(duì)山麻鴨腿肌肌纖維的影響

由圖6、圖7可知，高濃度LPS組肌纖維直徑極顯著低于高濃度對(duì)照組(P<0.01)，肌纖維密度沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；低濃度LPS組肌纖維直徑和密度均與低濃度對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖6 不同濃度LPS處理后腿肌HE染色比較(標(biāo)尺=20 μm)

圖7 不同濃度LPS對(duì)山麻鴨腿肌肌纖維密度(A)和直徑(B)的影響

2.6 外源性LPS對(duì)山麻鴨腿肌Myh1和Myog基因表達(dá)的影響

低、高濃度LPS組Myog的表達(dá)量均略低于相應(yīng)對(duì)照組，但均未達(dá)到顯著性差異(P>0.05，圖8A)。高濃度LPS組Myh1的表達(dá)量顯著低于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.05)，低濃度LPS組Myh1的表達(dá)量略低于相應(yīng)對(duì)照組，但未達(dá)到顯著差異(P>0.05，圖8B)。

圖8 不同濃度LPS對(duì)山麻鴨腿肌Myog(A)和Myh1(B)基因表達(dá)的影響

3 討論

7～22日齡是鴨肌肉發(fā)育最為關(guān)鍵的時(shí)期之一，這個(gè)時(shí)期肌纖維發(fā)育程度對(duì)鴨成年后的產(chǎn)肉量、生長(zhǎng)速度等生長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)性狀產(chǎn)生重要影響。在本研究中，每天注射溶于生理鹽水的200 μg/kg LPS對(duì)山麻鴨的體重、肝臟、脾臟和肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育均無(wú)太大的影響。前人的研究結(jié)果顯示，在對(duì)肉仔雞用100、500、1 000 μg/kg體重LPS分別在16、18、20日齡進(jìn)行注射，只有500、1 000 μg/kg體重LPS會(huì)引起機(jī)體免疫功能顯著下降，而低濃度的影響不明顯[7]。這說(shuō)明禽類在試驗(yàn)采樣相近的時(shí)期，對(duì)于較低濃度的LPS具有一定的耐受性，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。

在每隔2 d注射溶于緩釋劑中的500 μg/kg LPS后，鴨的生長(zhǎng)發(fā)育較對(duì)照組變得緩慢，采食量明顯下降，體重顯著低于對(duì)照組，肝臟、脾臟發(fā)生輕微病變，并且腿肌肌纖維直徑顯著降低，肌肉分化標(biāo)志基因Myh1表達(dá)顯著下調(diào)。說(shuō)明高濃度外源性LPS可能通過(guò)影響雛鴨的采食量，減少雛鴨的營(yíng)養(yǎng)攝入，抑制了肌纖維肥大的過(guò)程，從而導(dǎo)致體重降低。在小鼠成肌細(xì)胞模型中，在培養(yǎng)基中添加100 ng/mL LPS可能會(huì)通過(guò)升高IL-1和IL-6來(lái)影響成肌細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程[8-9]。而LPS對(duì)山麻鴨肌纖維肥大過(guò)程的抑制是直接還是間接的作用，其具體的調(diào)控機(jī)制如何，還需要在山麻鴨的細(xì)胞試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。與本研究結(jié)果類似，團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明注射高濃度LPS會(huì)使鵝的早期采食量下降，肉鵝的胸肌率、腿肌率均顯著低于正常鵝群，說(shuō)明了LPS能使得鵝的生長(zhǎng)發(fā)育和屠宰性能下降[6]。LPS降低了山麻鴨的生長(zhǎng)性能和免疫功能，對(duì)胸腺、肝臟、脾臟有一定的損傷[4]，這與我們對(duì)雛鴨的試驗(yàn)結(jié)果類似。

在血清生化指標(biāo)中高濃度或低濃度LPS處理組均使得雛鴨血清內(nèi)毒素升高，但未到顯著水平，且內(nèi)毒素在血清中含量不高，GH在組間差異不明顯，這可能是由于采樣時(shí)雛鴨日齡較大，代謝速度較快導(dǎo)致。IL-6受到的影響較小，與LPS處理組引起較小的肝臟、脾臟病理變化相符合。有研究表明，LPS會(huì)使肉鴨的肝臟、脾臟相對(duì)重量降低，并對(duì)心臟、肺、腎重量，肌胃和腺胃指數(shù)，以及腸道形態(tài)等指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響[10-11]。提示在本文研究的LPS注射濃度下，生長(zhǎng)性能的變化可能不是通過(guò)GH分泌和應(yīng)激反應(yīng)造成的，而是通過(guò)消化、免疫系統(tǒng)等綜合因素對(duì)雛鴨的采食量、體重和肌肉發(fā)育所產(chǎn)生的直接或間接的影響。以上結(jié)果還需在后期研究中增加采樣點(diǎn)，通過(guò)對(duì)血清生化指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

Myog在肌肉起始分化時(shí)表達(dá)，并決定下游促進(jìn)肌肉分化的基因表達(dá)，而Myh1則是肌纖維重要組成成分肌球蛋白重鏈的基因[12]。在本研究中，外源性LPS注射并沒(méi)有引起Myog基因的顯著變化，可能是因?yàn)镸yog在肌肉分化起始表達(dá)[13]，發(fā)揮作用的時(shí)間早于我們的采樣時(shí)間。而在本試驗(yàn)的采樣時(shí)期22日齡，Myh1基因在高濃度LPS注射后表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，與腿肌HE染色結(jié)果中高濃度LPS處理組腿肌肌纖維直徑顯著低于對(duì)照組的表型相符。

在本研究的結(jié)果中，高濃度對(duì)照組的肌纖維密度明顯低于包括低濃度LPS組在內(nèi)的其他幾組，而肌纖維直徑則明顯高于其他幾組。造成上述情況的原因，主要還是由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)上的考慮不周。由于實(shí)驗(yàn)室同一規(guī)格的籠子數(shù)量不夠，因此在將雛鴨分組后，高濃度LPS組和相應(yīng)對(duì)照組所用的籠子(70 cm×70 cm×40 cm，約12.24只/m2)規(guī)格要大于低濃度LPS組和相應(yīng)對(duì)照組所用的籠子(60 cm×60 cm×40 cm， 約16.67只/m2)，因此高濃度LPS組與對(duì)照組、低濃度LPS組與對(duì)照組的飼養(yǎng)密度不同。凡文磊等[14]對(duì)15～40日齡肉鴨進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)飼養(yǎng)密度(12、13、14只/m2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著飼養(yǎng)密度增加，肉鴨個(gè)體出欄體重降低，飼養(yǎng)密度為13只/m2時(shí)總盈利最高。該密度與本研究中高濃度LPS組和對(duì)照組所使用的密度接近。由于肌肉重量占體重的比例較高，因此該密度下雛鴨的肌肉發(fā)育也很有可能好于其他密度組，從而具有較大的肌纖維直徑。綜上所述，本研究中組間的肌纖維發(fā)育差異主要是受到了飼養(yǎng)密度的影響，密度適中的雛鴨運(yùn)動(dòng)量比高密度的多，活動(dòng)環(huán)境也好于高密度組，這可能是肌纖維發(fā)育較好的原因，而在同樣大小籠子(高濃度LPS組與對(duì)照組，低濃度LPS組與對(duì)照組)之間的比較結(jié)果中肌纖維發(fā)育的差異主要是受到了LPS的影響。由于飼養(yǎng)密度對(duì)于雛鴨肌纖維直徑和密度影響的研究還沒(méi)有報(bào)道，因此該結(jié)論還需進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果確證。

肌纖維發(fā)育直接決定了動(dòng)物的產(chǎn)肉量，探索出一個(gè)適合山麻鴨生長(zhǎng)發(fā)育良好的養(yǎng)殖環(huán)境，對(duì)提升山麻鴨養(yǎng)殖效率和產(chǎn)肉量有重大的意義?；诒狙芯亢蛨F(tuán)隊(duì)前期在鵝胚中的研究發(fā)現(xiàn)，死胎中LPS濃度顯著高于活胚[15]，并且外源性LPS會(huì)顯著降低胚胎的孵化率[16]，提示LPS在胚胎期對(duì)禽類生長(zhǎng)發(fā)育影響更大。而胚胎期也是肌肉發(fā)育最為關(guān)鍵的時(shí)期，禽類的肌纖維數(shù)目在出生前就已經(jīng)決定，出生后的早期發(fā)育階段主要是肌纖維肥大過(guò)程[17]，這兩個(gè)過(guò)程直接決定了出生后產(chǎn)肉量[18]。因此，后期我們將進(jìn)一步提前LPS處理時(shí)期至更早日齡甚至胚胎期，并增加更多的LPS處理濃度梯度，探索合適的飼養(yǎng)密度，增加試驗(yàn)研究個(gè)體數(shù)量和采樣時(shí)間點(diǎn)，完善本研究的結(jié)果。

本研究通過(guò)探究不同濃度外源性LPS對(duì)山麻鴨早期生長(zhǎng)、血清激素、肝、脾及肌纖維發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)每隔2 d注射溶于緩釋劑中的500 μg/kg LPS會(huì)顯著降低山麻鴨雛鴨的體重和腿肌肌纖維直徑，而每天注射溶于生理鹽水的200 μg/kg LPS則對(duì)雛鴨體重和腿肌肌纖維發(fā)育幾乎沒(méi)有影響，此外，高濃度外源性的LPS會(huì)導(dǎo)致鴨的采食量下降，體重降低，對(duì)肝臟、脾臟有一定的損傷。研究結(jié)果為揭示環(huán)境內(nèi)毒素對(duì)山麻鴨早期生長(zhǎng)發(fā)育的影響提供了理論依據(jù)，為今后改善飼養(yǎng)環(huán)境，提升山麻鴨飼養(yǎng)效率提供了借鑒。