潘峰，阮國永，楊建波，朱欣婷，劉云,*

（1.遵義醫(yī)科大學生命科學研究院，貴州遵義 563000）（2.貴州光正制藥有限責任公司，貴州貴陽 550000）（3.遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，貴州遵義 563000）

吳茱萸（Tetradium ruticarpum(A.Juss.) T.G.Hartley）為蕓香科（Rutaceae）吳茱萸屬（Tetradium）植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，也是《中國藥典》2020版（一部）吳茱萸藥材的主要基原植物。吳茱萸近成熟的果實具有健脾和胃、疏肝下氣、散寒止痛、燥濕止瀉的功效，用于咽喉腫痛、口舌生瘡、高血壓等病癥的治療，并具有較高的產(chǎn)值[1,2]。藥用植物多糖為藥用植物的重要活性成分之一，表現(xiàn)出眾多的生理活性，如抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、抗菌、抗病毒、降血糖血脂等[3,4]。吳茱萸多糖作為吳茱萸水煮液中主要成分，提取率可以達到21.01%[5]。但是目前，制藥工業(yè)上主要是從吳茱萸中提取吳茱萸生物堿、苦味素、萜類、黃酮等成分[6,7]，吳茱萸多糖多作為廢棄物處理。已有研究表明吳茱萸多糖具有較強的清除羥自由基的作用[8]，對胃潰瘍有治療作用[9]，有良好的抑菌、殺菌活性等[10]。但是由于吳茱萸粗多糖提取物中含有較多的色素、蛋白質等雜質，對于吳茱萸后續(xù)研究和產(chǎn)品開發(fā)造成了嚴重不利影響，選擇合適的除雜工藝對吳茱萸多糖深入研究和工業(yè)化生產(chǎn)非常重要。

植物多糖除雜要同時兼顧脫色素和脫蛋白質效率，也要減少多糖損失，同時避免劇烈反應給多糖結構等帶來影響。雙氧水法和活性炭吸附法常用來除色素，但是前者通過氧化色素實現(xiàn)脫色目的，不能真正去除色素，且容易造成多糖降解；后者對多糖的吸附能力較大，易造成多糖損失，其炭粉不易除去，成本較高。Sevag 法、酶法等多用來除多糖蛋白質等雜質，Sevag 法盡管對多糖結構破壞較小，但是每一次只能清除少量蛋白，效率較低，而酶法清除蛋白對條件要求較高，會降解糖蛋白部分，破壞其結構。大孔吸附樹脂是近年來發(fā)展起來的一種具有較多優(yōu)點的高分子吸附材料，不含離子交換基團，具有大孔網(wǎng)狀結構和較大比表面積，不溶于酸、堿、有機溶劑，選擇性較強，作用條件溫和，對環(huán)境影響小，可重復利用，在多糖的純化過程中越來越多地被選用[11,12]，在對多糖純化效率上甚至高于活性炭，例如廖春燕對車前草多糖的脫色工藝的研究就發(fā)現(xiàn)大孔吸附樹脂脫色效果優(yōu)于活性炭脫色效果[13]。但是大孔吸附樹脂種類較多，吸附特征（吸附能力，吸附選擇性等）與植物多糖種類密切相關。開發(fā)一種高效、快捷、環(huán)保的可工業(yè)化生產(chǎn)的大孔樹脂對吳茱萸多糖精制工藝具有重要理論和實踐價值。

1 材料與方法

1.1 主要設備和試劑

1.1.1 主要設備

LYOQUEST PLUS-85 真空冷凍干燥機，西班牙泰事達科技公司；Biometra Tone 96G 梯度PCR 儀，德國耶拿分析儀器股份公司；PH700 pH 計，新加坡優(yōu)特儀器有限公司；N-1300D-WD 旋轉蒸發(fā)儀，日本EYELA(東京理化)東京理化器械株式會社；DZKW-S-6（雙列6 孔）電熱恒溫水浴鍋，上海浦東物理光學廠；SB25-12D 超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；HDL-40B 臺式低速水平離心機，中國金壇鴻科；I3X 多功能酶標儀，美國美谷分子儀器有限公司；905-ULTS 超低溫冰箱，美國Thermo Fisher；LC-20AT 高效液相色譜儀，日本島津；ELSD檢測器、美國Alltech；Agilent-400 MHz 的核磁共振儀、美國Agilent；Varian 1000 系列傅立葉變換紅外分光光度計，美國Scimitar series。

1.1.2 主要試劑

DNA 提取試劑盒購買于北京索萊寶科技有限公司；X-5、AB-8、S-8、D-101、HP-20、DW-301、APD-100不同型號樹脂購買于東鴻化工有限公司；T-系列葡聚糖（T-1、T-7、T-50、T-100 和T-200）購買于Pharmacia公司；重水（D2H）購買于河北百靈威超精細材料有限公司；NaOH、HCl、NaOH、95%乙醇、苯酚、硫酸等為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗材料收集與鑒定

植物材料于2019 年秋季采自貴州省畢節(jié)市野生吳茱萸近成熟果實。45℃干燥后取吳茱萸種皮0.50 g，用液氮研磨成粉末，根據(jù)索萊寶植物基因組DNA提取試劑盒說明書步驟，提取吳茱萸DNA，用1%（W/V）濃度的凝膠電泳檢查提取的DNA，用通用引物P1（5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC -3'）和P2（5'-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG -3'）進行PCR 擴增，PCR 反應體系和條件參考文獻[14]所述。對擴增出來的PCR 產(chǎn)物進行切膠純化后送交生工生物工程（成都）有限公司正反雙向測序，將所測序列利用DNAMAN v6.0.3.99 軟件進行組裝后，提交到NCBI Genebank 數(shù)據(jù)庫上進行BLAST 比對，根據(jù)比對結果選取相似度最大且具有代表性的序列，利用MEGA 5.10 軟件采用Neighbor-joining（NJ）法進行聚類分析。

1.3 粗多糖的提取

首先，將采集到的野生吳茱萸近成熟果實曬干后，置于烘箱50℃干燥至恒重，粉碎后過40 目篩。吳茱萸粉末置于燒杯中，以料液比1:10（g/mL）加入95%乙醇，混勻后在室溫下超聲輔助提取2 h，用定性濾紙進行過濾，收集殘渣。以相同料液比再向殘渣中加95%乙醇，并進行超聲，以上乙醇脫脂步驟重復3 次，以充分除去粉末中脂溶性物質，然后收集殘渣，50℃烘干備用。隨后，以料液比1:30（g/mL）向干燥脫脂后的吳茱萸果實殘渣中加入80℃預熱蒸餾水，放置于80℃恒溫水浴鍋水浴2 h，用8 層紗布對水溶液進行過濾，收集濾液。濾液50℃減壓蒸發(fā)濃縮至原體積的1/4，然后，加入4 倍體積95%乙醇，4℃靜置過夜沉淀，4000 r/min 離心10 min，收集沉淀。沉淀物于-80℃冷凍5 h 后，放置在真空冷凍干燥機內凍干，即得到吳茱萸果實熱提粗多糖。

1.4 吸附效率評價指標

1.4.1 脫色率測定

吸取待測多糖溶液100 μL 于96 孔板，用酶標儀測量其420 nm 處吸光度，根據(jù)如下公式計算脫色率：

式中：OD前為大孔樹脂處理前多糖溶液在420 nm 處的吸光度值；OD后為大孔樹脂處理后多糖溶液在420 nm 處的吸光度值。

1.4.2 蛋白質清除率

蛋白質含量采用二喹啉甲酸法（BCA）[15]測定，以牛血清蛋白為標準品，確定其線性回歸方程和相關系數(shù)。為確保結果準確，每測一次都有建立新的標準曲線和回歸方程。蛋白清除率使用下面的公式來計算：

式中：C前為大孔樹脂處理前多糖溶液中的蛋白質含量；C后為大孔樹脂處理后多糖溶液中的蛋白質含量。

1.4.3 糖保留率

多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，以葡萄糖為標準品，確定其線性回歸方程和相關系數(shù)。為確保結果準確，每測一次都有建立新的標準曲線和回歸方程。多糖保留率使用下面的公式來計算：

式中：M前為大孔樹脂處理前多糖溶液中的多糖含量；M后為大孔樹脂處理后多糖溶液中的多糖含量。

1.4.4 綜合隸屬度

以上三種指標反應的是三個方面的信息，為了對每一種吸附特性進行直接比較，在此引入隸屬度函數(shù)[16]，具體公式為：

式中：x，xmax（最大值）和xmin（最小值）屬于色素清除率（j=1）、蛋白質清除率（j=2）和糖保留率值（j=3）。然后將色素清除率隸屬度值、蛋白質清除率隸屬度值和糖保留率隸屬度值求和得到綜合隸屬度值（Y），根據(jù)其大小判斷其綜合吸附性能，該值越大表明其綜合吸附能力越強。

1.5 樹脂類型的篩選

大孔吸附樹脂先用質量分數(shù)為5%的HCl 浸泡6 h，使其充分溶脹，再用蒸餾水沖洗至中性；然后用質量分數(shù)為5%的NaOH 浸泡6 h，再用蒸餾水沖洗至中性；而后用質量分數(shù)為95%的乙醇浸泡樹脂6 h，最后用蒸餾水洗至無醇味。準確稱取大孔吸附樹脂（X-5、AB-8、S-8、D-101、HP-20、DW-301、APD-100）2.00 g，加入20 mL 濃度為5.00 mg/mL 的粗多糖溶液，密封后，37℃搖床恒溫振蕩40 min，測定并計算不同樹脂對樣品脫色率、蛋白質去除率及多糖保留率，采用綜合隸屬度函數(shù)確定最佳吸附樹脂種類。

1.6 吸附條件優(yōu)化單因素試驗

1.6.1 濃度選擇

配制一系列濃度（1.00、2.00、3.00、4.00、5.00和6.00 mg/mL）的吳茱萸果實熱提粗多糖溶液，取20 mL 于離心管中，分別加入2.00 g 經(jīng)預處理的最佳吸附大孔樹脂，37℃搖床150 r/min 恒溫振蕩40 min，測定并計算溶液脫色率、蛋白質清除率及多糖保留率，采用綜合隸屬度函數(shù)確定最佳吸附濃度。

1.6.2 pH 值選擇

利用HCl 或NaOH 調節(jié)不同pH 值水溶液（pH=4、5、6、7、8、9、10），并分別配制最佳吸附濃度的吳茱萸果實熱提粗多糖溶液，取20 mL 于離心管中，分別加入2.00 g 經(jīng)預處理的最佳吸附大孔樹脂，37℃搖床恒溫150 r/min 振蕩40 min，測定并計算溶液的脫色率、蛋白質清除率及多糖保留率，根據(jù)綜合隸屬度函數(shù)值確定最佳pH 值。

1.6.3 溫度選擇

選用上述優(yōu)化后濃度和pH 基礎上，取樣品各20 mL，分別在20、25、30、35、40 和45℃預熱，分別加入2 g 樹脂，在相應的溫度下恒溫150 r/min 振蕩40 min，測定并計算溶液的脫色率、蛋白質清除率及多糖保留率，根據(jù)綜合隸屬度函數(shù)值確定最佳吸附溫度。

1.7 吸附條件優(yōu)化響應面實驗

以單因素試驗為基礎，以樣品溶液濃度、初始pH值和吸附環(huán)境溫度為考察因素，利用Design-expert 8.0.6.1 軟件的Box-Behnken 方法優(yōu)化影響大孔吸附樹脂吸附特性的主要因素參數(shù)，進行3 因素3 水平的試驗設計，以綜合隸屬度值為響應值，分析最佳吸附條件，并驗證。試驗設計因素及水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken 設計因素及水平表 Table 1 The coded and actual levels of variables for Box-Behnken design

1.8 柱色譜流速優(yōu)化

選用經(jīng)預處理篩選出的最佳吸附大孔樹脂，采用濕法裝柱（2.90×8.00 cm），依據(jù)最佳濃度和pH 值優(yōu)化結果配制云實根粗多糖溶液適量，并在優(yōu)化的溫度條件下，以1.50、2.00、2.50 和3.00 BV/h 流速過柱，每10.00 mL 收集一管，共收集10 管，為排除吸附柱內水分影響，測量第3～10 管溶液的脫色率、蛋白質清除率及多糖保留率，采用綜合隸屬度函數(shù)確定最佳流速。根據(jù)優(yōu)化得到的條件對多糖進行純化，并且測定流速優(yōu)化后色素和蛋白清除率、多糖保留率。

1.9 多糖結構特征分析

1.9.1 分子量分布分析。

取經(jīng)過優(yōu)化條件下吸附除雜后多糖和未除雜多糖，利用高效液相凝膠滲透色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPGPC-ELSD）法檢測吸附前后樣品分子量分布。所用設備為日本島津LC-20AT 高效液相色譜儀系統(tǒng)配以TSK-gel GMPWxl 凝膠（7.80 mm ID×30.00 cm）色譜柱及ELSD 檢測器。流動相為水，流速0.70 mL/min；ELSD 檢測器參數(shù)：以氮氣為載氣，壓力在350 kPa 左右，漂移管溫度115℃；樣品進樣量為10 μL。取一定量的多糖配成約1.00 mg/mL 的溶液，再用0.45 μm 的濾膜過濾進行色譜分析。同時以標準T-系列葡聚糖（T-1、T-7、T-50、T-100 和T-200）在相同條件下進行HPGPC-ELSD 分析，繪制標準曲線，得到線性關系及擬合公式 ln(Mw)=-22.04ln(RT) +64.46，R2=0.9913，其中l(wèi)n(Mw)為標準葡聚糖分子量的自然對數(shù)，RT 為其在色譜圖上的保留時間。

1.9.2 紫外吸收特征分析

取吳茱萸熱提多糖吸附前后的樣品適量溶于蒸餾水后配成1.00 mg/mL 溶液，轉入石英96 孔板，并于230～700 nm 范圍內用SpectraMax? i3x 多功能酶標儀進行紫外掃描，根據(jù)260 和280 nm 等處是否有吸收峰判斷是否有核酸和蛋白質、多肽等物質。

1.9.3 FT-IR 光譜特征分析

稱取吳茱萸熱提多糖吸附前后的多糖樣品粉末3 mg 左右，用KBr 法壓片，在4000～400 cm-1的紅外區(qū)間于Varian 1000 系列傅立葉變換紅外分光光度計進行掃描。

1.9.41H NMR 分析

取吳茱萸熱提多糖吸附前后的樣品粉末（約10 mg）溶于0.80 mL 重水（D2O）中，在Agilent-400 MHz的核磁共振儀上測定其核磁信號。

1.10 數(shù)據(jù)處理

測試平行3 次，顯著性差異采用SPSS 19.0 Duncan’s multiple range test 分析（p<0.05）；試驗結果以平均值±標準差表示。聚類分析在MEGA 5.10 軟件上進行；統(tǒng)計分析作圖均在Office Excel 2016 software軟件上進行；響應面分析在Design-expert 8.0.6.1 軟件上進行；1H NMR 數(shù)據(jù)處理在軟件MestReNova 進行。

2 結果與分析

2.1 樣品鑒定

樣品經(jīng)肉眼觀察，如圖1a 所示，比對《中國植物志》初步判斷為蕓香科（Rutaceae）吳茱萸屬（Tetradium）吳茱萸[T.ruticarpum(A.Juss.) T.G.]Hartley 植物的果實。隨后通過引物擴增并組裝后得到其 ITS序列，利用在線（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/）提交到NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫上，得到序列編號（Accession No.）：MT229431。將其在NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)上進行Blast 比對后發(fā)現(xiàn)其與Tetradium ruticarpumclone YSQ4（Accession No.EU663536.1）相似度最大，達到98.61%。同時，采用MEGA 5.10 軟件用N-J 構建系統(tǒng)進化樹，自展值設為1000，得到系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1b 所示。根據(jù)Blast 比對結果和系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果，以及其形態(tài)特征，鑒定所收集的樣品為蕓香科（Rutaceae）吳茱萸屬（Tetradium）吳茱萸（T.ruticarpum）植物的果實。

圖1 吳茱萸果實形態(tài)（a）和其ITS 區(qū)堿基序列構建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap=1000）（b）Fig.1 The fruit morphology (a) of T.ruticarpum and neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree (b) based on ITS region sequences of T.ruticarpum (bootstrap=1000)

2.2 樹脂類型的篩選

大孔吸附樹脂具有理化性質穩(wěn)定，耐強酸強堿，不溶于水及常見有機溶劑的性質，可通過樹脂表面作用及形成氫鍵作用選擇性吸附。研究表明大孔吸附樹脂在其它多糖的除雜過程中表現(xiàn)優(yōu)異，如對瓦布貝母內生真菌WBS020 胞外多糖有很好的純化效果[17]。但是大孔吸附樹脂類型多樣，具有不同的吸附特征，其中樹脂的結構和極性是影響其吸附效能的關鍵因素[18]。為了得到合適的吸附樹脂類型，選用了市場上較為常見且價格較低的7 種樹脂進行篩選，其具有不同粒徑，不同極性。進行靜態(tài)吸附，并測量其色素和蛋白質的清除效率，及多糖保留率。由于此三類值具有不同的意義，反映的是三個方面的指標，此處引用隸屬度函數(shù)，進行歸一化，計算每個測量值在0～1 的位置，值越大表示活性越好，將每一種測量指標歸一化處理后，進行相加得綜合隸屬度值，隸屬度值越高表示其吸附性能越好[19]。結果如圖2 所示，樹脂S-8 表現(xiàn)出最佳的吸附性能，其綜合隸屬度顯著高于AB-8、APD100、DM101 和X-5（p<0.05），而與D101 和HP-20相比，盡管其差異不顯著，但是S-8 的綜合隸屬度絕對值仍較高，為了達到最佳的吸附效率，后續(xù)試驗選擇S-8 作為吳茱萸熱提粗多糖除雜的最佳樹脂。Hu 等[20]對Carex meyerianaKunth 多糖研究發(fā)現(xiàn)，S-8 和AB-8 樹脂均表現(xiàn)出最佳的多糖純化效果，同樣，吳玉和[21]研究發(fā)現(xiàn)，利用D301T 和S-8 純化后的甘草多糖的蛋白、色素含量顯著降低，透析后多糖純度可達到80%以上?？梢奡-8 大孔吸附樹脂在多糖的純化中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。

圖2 不同樹脂靜態(tài)吸附綜合隸屬度值(p<0.05) Fig.2 Comprehensive membership values of static adsorption using different macroreticular resins (p<0.05)

2.3 吸附條件優(yōu)化

樹脂的吸附受溫度、pH 值，樣品濃度和接觸時間的影響。合適的環(huán)境溫度、pH 值，樣品濃度和流速對提高樹脂對多糖的純化效率非常重要。而且由于樹脂種類和多糖類型不同，最佳的樹脂吸附參數(shù)也不相同。例如Shi[22]在研究利用大孔吸附樹脂D941 除香椿芽多糖雜質時，對溫度、樣品濃度、pH 值等影響因素考察發(fā)現(xiàn)，隨著溫度、初始樣品濃度和初始pH 值的增加其綜合吸附效率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，分別在溫度為45℃、初始樣品濃度為30 mg/mL 和初始pH為8.50 時達到一個較好的綜合吸附效率。劉富崗等[23]研究了大孔吸附樹脂對澤蘭多糖除雜工藝，并發(fā)現(xiàn)HPD-100 樹脂在樣品濃度為0.03 g/mL，洗脫流速為1.10 mL/min，洗脫體積為40 mL 時，多糖保留率69.21%，脫色率60.24%，蛋白脫除率75.67%。

2.3.1 靜態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.3.1.1 單因素實驗

如附圖3a 所示，隨著粗多糖濃度的增加，綜合隸屬度值呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢。表明S-8 大孔吸附樹脂對吳茱萸多糖的吸附綜合指數(shù)隨濃度而變化，在濃度為4.00 mg/mL 或其附近時，其綜合吸附能力最佳。如附圖3b 所示，隨著粗多糖濃度的增加，綜合隸屬度值呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢。表明S-8 大孔吸附樹脂對吳茱萸多糖的吸附綜合指數(shù)隨pH增加而變化，在pH 為6 或其上下時，其綜合吸附能力最佳。如附圖3c 所示，隨著粗多糖環(huán)境溫度的增加，綜合隸屬度值也呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢。表明S-8 大孔吸附樹脂對吳茱萸多糖的吸附綜合指數(shù)隨環(huán)境溫度變化而變化，在溫度為25℃或其上下時，其綜合吸附能力最佳。綜上，通過單因素實驗得到大孔吸附樹脂S-8 對吳茱萸果實熱提多糖除雜條件為：多糖濃度4.00 mg/mL，初始pH 為6.0，吸附時環(huán)境溫度為25℃。但是因為單因素實驗忽略了因素之間的交互作用，同時無法給出精確的最佳實驗參數(shù)。例如，劉富崗等[23]對澤蘭多糖大孔吸附樹脂除雜工藝的研究發(fā)現(xiàn)，通過單因素得到的最佳條件為樣品濃度0.03 g/mL，流速1 mL/min，洗脫體積為40 mL，但是通過相應面法優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)最佳條件為濃度0.03 g/mL，流速為1.06 mL/min，洗脫體積為40.63 mL，通過比較，發(fā)現(xiàn)二者盡管接近，但是仍存在差距，可見僅僅依靠單因素實驗并不能最大程度優(yōu)化純化工藝參數(shù)。

圖3 樣品濃度（a）、初始pH 值（b）和溫度（c）對S-8 大孔吸附樹脂除多糖雜質綜合隸屬度值的影響 Fig.3 Effect of sample concentration (a),initial pH value (b) and temperature (c) on the comprehensive membership values for removing polysaccharide impurities using S-8 macroporous adsorption resin

2.3.1.2 響應面法分析

采用BBD 響應面法設計得到17 組試驗，結果見表2。回歸模型方差分析見表3。利用Box-Behnken響應面法設計，得到吳茱萸多糖綜合隸屬度值（Y）與多糖濃度（A）、溶液pH 值（B）、吸附環(huán)境溫度（C）的二元多項回歸方程：Y=-12.2275+2.493A-0.108B+0.7615C-0.09AB+0.027AC+0.044BC-0.306A2-0.061B2-0.02264C2，R2=0.9141。由回歸模型的方差分析發(fā)現(xiàn)，回歸項p<0.01，即回歸模型極顯著相關；失擬項0.0924>0.05，即模型失擬合度檢驗不顯著，模型擬合度較好。此外，方程的相關系數(shù)R2=0.9141 表明，S-8大孔吸附樹脂對吳茱萸果實熱提粗多糖的色素和蛋白清除效率以及糖的保留能力綜合值有91.41%是由所選變量、樣品濃度、樣品pH 值、吸附時環(huán)境溫度所決定?；貧w模型中A、A2、BC、C2顯著，B、C、AB、AC、B2不顯著，說明樣品濃度、溶液pH 值和吸附時環(huán)境溫度不同對S-8 大孔吸附樹脂吸附吳茱萸果實熱提多糖吸附特性的影響存在非線性關系，而各因素之間的交互作用影響程度不同。由此可見，回歸模型可以用來分析和預測S-8 大孔吸附樹脂對吳茱萸果實熱提粗多糖的選擇性吸附能力。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果 Table 2 The design and results of Box-Behnken test

表3 回歸模型方差分析 Table 3 Regression analysis of variance

當固定溶液濃度、溶液初始pH 值和吸附環(huán)境溫度中的一個因素，另外兩個因素之間的交互作用對綜合隸屬度值的影響如附圖4 所示，可由相應曲面圖和等高線圖表示，等高線圖越接近于橢圓形表示兩因素交互作用越顯著。

圖4 pH 值（b）、溫度（c）與樣品濃度（a）兩兩組合對多糖純化的綜合隸屬度值的的響應面與等值線 Fig.4 Surface plots (a,c,and e) and contour plots (b,d,and f) showing the interactive effects of pH (b),temperature (c) and sample concentration (a) on the comprehensive membership value of the polysaccharide purification

由回歸方程模型和其對應的響應面分析圖，并結合方差分析表可得，F(xiàn)A=7.68、FB=2.37、FC=0.13×10-1。由于因素對應的F 值大小與因素對試驗指標的影響程度成正比，因此，影響S-8 大孔吸附樹脂吸附吳茱萸果實熱提多糖的吸附性能的順序為：溶液濃度（A）>溶液初始pH 值（B）>吸附環(huán)境溫度（C）。根據(jù)回歸方程模型，得到的最佳方案為：溶液濃度為4.41 mg/mL，溶液初始pH 值為5，吸附環(huán)境溫度24.30℃。

2.3.1.3 驗證試驗

根據(jù)試驗設計中最佳方案，結合到實際情況，修正試驗操作設置的條件：溶液濃度為4.41 mg/mL,溶液初始pH 值為5，吸附環(huán)境溫度24.30℃，4 次重復試驗，實得大孔吸附樹脂除吳茱萸多糖雜質的綜合隸屬度為2.10，近似于Design-expert 8.0.7.1 Trail 軟件計算所得理論值2.14，在此條件下，色素清除率為41.89%，蛋白清除率為57.04%，而多糖保留率為83.63%，響應面法優(yōu)化所得的回歸方程具指導意義。盡管相較于其它研究，本文所優(yōu)化吸附條件在色素清除率和蛋白清除率上并不是最高，但是較高多糖保留率可以滿足樣品重復過柱，從而達到較高的除雜效率。這種重復通過樹脂除雜的方法在瓦布貝母多糖的除雜過程也起到了較好的效果[24]。

2.3.2 動態(tài)吸附條件優(yōu)化

通常，在實驗室或工業(yè)化生產(chǎn)過程中，為了實現(xiàn)樣品的持續(xù)純化，會選用柱色譜的方式進行除雜。樣品以動態(tài)形式通過樹脂過程中，雜質被連續(xù)吸附，而多糖成分隨著溶劑流出，從而連續(xù)得到除雜純化的多糖。吸附時間可以影響樹脂的吸附效率，選擇系數(shù)等[22]。在動態(tài)吸附過程中，流速過慢，樹脂與樣品接觸時間過長，吸附時間較長，會增加對多糖的吸附，從而降低多糖保留率；同樣，當流速過快，樹脂與樣品接觸時間過短，色素或蛋白等雜質還未完全吸附，就已經(jīng)流走，不利于色素和蛋白質的清除。因此適當?shù)牧魉賹渲叫视兄匾绊?。如圖5 所示，盡管不同洗脫速率洗脫出的樣品在不同接收管中存在差異，但是總體而言流速2.00 BV/h 時，其洗脫出的樣品均具有較高的綜合隸屬度值，表現(xiàn)出最佳吸附效率。粗多糖以流速2.00 BV/h 過柱，收集純化后樣品，測得色素清除率為49.21%，蛋白清除率為68.97%，多糖保留率為55.05%。從圖5 還可以發(fā)現(xiàn)流速過低或者過高均不利于S-8 大孔吸附樹脂的除雜。同樣，Hu 等[20]對Carex meyerianaKunth 多糖的AB-8 大孔吸附樹脂除雜研究發(fā)現(xiàn)，在流速1.88 BV/h 時，吸附效率最好，而Shi[22]對流速優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，在1.88 BV/h 時，D941樹脂對香椿芽多糖綜合除雜效率最高?？梢?，流速的大小并不完全一致，受到樹脂和多糖類型的影響而具有較大差異。本文所篩得的最佳流速僅適用于S-8 大孔吸附樹脂對吳茱萸果實熱提粗多糖的除雜。

圖5 S-8 大孔吸附樹脂對多糖溶液除雜綜合隸屬度的動態(tài)泄漏曲線 Fig.5 The dynamic leakage curves of the comprehensive membership value for the polysaccharide solution on S-8 resin

2.4 吸附前后結構變化

利用UV 掃描分析發(fā)現(xiàn)，如圖6a 所示，未除雜多糖在430 nm 以下具有較強的吸收，且在280 nm 處有一個較強的吸收峰，表明粗多糖樣品中不僅含有較多色素，而且也存在大量蛋白質等雜質，吸附后，430 nm 以下波長的吸收強度明顯降低，280 nm 處吸收峰也明顯減小，表明經(jīng)過S-8 大孔吸附樹脂吸附后，色素和蛋白質已經(jīng)被大量清除。由圖6b、c 所示，樹脂吸附前粗多糖HPGPC色譜圖上有兩個峰，且峰形較寬，主峰中伴有裂分，這可能是由于較多雜質造成。而經(jīng)過樹脂吸附后同樣出現(xiàn)兩個主峰，保留時間與吸附前樣品的主峰基本一致。兩主峰的RT 分別約為6.80 和11.80 min，由公式及所選標準葡聚糖分子量范圍可以推測，第一個峰的相對分子質量大于2.00×105u，第二個峰相對分子量約為2.35×104u。以上結果表明經(jīng)過樹脂吸附?jīng)]有發(fā)生切斷糖鏈的情況，吸附過程溫和。此外，吸附后峰的分布范圍變窄，表明具有分子量較一致的多糖在柱色譜分離過程中受到的干擾較少，樹脂可以有效的清除大部分雜質，純化多糖。吳茱萸熱提多糖S-8 樹脂吸附前后的FT-IR 光譜圖如圖6d 所示。在3410 cm-1處的強吸收為羥基的伸縮振動。在2930 cm-1處為-CH2基團的C-H的伸縮振動吸收峰[25]。1645 cm-1處可能為C=O 的不對稱伸縮振動導致的吸收峰[26]，表明多糖中可能存在-COOH 基團。1405 cm-1處的吸收峰歸因于C-H 面內的彎曲振動[27]。在1100 cm-1附件較寬的吸收峰歸因于C-O 官能團的彎曲或拉伸振動。這些都是多糖的特征吸收峰，從圖6d 吸附前后多糖的FT-IT 吸收光譜上可以判斷，以上特征吸收信號均一致，表明吸附前后吳茱萸果實熱提多糖主要官能團結構未發(fā)生改變。但是吸附后樣品的吸收信號更強，受干擾較小，也說明大孔吸附樹脂具有較好的清除雜質作用。對樣品進行1H NMR 分析，如圖6e、f 所示，在吸附前后樣品的1H NMR 圖譜指紋區(qū)，均有2 個主要的異頭氫信號，分別是δ5.04×10-6和δ4.42×10-6。化學位移在δ4.4×10-6～5.0×10-6范圍為β-糖苷異頭氫構型，而δ5.00×10-6～5.40×10-6范圍為α-糖苷異頭氫構型[28]，可見吳茱萸熱提多糖存在β-或α-糖苷異頭氫構型，而這個結構特征在吸附前后未發(fā)生改變。綜上，利用大孔吸附樹脂S-8 對吳茱萸果實熱提多糖進行吸附除雜，不僅能明顯清除其中的色素和蛋白質等雜質，而且不會引起多糖鏈的斷裂，多糖結構的改變。

圖6 S-8 大孔吸附樹脂吸附前后多糖的紫外吸收譜（a）、HPGPC色譜圖（b、c）、FT-IR 吸收譜圖（d）和1H NMR 譜圖（e、f）Fig.6 UV-vis spectrogram (a),HPGPC chromatogram (b,c),FT-IR spectrogram (d) and 1H NMR spectrum (e,f) of the polysaccharide solutions before and after absorption by resin S-8

3 結論

相較于X-5、AB-8、D-101、HP-20、DW-301、APD-100 大孔吸附樹脂，S-8 大孔吸附樹脂對吳茱萸果實多糖具有較好的綜合純化效率，在樣品濃度為4.41 mg/mL，初始pH 值為5，吸附環(huán)境溫度24.30℃，流速2.0 BV/h 的條件下具有最佳純化效率，該條件下色素清除率為49.21%，蛋白清除率為68.97%，多糖保留率為55.05%。且利用S-8 大孔吸附樹脂純化過程中，多糖的分子量分布，紅外吸收特征及糖鏈異頭氫吸收信號等均未發(fā)生明顯改變。本文表明利用S-8 大孔吸附樹脂可以有效地清除多糖色素和蛋白質等雜質，同時不會造成較多的多糖損失，而且整個吸附過程不需要高溫高壓，強酸或強堿，不涉及有機試劑，對環(huán)境幾乎無污染，滿足食品藥品工業(yè)的需求，通過比對吸附前后多糖結構特征，發(fā)現(xiàn)大孔吸附樹脂在除雜的同時并不會對多糖造成結構上的改變，這對純多糖制備和后續(xù)深入研究具有重要意義。