王慧娟 喬 楊 張 敏 彭禮軍

1.西南藥食兩用資源開發(fā)利用技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,貴州 貴陽(yáng) 550025；2.黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 興義 562400

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm. 的干燥塊根，中醫(yī)臨床常用補(bǔ)益藥[1]。近年來(lái)，人們對(duì)太子參化學(xué)成分進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究[2]。研究[3-6]表明，多糖是太子參的重要活性成份，具有抗應(yīng)激、抗氧化和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用，對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷和大鼠急性心肌梗死誘發(fā)的心肺損傷有一定的保護(hù)作用。

太子參多糖主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖等組成[7]。本研究在此基礎(chǔ)上，建立柱前衍生化-HPLC法測(cè)定太子參多糖中鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的含量，為太子參藥材質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的完善提供基礎(chǔ)。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，F(xiàn)A2004型分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)，GZX-9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，恒溫水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)。

太子參藥材(貴州百靈制藥有限公司)；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；葡萄糖(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，含量≥98.0%)；半乳糖(solarbio公司，含量≥99.0%)；鼠李糖(上海源葉生物科技有限公司，含量≥98.0%)、木糖(上海源葉生物科技有限公司，含量≥99.0%)；醋酸銨、氯仿、氫氧化鈉、甲醇、濃鹽酸、三氟乙酸均為分析純，乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 混合單糖對(duì)照品衍生化供試液制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖各100mg，加水溶解，定容至100 mL。

取對(duì)照品溶液1 mL，依次加入PMP甲醇溶液(0.5 moL·L-1)和NaOH溶液(0.2 moL·L-1)各0.5 mL，混勻，70 ℃水浴100 min，冷卻，加入鹽酸溶液(0.2 mol·L-1)中和，混勻，三氯甲烷洗滌3次，每次2 mL，取水層，離心后上清液用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 色譜柱選擇 分別采用waters C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種色譜柱，考察色譜柱對(duì)混合對(duì)照品衍生化供試液色譜峰的影響。結(jié)果表明，Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱能對(duì)各衍生化組分進(jìn)行很好地分離。具體如圖1所示。

1.waters C18 2.Agilent ZORBAX SB-C18 3.Agilent Eclipse XDB-C18

2.1.3 柱溫篩選 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，設(shè)定柱溫為25 ℃，30 ℃和35 ℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫越高，保留時(shí)間越短，出峰越快。為節(jié)約時(shí)間，選取柱溫為35 ℃。

2.1.4 流動(dòng)相考察 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，設(shè)定流動(dòng)相為乙腈-水、乙腈-乙酸銨溶液(0.01 moL·L-1)、乙腈-乙酸銨溶液(0.02 moL·L-1)和乙腈-乙酸銨溶液(0.05 moL·L-1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸銨對(duì)峰形及分離度有改善作用，濃度越高，峰形對(duì)稱性越好，但對(duì)設(shè)備損傷較大。綜合考慮，流動(dòng)相選取乙腈-乙酸銨溶液(0.02 moL·L-1)。

2.2 太子參多糖水解方法篩選

2.2.1 水解用酸的考察 取6份太子參多糖(自制)各10 mg，加水1.0 mL溶解，分別加入3、5、7 moL·L-1鹽酸和1、3、5 moL·L-1三氟乙酸溶液各1.0 mL，混勻，110 ℃水解1 h，放冷，NaOH溶液中和，得太子參多糖水解液。

取上述6份多糖水解液各1.0 mL，照“2.1.1”項(xiàng)下處理后測(cè)定，其結(jié)果見表1。

表1 多糖酸水解后各單糖衍生物的峰面積

實(shí)驗(yàn)表明，不同水解條件下4種單糖峰面積變化趨勢(shì)并不相同。綜合考慮，水解用酸選擇3 moL·L-1鹽酸溶液。

2.2.3 水解溫度考察 取3份太子參多糖各10 mg，加水1.0 mL溶解，分別加入鹽酸(3 mol·L-1)1.0 mL，混勻，分別在100 ℃、110 ℃、120 ℃水解1 h，放冷， NaOH溶液中和，得太子參多糖水解液。

取上述多糖水解液各1.0 mL，照“2.1.1”項(xiàng)下處理后測(cè)定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，水解溫度確定為110 ℃，其結(jié)果見表2。

表2 不同溫度水解多糖后各單糖衍生物的峰面積

2.2.4 水解時(shí)間考察 取3份太子參多糖各10 mg，加水1.0 mL溶解，加入鹽酸(3 moL·L-1)1.0 mL，混勻，于110 ℃分別水解30，60 和90 min，放冷， NaOH溶液中和，得太子參多糖水解液。

取上述多糖水解液各1.0 mL，照“2.1.1”項(xiàng)下處理后測(cè)定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，水解時(shí)間確定為30 min，具體見表3。

表3 不同水解時(shí)間對(duì)單糖衍生物峰面積的影響

2.3 衍生化方法的篩選

2.3.1 衍生化溫度的篩選 取太子參多糖水解液3份，每份1.0 mL，置10 mL具塞試管中，依次加入PMP甲醇溶液(0.5 moL·L-1)和NaOH溶液(0.2 moL·L-1)各0.5 mL，混勻，分別于40 ℃，70 ℃，95 ℃水浴100 min，處理后進(jìn)樣測(cè)定。綜合考慮各單糖峰面積，將衍生化溫度確定為70 ℃，具體見表4。

表4 衍生化反應(yīng)溫度對(duì)單糖峰面積的影響

2.3.2 衍生化時(shí)間的篩選 取太子參多糖水解液3份，每份各1.0 mL，依次加入PMP甲醇溶液(0.5 moL·L-1)和NaOH溶液(0.2 moL·L-1)各0.5 mL，混勻，于70 ℃水浴分別加熱30，60和100 min，處理后進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)各單糖峰面積的大小確定衍生化時(shí)間為100 min，具體見表5。

表5 衍生化時(shí)間對(duì)單糖峰面積的影響

2.4 太子參藥材中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.02 moL·L-1的乙酸銨溶液(19∶81)；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2 供試品溶液的制備及測(cè)定 供試品溶液的制備 精密稱取太子參粉末0.2 g，置索氏提取器中，用80 mL乙醇回流提取1 h。過(guò)濾，濾渣揮干乙醇后，加水40 mL回流提取4 h，趁熱抽濾，再加水30 mL回流提取2 h，抽濾，合并濾液，定容至100 mL。精密吸取1 mL定容至10 mL，作為供試品溶液。

測(cè)定法：取太子參供試品溶液1 mL，加鹽酸溶液(3.0 moL·L-1)1 mL，混勻，110 ℃水解30 min，放冷，NaOH溶液調(diào)pH值至中性。取1 mL，依次加入PMP甲醇溶液(0.5 mol·L-1)和NaOH溶液(0.2 moL·L-1)各0.5 mL，混勻，70 ℃水浴加熱100 min，冷卻，鹽酸溶液(0.2 moL·L-1)中和后定容至5 mL，混勻，三氯甲烷洗滌3次，每次2 mL，取水層，離心后將上清液過(guò)濾，取續(xù)濾液，測(cè)定，即得。

2.4.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品液、供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖(見圖2)。從圖中可見，供試品溶液和對(duì)照品溶液中鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的保留時(shí)間一致，且供試品溶液中各待測(cè)峰的分離度符合要求。

A.混合單糖對(duì)照品溶液;B.供試品溶液

2.4.4 線性關(guān)系考察 取四種單糖濃度均為1 mg·mL-1的混合單糖對(duì)照品溶液，衍生化處理后測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量x(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸得到四種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表6。

表6 四種單糖衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取太子參藥材(1號(hào))0.2 g，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各單糖的峰面積，結(jié)果見表7。RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

表7 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取太子參藥材(1號(hào))0.2 g，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果見表8。

表8 重復(fù)性試驗(yàn)

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取太子參藥材(1號(hào))0.2 g，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于衍生化后0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果列入表9。RSD均小于2%，說(shuō)明供試液衍生化后在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測(cè)定含量的樣品(樣品編號(hào)1號(hào))各0.1g，置索氏提取器中，加乙醇回流提取1 h，濾渣揮干乙醇，再精密加入適量的鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖對(duì)照品，按照 “2.4.2”項(xiàng)下處理后測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表10～13。

表10 加樣回收率試驗(yàn)(鼠李糖)

2.4.9 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地的太子參藥材樣品，分別制備供試品溶液后測(cè)定，結(jié)果見表14。

表11 加樣回收率試驗(yàn)(葡萄糖)

表12 加樣回收率試驗(yàn)(半乳糖)

表13 加樣回收率試驗(yàn)(木糖)

表14 太子參藥材中各單糖含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明：各批次太子參的單糖含量懸殊不是很大，且皆呈現(xiàn)出同樣趨勢(shì)：其含量木糖﹥半乳糖﹥鼠李糖﹥葡萄糖。各批次藥材中木糖和半乳糖含量均在10%以上，葡萄糖含量較低，大多在5%以下。

3 討論

本文采用柱前衍生化-HPLC法對(duì)太子參藥材中的鼠李糖、葡萄糖、半乳糖以及木糖進(jìn)行測(cè)定，分別對(duì)液相色譜條件、多糖水解和衍生化條件進(jìn)行了優(yōu)化，比較了不同條件下單糖衍生物的峰形、分離度、峰面積大小變化等，最終確定了太子參藥材中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量測(cè)定方法。

對(duì)所建方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性均較好(回歸系數(shù)0.9999)，精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于3%。在加樣回收率試驗(yàn)中，鼠李糖、半乳糖和木糖的平均回收率在95%～105%之間，且RSD﹤3%，符合要求。但葡萄糖的回收率偏低，平均值為86.04%，這可能與太子參藥材中葡萄糖含量較低且樣品前處理過(guò)程比較復(fù)雜有關(guān)。因此，在后續(xù)的太子參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作中，可優(yōu)先考慮將含量較高的鼠李糖、半乳糖和木糖納入質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

本文的研究工作，可為今后太子參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充完善提供研究基礎(chǔ)及數(shù)據(jù)支撐，對(duì)太子參的質(zhì)量控制具有一定的價(jià)值和意義。