王懷剛 王懷偉 白雅靜

1.呼倫貝爾市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)扎蘭屯市人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 扎蘭屯 162650

泵嘎日-17為呼倫貝爾市中蒙醫(yī)院自制制劑，處方由黃柏、麥冬、人工牛黃、熊膽粉、紫花地丁等17味藥組成，具有清熱解毒的功效，臨床適用于急性膽囊炎的治療，在蒙醫(yī)醫(yī)院臨床為長期使用的制劑，臨床療效顯著[1]。蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膽為希拉之物質(zhì)基礎(chǔ)，具有消化之功能，據(jù)希拉之位的腑器，也是病變希拉竄行之道。因此，膽病多由希拉熱引起。據(jù)《四部醫(yī)典》記載“當(dāng)醫(yī)治肺、肝、膽病時(shí)，應(yīng)以清熱邪為主”[2]。方中熊膽具有清熱解毒、止痛、明目之功效，臨床用于治療肝熱熾盛，熱極生風(fēng)所致的驚風(fēng)，抽搐。肝熱，目赤腫痛， 以及用于瘡癰腫痛等癥[3]。而黃柏具有清熱燥濕、瀉火解毒、消腫祛腐的功效。臨床用于治療濕熱瀉痢、黃疸、帶下、熱淋、痔漏、盜汗、遺精等癥[4]。兩味藥在本方治療急性膽囊炎中發(fā)揮主藥作用。研究采用薄層色譜法和高效液相色譜法對制劑中的熊膽和黃柏進(jìn)行定性與定量研究，經(jīng)方法驗(yàn)證確定了理想的實(shí)驗(yàn)條件，表明該方法重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，并且方中其他成分無干擾，對泵嘎日-17的質(zhì)量控制起到了很好的效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器 KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D 型電子分析天平；Sartorius BS224S型電子分析天平；202型電熱恒溫干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；島津LC-20AT高效液相色譜儀。

1.2 材料 泵嘎日-17制劑由呼倫貝爾市中蒙醫(yī)院制劑室提供；鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201212 含量：86.7%)、熊去氧膽酸對照品(批號：110755-201704)、鵝去氧膽酸對照品(批號：110806-201708)和膽酸對照品(批號：100078-201415)均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 熊膽的薄層色譜鑒別

2.1.1 對照品溶液的制備 取熊去氧膽酸、膽酸、鵝去氧膽酸對照品，分別加甲醇制成每1 mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備 取本品粉末1g，加30 mL甲醇，溫?zé)崾谷芙?，放冷，過濾，濾液蒸干，加10 mL氫氧化鈉溶液(1→ 5)，加熱回流1 h，放冷，滴加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值2～3后，乙酸乙酯試劑振搖提取4次，每次10 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為樣品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取1g不含熊膽的處方樣品，同樣品的制備方法制成熊膽陰性對照溶液。

2.1.4 薄層色譜條件及結(jié)果 照薄層色譜法[5](《中國藥典》2015年版四部通則0502)，吸取供試品溶液2 μL、對照品溶液2 μL、陰性對照品2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-乙醚-冰醋酸-正丁醇-水(10∶5∶5∶3∶1)的上層溶液展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱約10 min。置紫外光燈365 nm下檢視(溫度：27 ℃；濕度：32%)。結(jié)果樣品色譜中，在與熊去氧膽酸、膽酸、鵝去氧膽酸對照品的相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果如圖1所示。

圖1 泵嘎日-17中熊膽薄層色譜圖

2.2 黃柏的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性條件 填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(25∶75)，流速為1 mL/min，檢測波長為265 nm，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定鹽酸小檗堿對照品適量，加鹽酸-甲醇(1∶100) 的混合溶液制成每1 mL含50 ug的溶液，即得。

2.2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱定本品細(xì)粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率140 W,頻率4 kHz)，放冷，再稱定重量，用上述混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 專屬性考察 分別取陰性樣品供試溶液(除不加黃柏外其余幾份藥材按原方配比)、泵嘎日-17供試樣品溶液、鹽酸小檗堿對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀。按上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，陰性樣品對鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果無干擾。結(jié)果如圖2所示。

A.鹽酸小檗堿對照品溶液；B.泵嘎日-17供試樣品溶液；C.陰性樣品供試溶液圖2 專屬性考察高效液相色譜圖

2.2.4 線性范圍 精密稱定鹽酸小檗堿對照品2.5 mg(實(shí)際取2.565 mg)，置10 mL量瓶中，加(鹽酸-甲醇 1∶100)使溶解并稀釋至刻度，搖勻(相當(dāng)于0.2565 mg/mL)。精密吸取上述對照品溶液0.5、1、2 mL分別置25 mL量瓶中，吸取2 mL、3 mL分別置10 mL量瓶中，加(鹽酸-甲醇1∶100)混合溶液至刻度，搖勻，配置成濃度為 5.13、10.26、20.52、51.30、76.96 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，按上述色譜條件測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：Y=25890X-27638.8，R2=0.9992，n=5。結(jié)果表明鹽酸小檗堿在濃度為 5.13～76.96 μg/ mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度 取同一批號樣品(批號：20190912)6份，按樣品溶液制備方法制備樣品，照上述色譜條件及方法進(jìn)行測定每份樣品的含量，平均含量為2.2366 mg/g，RSD為1.81%表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液5 μL，按上述色譜條件，分別于制備0、2、4、8、10、12 h進(jìn)行色譜測定，記錄色譜峰面積，從數(shù)據(jù)可見，樣品中鹽酸小檗堿在12 h內(nèi)峰面積基本穩(wěn)定不變，RSD為0.9%(n=6)。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知鹽酸小檗堿含量的樣品(批號：20190912 含量為2.2366 mg/g)粉末6份，每份約為0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入用(鹽酸-甲醇1∶100)混合溶液配制的鹽酸小檗堿對照品溶液(C=0.5029 mg/mL)1、1、1、2、2、2、4、4、4 mL，按照樣品溶液制備方法制備樣品溶液。按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，平均回收率為95.6%，RSD為1.8%(n=9)。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 耐用性實(shí)驗(yàn) 用不同型號，不同廠家的色譜柱，取樣品重0.5026 g的供試品，按樣品溶液制備方法制備樣品，以上述色譜條件進(jìn)樣，測定含量。結(jié)果見表2。

表2 不同色譜柱的耐用試驗(yàn)

2.2.9 樣品測定 依據(jù)建立的鹽酸小檗堿含量測定方法，對三批次(批號為20190920、20190912、20190905)泵嘎日-17中的鹽酸小檗堿含量進(jìn)行測定。樣品測定結(jié)果見表3。

表3 三批樣品中鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果

2.2.10 藥材含量的測定 同法對生產(chǎn)上述三批樣品的黃柏藥材進(jìn)行了含量測定，鹽酸小檗堿的含量結(jié)果為39.3166 mg/g。測定結(jié)果見表4。

表4 三批樣品中黃柏鹽酸小檗堿的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇 黃柏具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，用于治療濕熱泄痢、黃疸尿赤、骨蒸勞熱等癥，而熊膽具有清熱解毒、息風(fēng)止痙、清肝明目的功效，其所含膽汁酸鹽可顯著增加膽汁分泌量，對總膽管、括約肌有松弛作用，鵝去氧膽酸有溶解膽結(jié)石的作用[6]。二者均對膽囊炎具有一定的治療作用，故選擇二者進(jìn)行泵嘎日-17的質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.2 含量測定檢測波長的選擇 通過考察鹽酸小檗堿的紫外光譜得出，鹽酸小檗堿在265 nm處有最大吸收，故含量測定選用265 nm作為含量測定的檢測波長。

3.3 含量測定流動(dòng)相的選擇 前期預(yù)試驗(yàn)分別考察了甲醇-水(25∶75)、乙腈-水(25∶75)、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(25∶75)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(25∶75)作為流動(dòng)相，結(jié)果選用甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，鹽酸小檗堿色譜峰型不理想，拖尾較嚴(yán)重；而甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相時(shí)，由于甲醇在低波長處對鹽酸小檗堿色譜峰型有干擾，沒有乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的色譜峰理想，故選用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(25∶75)作為流動(dòng)相。

3.4 含量測定提取方法的選擇 參照了2015年版《中國藥典》大補(bǔ)陰丸的含量測定方法[7]，分別考察了以鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液為提取溶劑，15、30、45、45、60、75 min超聲處理提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿在超聲提取30 min后含量基本不變，故確定超聲提取時(shí)間為30 min。

3.5 含量測定轉(zhuǎn)移率和含量范圍 從樣品含量測定結(jié)果和生產(chǎn)對應(yīng)批次樣品的藥材含量測定結(jié)果分析比較，通過轉(zhuǎn)移率與2015年版《中國藥典》一部中黃柏鹽酸小檗堿含量限值計(jì)算[7]，擬定泵嘎日-17中黃柏以鹽酸小檗堿計(jì)，不得少于1.4 mg/g。

綜上，研究利用薄層色譜法和高效液相色譜法，分別對泵嘎日-17中主藥熊膽和黃柏進(jìn)行了定性定量測定，建立了泵嘎日-17中熊膽和黃柏的質(zhì)量控制方法，通過試驗(yàn)研究結(jié)果看出，薄層色譜對熊膽的定性鑒別方法科學(xué)、簡便、專屬性強(qiáng)；高效液相色譜法對黃柏的定量鑒別方法科學(xué)、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。故本研究可對蒙藥制劑泵嘎日-17的質(zhì)量控制提供方法學(xué)基礎(chǔ)，對促進(jìn)蒙藥標(biāo)準(zhǔn)化，提高蒙藥發(fā)展水平具有一定的積極意義。