黃茹潤 楊 嬌 劉 姍 母育成 賴 泳

大理大學藥學院藥理學教研室，云南 大理 671000

隨著人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，加之社會人口老齡化，心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率已明顯增多，嚴重威脅著人類的健康，目前主要以化學藥治療心血管疾病，但化學藥的不良反應會限制其使用，如噻嗪類利尿藥可能導致低血鉀、高尿酸、高血糖；腎素-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類藥物易產(chǎn)生干咳；鈣拮抗劑可能引起外周水腫、便秘、心悸、面部潮紅；β受體阻滯藥可能使糖尿病病人產(chǎn)生低血糖、乏力；硝酸酯類藥可能導致頭痛、心率放射性加快、低血壓；抗血小板藥物可能引起肝臟損害和肌病等[1]，而中藥和中藥制劑因其溫和、持久的治療作用，以及多途徑、多靶點的治療特點，使其在抗心血管疾病中得到廣泛使用[2]。由中藥-中藥、中藥-西藥聯(lián)合用藥引起CYP450酶(CYPs)的誘導/抑制，產(chǎn)生的藥物相互作用明顯增加[3]，因此評價臨床常見中成藥對CYPs的體外活性影響，對于臨床安全用藥、降低藥-藥相互作用的風險有重要的意義。本研究通過前期大量查閱文獻及對大理大學第一附屬醫(yī)院、大理州人民醫(yī)院及大理市第一人民醫(yī)院3家醫(yī)院走訪，選出常用于抗心血管疾病且多與西藥聯(lián)合應用的3種中成藥：參松養(yǎng)心膠囊(Shensong yangxin capsule，SS)、芪藶強心膠囊(Qili Qiangxin capsule，QL)和通脈養(yǎng)心丸(Tongmai yangxin pill，TM)，但以上三藥對肝臟 CYPs 有無影響尚未見報道，且人的CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4與大鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP2D1、CYP3A1存在同源性[4]，鑒于此，本課題采用“Cocktail”探針藥物法，體外評價大鼠肝微粒體中 3 種常見抗心血管病中成藥對 CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A4 酶的抑制活性，為預測臨床上此 3 種常見抗心血管病中成藥與以CYPs 4種亞酶為底物的藥物合用時可能產(chǎn)生的相互作用提供實驗數(shù)據(jù)，為臨床藥物的合理應用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器 EL-304電子分析天平(Mettler Toledo)；pH計(上海雷磁)；色譜：Agilent 1260 HPLC工作系統(tǒng) (美國Agilent 公司)；TARGIN VX-III多管渦旋震蕩器(中國北京踏科技有限公司)；3-15臺式高速離心機(美國Sigma)。

1.2 試劑及藥品 咖啡因(中國食品藥品檢定研究院，批號20161014)；奧美拉唑(批號G1325050)和美托洛爾(批號C1729022)均購自阿拉丁；咪達唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號20170328)；地西泮注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號AH160602)；α-萘黃銅(批號O0506A)、奎尼丁(批號A1210A)、酮康唑(批號J0620AS)、氟康唑(批號O0615AS)均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；參松養(yǎng)心膠囊(北京以嶺藥業(yè)有限公司，批號1703008)；芪藶強心膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號A1704018)；通脈養(yǎng)心丸(樂仁堂制藥廠，批號1070275)。

1.3 實驗動物 雄性SD大鼠10只，體重(200±20) g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供(SYXK湘2013-0004)。

2 方法

2.1 溶液配制 內(nèi)標溶液配制：精密量取2 mL地西泮注射液(5 mg·mL-1)，超純水定容于5 mL容量瓶，得2.00 mg·mL-1的內(nèi)標儲備液。精密量取適量內(nèi)標儲備液，甲醇-乙腈(1∶1)稀釋成8 μg·mL-1的內(nèi)標工作液。

三種中成藥溶液配制：精密稱取SS、QL、TM各20 mg，加甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，得400 μg·mL-1待測藥物液，臨用時采用倍比稀釋法配制為200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1溶液。具體操作[5]：采用96孔板，先向第1孔加入100 μL 400 μg·mL-1的待測藥物液，吸走50 μL加入第2孔，向第2孔加入50 μL甲醇，混勻后吸走50 μL加入到第3孔，再向第3孔加入50 μL甲醇，混勻后吸走50 μL加入到第4孔，依此類推，直到第7孔，則第1孔至第7孔的藥物濃度分別為：400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1。

2.2 大鼠肝微粒體制備 鈣沉淀法[6]制備肝微粒體：取出大鼠肝臟稱重，剪碎，用KCl磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)反復沖洗后，按1∶4(W/V)加入50 mmol·L-1Tris-1.15 % KCl緩沖溶液，冰上勻漿，然后4 ℃，10000 r/min，離心20 min，取上清液加入適量CaCl2溶液(1∶1，V∶V)后再以4 ℃，14000 r/min，離心40 min，棄上清，沉淀加入 1 mL 上述KCl緩沖液混勻，4 ℃，14000 r/min，離心20 min，紅色沉淀即為肝微粒體。將其懸浮于 PBS-20 % 甘油緩沖液中，分裝至EP管中，采用BCA法，測定肝微粒體蛋白含量并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1% 甲酸水溶液(B)，洗脫程序：0～8 min，A為10 %～ 40 %；8～15 min，A為40 %～ 45 %；15～30 min，A為45 %～ 35 %；30～35 min，A為35 %～20 %；35～40 min，A為20 %～ 10 %。流速0.5 mL·min-1；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.4 樣品處理 參考文獻[7]處理樣品，加入10 μg·mL-1地西泮內(nèi)標500 μL，渦旋混勻1 min，12000 r/min離心10 min,取上清液200 μL，進樣20 μL。

2.5 探針底物與大鼠肝微粒體體外反應及HPLC法測定 孵育體系總體積500 μL，包含15 μL大鼠肝微粒體蛋白(0.5 mg·mL-1)，10 μL NADPH再生系統(tǒng)(1 mmol·L-1NADP+，10 mmol· L-1G-6-P，1 U·mL-1G-6-PDH)，472.5 μL PBS緩沖液(pH=7.4)，2.5 μL混合探針底物(15.04 μmol·L-1咖啡因、7.81 μmol·L-1美托洛爾、4.98 μmol·L-1奧美拉唑和6 μmol·L-1咪達唑侖)。在37 ℃水浴中預孵育5 min， NADHP再生系統(tǒng)啟動反應，37 ℃反應30 min后取出，按“2.4”項下處理樣品，“2.3”項下色譜條件進樣，每組平行做3份。

2.6 方法學考察 按照美國食品藥品監(jiān)督管理局方法學評價指導方針[8]，進行專屬性、線性關(guān)系、回收率、精密度和穩(wěn)定性考察。

2.6.1 專屬性 分別取大鼠空白肝微粒體、空白肝微粒體+內(nèi)標溶液、空白肝微粒體+標準品+內(nèi)標，按“2.4”項下處理樣品，“2.3”項下色譜條件進樣，考察色譜峰分離與干擾情況。

2.6.2 線性關(guān)系 將2.00 mg·mL-1的咖啡因、美托洛爾、咪達唑侖儲備液，1.00 mg·mL-1的奧美拉唑儲備液，用甲醇稀釋成不同濃度的混合探針溶液，終濃度分別為咖啡因 1.91、3.75 、7.52 、15.04 、30.02 、37.59 、45.16 μmol·L-1，奧美拉唑0.64、1.24 、2.49 、4.98 、9.99 、12.56 、15.14 μmol·L-1，美托洛爾0.98 、1.96 、3.91 、7.81 、15.62 、19.52 、23.42 μmol·L-1，咪達唑侖0.74 、1.51 、3.02、6.00 、12.00 、16.49、18.00 μmol·L-1。將25 μL大鼠肝微粒體加入472.5 μL PBS緩沖液中，60 ℃加熱滅活，放置至室溫后分加入2.5 μL混合底物孵育體系，按“2.5”下孵育。每個樣本平行制備3份。

學術(shù)立場和觀點的分歧源于城市小區(qū)治理實踐的矛盾，而治理實踐的矛盾根源在于，隨著中國商品房制度改革以及由此帶來的城市小區(qū)居住空間結(jié)構(gòu)的變化、社會交往關(guān)系的變化、基于物權(quán)的權(quán)利關(guān)系及權(quán)利意識的變化等一系列現(xiàn)實和觀念的變化，國家對這些變化的認識和制度調(diào)整卻相對滯后。對小區(qū)內(nèi)部出現(xiàn)的新的經(jīng)濟社會關(guān)系及其治理邏輯的辨識，有助于推動當前城市小區(qū)治理走出困境。

2.6.3 精密度 取空白肝微粒體25 μL，加入472.5 μL PBS緩沖液，再分別加入2.5 μL 低、中、高濃度的混合探針標準液(咖啡因3.75、15.04、37.59 μmol·L-1，美托洛爾1.96、7.81、19.52 μmol·L-1，奧美拉唑1.24、4.98、12.56 μmol·L-1，咪達唑侖1.51、6.00、1.49 μmol·L-1)，其余按“2.4”項下方法操作后，于同日內(nèi)進樣3次測定，求得日內(nèi)RSD；連續(xù)3日測定3次，求得日間RSD。

2.6.4 回收率 取空白肝微粒體 25 μL，加入472.5 μL PBS緩沖液，再分別加入2.5 μL按“2.6.3”項下方法制備的低、中、高濃度的混合探針標準液，其余按“2.4”項下處理進樣后，記錄峰面積A1，再選取對應濃度的對照品溶液進樣，獲得峰面積 A2，計算絕對回收率(絕對回收率 = A1/A2 × 100 %)。用以求得的標準曲線回歸方程，計算出藥物濃度，與理論濃度相比較，計算相對回收率(相對濃度= 實測濃度/理論濃度 × 100 %)。

2.6.5 穩(wěn)定性 取空白肝微粒體 25 μL，加入472.5 μL PBS緩沖液后，再分別加入“2.6.3”項下低、中、高濃度樣品2.5 μL，每個質(zhì)量濃度6份樣品分析，分別于室溫放置6 h，-80 ℃冷凍放置2周，反復凍融3次條件下，按“2.4”項下處理樣品并測定。

2.7 陽性抑制劑抑制作用的研究 置冰浴，向已加入15 μL 大鼠肝微粒體(0.5 mg·mL-1)的PBS液中分別加入2.5 μL不同濃度的陽性抑制劑(α-萘黃銅，奎尼丁，氟康唑，酮康唑終濃度分別為：10、50、50、10 μmol·L-1)和2.5 μL混合探針溶液，以下操作同“2.4”項，空白組使用等體積甲醇溶液，每份平行做3份。

2.8 三種抗心血管病中成藥對大鼠肝微粒體的抑制作用 以各待測中成藥置換孵育體系中的陽性抑制劑，藥物組系列濃度為6.25、12.5、25、50、100、200 μg·mL-1，按“2.4”項下操作進行孵育。由不同濃度反應組底物剩余量來計算相應酶抑制率：酶活性=(總底物濃度-剩余底物濃度)/ 總底物濃度。采用GraphPad Prism 5.0軟件線性回歸，將酶相對活性對待測藥物濃度對數(shù)值作圖，并計算各藥的半數(shù)抑制濃度( IC50)值。

3 結(jié)果

3.1.1 專屬性 各探針底物與大鼠肝微粒體共孵育30 min后的色譜圖如圖1(A)～(C)所示?？Х纫?、美托洛爾、奧美拉唑、咪達唑侖和內(nèi)標的相對保留時間分別為：8.006、9.205、10.216、11.678和19.120 min。結(jié)果表明在選定的色譜條件下，孵育體系中的其他物質(zhì)不干擾混合探針底物及內(nèi)標的測定，各探針底物峰與內(nèi)標物峰均良好分離，說明該方法具有良好的專屬性。

1.咖啡因;2.美托洛爾;3.奧美拉唑;4.咪達唑侖;5.地西泮圖1 空白肝微粒體(A)、空白肝微粒體+內(nèi)標溶液(B)，空白肝微粒體+標準品+內(nèi)標(C)的HPLC圖譜

3.1.2 線性關(guān)系 以探針底物濃度為橫坐標，待測物的峰面積和內(nèi)標峰面積比值為縱坐標，采用加權(quán)最小二乘法進行線性回歸，見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在濃度范圍內(nèi)，各探針藥物的回歸方程線性關(guān)系良好，表明該方法靈敏度好，在線性范圍內(nèi)測定樣品時準確可靠。

表1 各探針藥物的標準曲線方程 (n=3)

3.1.3 精密度 4 種探針底物在肝微粒體中的日內(nèi)、日間精密度均RSD<10 %，精密度良好，結(jié)果見表2。

3.1.4 回收率 相對回收率范圍為(88.18±0.32)% ～(108.92±0.34)%，絕對回收率范圍為(75.85±6.09)% ～(93.37±1.40)%，符合檢測要求，結(jié)果見表2。

表2 各探針藥物精密度和回收率試驗結(jié)果

3.1.5 穩(wěn)定性 肝微粒體樣品高、中、低濃度分別于室溫放置6h、-80℃反復凍融3次，長期凍存14 d，各探針穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析要求。

3.2 陽性抑制劑對CYPs的抑制作用 利用陽性抑制劑抑制 CYPs 亞酶的活性，見表4。加入陽性抑制劑后，各亞酶的代謝明顯減慢，表明 α-萘黃銅，奎尼丁，氟康唑，酮康唑分別對CYP1A2、P2D1、P2C11、P3A1活性有明顯抑制作用，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)，進一步驗證檢測試驗方法的合理性。將陽性抑制劑的 IC50值與文獻比較[9]，符合文獻范圍，所用實驗體系滿足 CYPs 抑制活性評價的要求。

表3 陽性抑制劑對CYPs酶的抑制作用

表4 三種抗心血管中成藥的IC50值(μmol· L-1)

3.3 三種抗心血管疾病中成藥對CYPs的抑制作用 不同濃度藥物組對4種CYPs酶的抑制曲線如圖2 ～ 4所示。由圖可見，隨著各藥物濃度的增高，各亞酶活性呈明顯降低趨勢。由抑制曲線計算得到的 IC50值見表2。據(jù)通用CYPs酶抑制強度分級規(guī)則[10]：IC50<1 μmol·L-1為強抑制劑；1 μmol·L-1 10 μmol·L-1為弱抑制劑。因此，參松養(yǎng)心膠囊對CYP1A2、P3A1和芪藶強心膠囊對CYP2C11、P3A1 IC50值分別為：1.896、1.357 、1.513、6.669 μmol·L-1，均為中等抑制劑，；通脈養(yǎng)心丸對CYP2D1 IC50值為0.566 μmol·L-1，是其強抑制劑。參松養(yǎng)心膠囊對CYP2D1、P2C11，芪藶強心膠囊對CYP2D1、P1A2和通脈養(yǎng)心丸對CYP2C11、P3A1、P1A2的IC50值均大于10 μmol·L-1，抑制CYPs 的可能性較小，不易產(chǎn)生代謝性藥物相互作用。

圖2 SS對CYP各亞酶活性的抑制曲線圖

圖3 QL對CYP亞酶活性的抑制曲線圖

圖4 TM對CYP亞酶活性的抑制曲線圖

4 討論

CYPs作為一類重要的藥物代謝酶，參與75%的臨床藥物代謝，中藥制劑在體內(nèi)代謝酶作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化的同時對酶也會產(chǎn)生抑制或誘導作用，產(chǎn)生代謝性相互作用[10]。對 CYPs的抑制作用所致的藥物相互作用(約占全部相互作用的70%)的臨床意義遠大于誘導作用(23%)[11]?！癈ocktail” 探針藥物法指一種為獲取多個代謝酶的表型信息，首先同時給予多種相對低劑量的探針藥物，然后測定生物樣本中各探針藥物的代謝率或者其他代謝分型指標的方法，具有快速、高效、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢[12]。筆者通過“Cocktail”探針藥物法評價參松養(yǎng)心膠囊、芪藶強心膠囊和通脈養(yǎng)心丸對肝微粒體中CYPs各亞酶活性的影響，從而預測藥物相互作用，提供臨床用藥參考。根據(jù)文獻[10]，可知參松養(yǎng)心膠囊對CYP1A2、P3A1和芪藶強心膠囊對CYP2C11、P3A1均有中度抑制作用；通脈養(yǎng)心丸對CYP2D1有強抑制作用。藥物對CYP1A2、CYP2C11和CYP3A1酶的抑制作用，將使酶活性相應降低，可能會導致經(jīng)上述亞酶代謝的其他藥物代謝減慢，血藥濃度升高或體內(nèi)藥物蓄積，作用時間相對延長，臨床上應謹慎合用。中藥作用是由多種有效成分的有機結(jié)合，與多種疾病相關(guān)靶點綜合影響而產(chǎn)生的兩個復雜體系之間的相互作用[13]。有文獻[14-15]報道，參松養(yǎng)心膠囊的主組分酸棗仁的水提液，山茱萸、桑寄生等的主要活性成分沒食子酸能抑制CYP3A活性。芪藶強心膠囊組分黃芪的主要活性成分胡椒苷II對人CYP2C16活性有抑制作用，且組分中的人參的主要藥效物質(zhì)人參總皂苷能夠下調(diào)人CYP3A4酶活性，延長藥物作用時間[16-17]。參松養(yǎng)心膠囊和芪藶強心膠囊均含有丹參成分， Wang等[18]研究表明丹參醇提物顯著抑制人及大鼠肝微粒CYP1A2活性，還抑制人肝微粒CYP3A4和大鼠肝微粒CYP3A1酶活性。通脈養(yǎng)心丸中甘草的有效成分甘草酸(甘草甜素)、甘草次酸、甘草苷、甘草素等均能抑制CYP2D1的活性[19-20]。這些研究結(jié)果與本實驗結(jié)果不矛盾。因此，參松養(yǎng)心膠囊、芪藶強心膠囊和通脈養(yǎng)心丸對CYPs亞酶的抑制作用可能與其主組分的活性成分有關(guān)。

本次研究，三藥直接作用于大鼠肝微粒體，與傳統(tǒng)給藥途徑差異較大，且中藥成分復雜，口服給藥吸收后對肝微粒體CYPs亞酶活性的影響與體外實驗差異較大，體外研究或動物研究不能完全代替人的體內(nèi)研究，因此三藥是否在臨床應用時產(chǎn)生抑制作用還需進行人肝微粒體或人體合并用藥進一步驗證。