袁倩云，梁夏夏，劉 蕾，郭珊珊，王文彬*

(1．江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2．江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；3．江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005)

由副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)引起的食物中毒已居微生物食源性疾病暴發(fā)的首位[1]，引起的弧菌病給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的損失[2]。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、高效的副溶血性弧菌檢測(cè)方法，對(duì)海水養(yǎng)殖中弧菌感染的預(yù)防與控制具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值，也為篩選具有較高免疫保護(hù)作用的疫苗候選靶位提供理論基礎(chǔ)[3]。

外膜蛋白是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是一種典型的由蛋白、多糖和脂質(zhì)共同構(gòu)成的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)[4]，其在維持細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)吸收及物質(zhì)交換過(guò)程中起著十分重要的作用。部分外膜蛋白具有黏附作用，可作為清除和逃避宿主防御機(jī)制的毒力因子[5]，在細(xì)菌致病性和免疫性中的作用日益受到重視[6]；部分外膜蛋白具有較好的免疫原性，是一種潛在的診斷抗原[7]。研究發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白OmpA是宿主免疫系統(tǒng)清除細(xì)菌的靶向識(shí)別蛋白[8]。外膜蛋白OmpK制備多株用于檢測(cè)副溶血性弧菌的單克隆抗體具有高度的靈敏性，開(kāi)發(fā)了一種快速、靈敏、簡(jiǎn)便的副溶血性弧菌檢測(cè)方法[9]。外膜蛋白OmpU具有免疫交叉保護(hù)性，可以作為弧菌廣譜疫苗的候選抗原[10]。外膜蛋白OmpC具有很好的免疫原性[11]。免疫候選抗原通過(guò)純化重組蛋白或在異源載體中表達(dá)的蛋白亞基制成，具有安全性和特異性，因此被廣泛用作魚(yú)類弧菌的檢測(cè)和預(yù)防。

本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出17種保守性大于92%的差異性副溶血性弧菌外膜蛋白。其中，外膜蛋白VP1008在弧菌屬中具有廣泛保守性，具有作為弧菌免疫檢測(cè)抗原的潛力。目前，關(guān)于副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008的生物學(xué)功能及重組表達(dá)的研究報(bào)道較少，其作為診斷抗原和疫苗抗原的價(jià)值仍不清楚。因此，作者以副溶血性弧菌為研究主體，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選及鑒定外膜蛋白VP1008，進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化了誘導(dǎo)表達(dá)條件[IPTG濃度、起始菌液濃度(OD600)、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間]，為制備VP1008多克隆抗體，研究VP1008的結(jié)構(gòu)、功能及免疫原性奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3) 和原核表達(dá)載體pET-28a(+)，本實(shí)驗(yàn)室保存；副溶血性弧菌(CICC 21617)，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ，寶生物工程有限公司；牛血清蛋白(BSA)，Sigma公司；DNA Marker、雙色預(yù)染蛋白 Marker、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、卡那霉素、異丙基硫代-β-D半乳糖苷、SDS-PAGE凝膠電泳所需試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；其它化學(xué)試劑，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器公司；單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；水平搖床、核酸電泳儀，北京六一儀器廠；高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器；超聲波破碎儀，上海領(lǐng)成生物科技；DGGE變性梯度凝膠電泳儀、凝膠成像儀，伯樂(lè)公司；磁力攪拌器，舟山海源公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 外膜蛋白VP1008的結(jié)構(gòu)模擬、生物信息學(xué)分析和目的基因擴(kuò)增

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載VP1008氨基酸序列，通過(guò)Swiss-Modle在線服務(wù)器進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬。用Mega 7(version:7.0.26)軟件結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast檢索出與VP1008同源性較高的10個(gè)不同的副溶血性弧菌外膜蛋白和4個(gè)弧菌屬外膜蛋白，序列對(duì)比分析后用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)進(jìn)行建樹(shù)。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載VP1008的核苷酸序列，以此為模板，在目的基因序列上插入限制性酶切位點(diǎn)XhoⅠ、NcoⅠ后，使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物，目的基因擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[12]。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選與鑒定

將純化后的目的基因和載體pET-28a(+)質(zhì)粒分別用限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ和NcoⅠ進(jìn)行酶切后，通過(guò)T4連接酶于16 ℃連接過(guò)夜，重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選與鑒定參照文獻(xiàn)[12]。

1.4 重組外膜蛋白VP1008的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

重組外膜蛋白VP1008的誘導(dǎo)表達(dá)參照文獻(xiàn)[12]。

為提高重組外膜蛋白的表達(dá)量，對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG濃度、OD600、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。將IPTG濃度設(shè)計(jì)為0.2 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD600為 0.6，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h；OD600設(shè)計(jì)為0.4、0.6、0.8，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h；誘導(dǎo)溫度設(shè)計(jì)為16 ℃、28 ℃、37 ℃、42 ℃，OD600為0.6，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h；誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)計(jì)為6 h、12 h、18 h，OD600為0.6，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)溫度為37 ℃。菌體超聲破碎、離心，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳表征，分析蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 外膜蛋白VP1008的結(jié)構(gòu)類型及生物進(jìn)化樹(shù)分析

VP1008為預(yù)測(cè)的外膜蛋白，相關(guān)研究較少。通過(guò)Swiss-Modle模擬結(jié)構(gòu)，VP1008具有典型的β-桶狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明是副溶血性弧菌外膜蛋白。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)表明，VP1008在副溶血性弧菌菌株間同源性較高，在弧菌屬內(nèi)僅與部分弧菌有一定的同源性。

圖1 VP1008系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of VP1008

2.2 目的基因擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選與鑒定

PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，4個(gè)單菌落擴(kuò)增出與VP1008基因大小相近的條帶，經(jīng)雙向測(cè)序后與原序列進(jìn)行比對(duì)，符合度均在98.5%以上，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組外膜蛋白VP1008的表達(dá)

重組外膜蛋白VP1008經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，沉淀在約為40 kDa出現(xiàn)了明顯的特異性目的條帶，與目的蛋白理論分子量39.325 kDa相符；而上清液中無(wú)目的條帶。表明，重組外膜蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中。

2.4 重組外膜蛋白VP1008表達(dá)條件的優(yōu)化

2.4.1 IPTG濃度

挑取陽(yáng)性重組質(zhì)粒單菌落置于液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h，考察IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著IPTG濃度的增加，蛋白表達(dá)量升高，但I(xiàn)PTG有一定的毒性，IPTG濃度過(guò)高會(huì)影響蛋白的表達(dá)[13]，當(dāng)IPTG濃度為1.0 mmol·L-1時(shí)，蛋白表達(dá)量最高。因此，確定最優(yōu)IPTG濃度為1.0 mmol·L-1。

2.4.2OD600的優(yōu)化

固定IPTG濃度為1.0 mmol·L-1、誘導(dǎo)溫度為37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為12 h，考察OD600對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 1，2.0.2 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)的上清、沉淀3，4.0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)的上清、沉淀 5，6.0.8 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)的上清、沉淀 7，8.1.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)的上清、沉淀

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 1，2.OD600 為0.4誘導(dǎo)的上清、沉淀 3，4.OD600為0.6誘導(dǎo)的上清、沉淀 5，6.OD600 為0.8誘導(dǎo)的上清、沉淀

由圖3可知，隨著OD600的增加，蛋白表達(dá)量升高，當(dāng)OD600增至0.6時(shí)，細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，數(shù)量增加極快，活性最高，蛋白表達(dá)量最高；當(dāng)OD600繼續(xù)增至0.8時(shí)，蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯升高，基本趨于穩(wěn)定。因此，確定最優(yōu)OD600為0.6。

2.4.3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

固定OD600為0.6、IPTG濃度為1.0 mmol·L-1、誘導(dǎo)時(shí)間為12 h，考察誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，蛋白表達(dá)量升高不明顯；誘導(dǎo)溫度為16 ℃、42 ℃時(shí)，蛋白表達(dá)量較少；誘導(dǎo)溫度為28 ℃時(shí)，蛋白表達(dá)量略微升高；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37 ℃即大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，蛋白表達(dá)量最高。因此，確定最優(yōu)誘導(dǎo)溫度為37 ℃。

2.4.4 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

固定OD600為0.6、IPTG濃度為1.0 mmol·L-1、誘導(dǎo)溫度為37 ℃，考察誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1，2.16 ℃時(shí)誘導(dǎo)的上清、沉淀3，4.28 ℃時(shí)誘導(dǎo)的上清、沉淀5，6.37 ℃時(shí)誘導(dǎo)的上清、沉淀7，8.42 ℃時(shí)誘導(dǎo)的上清、沉淀

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 1，2.誘導(dǎo)6 h的上清、沉淀 3，4.誘導(dǎo)12 h的上清、沉淀 5，6.誘導(dǎo)18 h的上清、沉淀

由圖5可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量逐漸升高，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為12 h時(shí)，蛋白表達(dá)量最高；誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)到18 h時(shí)，蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯升高。因此，確定最優(yōu)誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。

3 結(jié)論

成功構(gòu)建了VP1008原核表達(dá)系統(tǒng)，確定重組外膜蛋白VP1008的最優(yōu)誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度1.0 mmol·L-1、OD6000.6、誘導(dǎo)溫度37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間12 h，重組蛋白以包涵體的形式存在。制備的重組外膜蛋白VP1008的表達(dá)量較高，為下一步制備該蛋白多克隆抗體，研究該蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、免疫原性奠定了基礎(chǔ)。