王小寧，鞏志強，閆夢茹，梁曉燕，馬遠濤

(西安醫(yī)學院藥學院，陜西 西安 710021)

抗腫瘤藥物納米遞送系統(tǒng)由于具有尺寸小、能顯著改善藥物的溶解度、提高藥物的穩(wěn)定性、延長其血液循環(huán)時間等優(yōu)點，成為目前化療藥物制劑研究的熱點[1]。近年來，介孔二氧化硅納米粒子(mesoporous silica nanoparticles，MSN)已經(jīng)被證明是最有潛力的藥物遞送納米載體之一[2]。相比于介孔二氧化硅納米粒子，中空介孔二氧化硅納米粒子(hollow mesoporous silica nanoparticles，HMSN)具有球形中空空腔和介孔孔壁，比表面積和孔體積較大，有效提高了介孔二氧化硅的載藥能力，在提高抗癌藥溶解度及腫瘤部位滯留(EPR效應)等方面具有顯著優(yōu)勢[3]，且生物相容性較好，可生物降解。

通常，載體通過EPR效應被動靶向至腫瘤部位的效果有限，為提高給藥系統(tǒng)的靶向性，采用一些小的靶向基團或配體來修飾納米載體表面，可有效促進藥物靶向遞送至腫瘤部位并促進細胞攝取[4]。αvβ3整合素受體在多種腫瘤血管內(nèi)皮細胞中高度表達，精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)(RGD肽)序列是已知的αvβ3整合素靶向序列，因此,通過RGD肽序列靶向腫瘤細胞αvβ3整合素受體，可促進細胞的攝取[5-6]。

然而，抗腫瘤藥物自納米粒中的緩慢釋放可能導致細胞內(nèi)游離藥物的濃度長時間維持低水平，從而抑制抗腫瘤效果，甚至可能導致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性[7]。因此，為了保證抗腫瘤藥物有效地遞送至腫瘤部位并達到足夠的藥物濃度，要求載體在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定并將藥物快速釋放至腫瘤細胞的胞漿中。這可以通過具有觸發(fā)釋放機制的靶向載體來實現(xiàn)[8]。

腫瘤細胞由于在無氧狀態(tài)下糖降解速率快，產(chǎn)生的乳酸大量堆積，使得細胞周圍處于弱酸性環(huán)境，pH值在 6.0～7.0 之間[9]，這種弱酸性環(huán)境可以為設計 pH 敏感給藥系統(tǒng)提供條件。聚(2-乙基-2-噁唑啉)[poly(2-ethyl-2-oxazoline)，PEOz]是一種親水性材料，近年來較多用于功能高分子材料的合成[10]。研究表明，PEOz水溶性好，生物相容性理想，可以發(fā)揮與聚乙二醇(PEG)類似的親水效應，具有 pH 敏感性的結構特征，因此，由PEOz構建的pH響應載藥體系研究受到了廣泛關注[11-12]。聚多巴胺(PDA)結構中含有活潑的雙鍵，可與多個基團發(fā)生化學反應，例如氨基(-NH2)、巰基(-SH)等[13]，幾乎可以在任何類型的材料表面上形成粘合層，是用于功能化修飾非常通用的平臺[14]。修飾后載體兼具pH響應性和主動靶向性，使藥物靶向導入腫瘤進行響應釋放，提高藥物療效并降低抗癌藥物對正常細胞的損害作用。

作者構建由RGD肽和pH響應材料PEOz共同修飾的中空介孔二氧化硅納米載體(HMSN-PEOz-RGD)，以PDA為反應平臺進行功能化修飾，以鹽酸阿霉素(DOX)為模型藥物，在細胞水平對載藥體系進行評價，闡明載藥體系的靶向效果，為癌癥的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

人乳腺癌細胞MCF-7，購自中國科學院上海細胞生物研究所，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)。

載體：HMSN、HMSN-PDA、HMSN-PEOz、HMSN-PEOz-RGD，自制；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD肽)、鹽酸多巴胺，阿拉丁試劑(上海)有限公司；鹽酸阿霉素(DOX)，上海吉至生化科技有限公司；巰基化聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOz-SH)，西安瑞禧生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(Hyclone)，海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)，Sigma；Tris-HCl、胰蛋白酶-EDTA消化液、雙抗(青霉素和鏈霉素)，北京索萊寶有限公司；DAPI染料，蘇州宇恒生物科技有限公司；多聚甲醛，天津科密歐化學試劑有限公司。

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義予華儀器有限責任公司；T-27型傅立葉紅外光譜儀，德國布魯克；Cary60型紫外可見分光光度計，安捷倫科技有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；冷凍干燥機，美國Labconco公司；ZEN3500型激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；SQP型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；DZF6050型真空干燥箱，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；U-LH100HG Ⅸ73型倒置熒光顯微鏡，Olympus；680型酶標儀，美國BIO-RAD；TCS-SP8型激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司。

1.2 載藥體系DOX@HMSN-PEOz-RGD的構建

稱取100 mg HMSN，加入20 mL去離子水，超聲20 min后，加入50 mg DOX，攪拌使其溶解，室溫下600 r·min-1避光攪拌24 h；離心(14 000 r·min-1，30 min)，沉淀用去離子水洗滌4次，40 ℃真空干燥過夜，即得DOX@HMSN。

稱取100 mg DOX@HMSN粉末置于50 mL Tris-HCl緩沖液(10 mmol，pH值8.5)中，加入50 mg鹽酸多巴胺，室溫下避光攪拌(300 r·min-1)24 h，離心(13 000 r·min-1，10 min)，沉淀用去離子水洗滌3次，40 ℃真空干燥過夜，即得DOX@HMSN-PDA。

稱取100 mg DOX@HMSN-PDA粉末，加入20 mL含有50 mg PEOz-SH的Tris-HCl緩沖液(10 mmol，pH值8.5)，室溫下攪拌6 h，離心(10 000 r·min-1，10 min)，沉淀用去離子水洗滌3次，40 ℃真空干燥過夜，即得DOX@HMSN-PEOz。

稱取100 mg DOX@HMSN-PEOz粉末，加入含有50 mg RGD肽(2 mg·mL-1)的Tris-HCl緩沖液(10 mmol，pH值8.5)，室溫下攪拌3 h，離心(10 000 r·min-1，10 min)，沉淀用去離子水洗滌3次，40 ℃真空干燥過夜，即得 DOX@HMSN-PEOz-RGD。

分別收集所有離心后的上清液，測定其吸光度，按式(1)和式(2)計算載藥量及包封率。

(1)

(2)

1.3 載體的表征

采用溴化鉀壓片，對各修飾載體進行紅外光譜表征。采用透射電子顯微鏡對HMSN和HMSN-PEOz-RGD的分散性和內(nèi)部孔道結構進行表征。室溫下將各修飾載體超聲分散于去離子水中，采用激光粒度分析儀于25 ℃下測定各修飾載體的粒徑及電位。

1.4 DOX含量測定方法學考察

1.4.1 標準曲線的繪制

精密稱取15 mg DOX，置于50 mL棕色容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到濃度為300 μg·mL-1DOX儲備液，4 ℃下避光保存?zhèn)溆?。精密量取DOX儲備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL于25 mL棕色容量瓶中，分別加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得濃度(μg·mL-1)分別為6、12、24、36、48系列DOX標準溶液，以蒸餾水為空白，于480 nm處測定吸光度值(A)。以吸光度值為縱坐標、濃度(c)為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為：A=0.0197c-0.0491，R=0.9991，表明DOX濃度在6～48 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關系良好。

1.4.2 精密度實驗

取12 μg·mL-1的DOX標準溶液，按照測定條件連續(xù)測定6次吸光度值，計算RSD值為0.99%，說明該方法精密度良好。

1.4.3 穩(wěn)定性實驗

取12 μg·mL-1的DOX標準溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按照測定條件測定吸光度值，計算RSD值為0.45%，說明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.4.4 加樣回收率實驗

經(jīng)典作家當下研究的新視野——《赫爾曼·麥爾維爾的現(xiàn)代闡釋》述評 ………………………… 趙晶輝（1.109）

分別取濃度(μg·mL-1)為6、24、48系列DOX標準溶液(n=3)，加入處方比例的HMSN，超聲分散，加蒸餾水定容，以蒸餾水為空白，在480 nm處分別測其吸光度值，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

由表1可知，在低、中、高濃度范圍內(nèi)所得的加樣回收率均在98.83%～100.67%之間，RSD值均小于5%，表明該方法回收率良好。

1.5 體外釋藥實驗

采用透析法考察DOX@HMSN、DOX@HMSN-PEOz、DOX@HMSN-PEOz-RGD的體外釋藥行為。精密稱取100 mg載藥納米粒子，分散于2 mL去離子水中，將溶液裝入提前處理好的截留量為3 500的透析袋中，釋放介質為100 mL PBS緩沖液(pH值5.0或pH值7.4)，37 ℃避光恒溫攪拌，在預設的時間點(20 min、40 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h)吸取釋放液3 mL，同時補入等體積等溫度的PBS緩沖液。測定樣品溶液在480 nm處吸光度值，計算DOX累積釋放百分數(shù)，繪制累積釋放百分數(shù)-時間曲線。

1.6 載藥體系的靶向性研究

1.6.1 生物相容性評價

將MCF-7細胞按每孔1×104個的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為2.5 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1的 HMSN、HMSN-PEOz、HMSN-PEOz-RGD各200 μL，每個濃度設置6個復孔，對照組加入等體積完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，避光加入MTT溶液(10 μg·mL-1)150 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，37 ℃下振蕩 10 min，在酶標儀上測定490 nm處各孔吸光度值，按式(3)計算細胞存活率。

(3)

1.6.2 體外細胞生長抑制率

將MCF-7細胞按每孔1×104個的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為0.5 μg·mL-1、1 μg·mL-1、2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、8 μg·mL-1、16 μg·mL-1的DOX、DOX@HMSN、DOX@HMSN-PEOz、DOX@HMSN-PEOz-RGD，每個濃度設置6個復孔，對照組加入等體積完全培養(yǎng)基，每孔終體積為200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光加入MTT溶液(10 μg·mL-1)150 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，37 ℃下振蕩 10 min，在酶標儀上測定490 nm處各孔吸光度值，按式(4)計算細胞生長抑制率。

(4)

將MCF-7細胞按每孔3×105個的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液漂洗3次，加入2 mL無血清培養(yǎng)液稀釋的DOX、DOX@HMSN、DOX@HMSN-PEOz、DOX@HMSN-PEOz-RGD，使DOX的終濃度為10 μg·mL-1，37 ℃下繼續(xù)孵育4 h。吸棄含藥培養(yǎng)基，用冷PBS緩沖液洗滌3次，用4%多聚甲醛在37 ℃下固定20 min。固定完畢后，吸棄多聚甲醛溶液，用冷PBS緩沖液洗滌3次，然后每孔加入DAPI染色溶液(0.5 μg·mL-1)1 mL，染色15 min后，用冷PBS緩沖液洗滌3次，防熒光猝滅封片劑封片后，用熒光倒置顯微鏡進行觀察分析。

2 結果與討論

2.1 載體的紅外光譜表征(圖1)

圖1 載體的紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of carriers

由圖1可知，1 050 cm-1左右的峰歸屬于HMSH上Si-O-Si伸縮振動。PDA包裹后，1 633 cm-1處的峰可歸屬于芳環(huán)骨架伸縮振動，3 432 cm-1的寬吸收峰可歸屬于N-H/O-H的拉伸振動，這表明HMSN表面形成了PDA涂層。對于HMSN-PEOz，1 640 cm-1處的峰歸屬于PEOz上-CO-NH2中-C=O的振動，3 451 cm-1處的峰歸屬于PEOz上端-OH 的振動；對于HMSN-PEOz-RGD，1 540 cm-1、1 280 cm-1處的峰分別歸屬于RGD肽上-C=O和-CO-NH2的振動，表明在納米粒子表面成功連接靶向配體RGD肽。

2.2 載藥量和包封率(表2)

表2 載藥量和包封率/%

由表2可知，HMSN的各制劑載藥量均較高，DOX@HMSN的載藥量可高達(29.16±2.78)%，包封率為(93.24±2.65)%，修飾后載藥量和包封率略有下降。

2.3 載體的形態(tài)、粒徑及Zeta電位(圖2、3)

由圖2a可知，HMSN載體的內(nèi)部為中空結構，平均粒徑在130 nm左右，分布較為均勻。由圖2b可知，HMSN-PEOz-RGD納米粒子表面可觀察到明顯的PDA“殼程”，修飾后粒徑明顯增大，HMSN-PEOz-RGD的平均粒徑為(256.1±26.5) nm。

圖2 HMSN(a)和HMSN-PEOz-RGD(b)的透射電鏡照片F(xiàn)ig.2 TEM images of HMSN(a) and HMSN-PEOz-RGD(b)

S1.HMSN S2.HMSN-PDA S3.HMSN-PEOz S4.HMSN-PEOz-RGD

由圖3a可知，HMSN經(jīng)PDA包裹后，粒徑增大，經(jīng)PEOz修飾后，粒徑進一步增大。這是由于，PEOz長鏈的水合作用造成納米粒子的水化，粒徑增大。連接RGD肽后，粒徑稍有增大。由圖3b可知，HMSN表面由于存在大量硅羥基而帶負電，經(jīng)PDA包裹后，電位降低，可能是因為PDA具有兒茶酚結構，使納米粒子表面帶負電[15]。連接PEOz后電位稍有降低，連接RGD肽后，電位繼續(xù)降低。這是由于，RGD肽中的天冬氨酸帶一定的負電荷，納米粒子間的強靜電排斥力使其表現(xiàn)出極強的穩(wěn)定性。

2.4 載藥體系的體外釋藥

pH響應載藥體系可在腫瘤酸性微環(huán)境下快速釋放藥物，對載藥體系進行體外釋藥研究評價其pH響應性，得到體外釋藥曲線見圖4。

圖4 體外釋藥曲線Fig.4 In vitro drug release curve

由圖4可知，未經(jīng)修飾的HMSN載藥后，在不同pH值下，累積釋放量基本相同(P>0.05)，不具有pH響應性。DOX@HMSN-PEOz組和DOX@HMSN-PEOz-RGD組的累積釋放量在pH值7.4時明顯低于pH值5.0時的，在pH值7.4時24 h之內(nèi)大約30%的藥物從制劑中釋放，而在pH值5.0時，接近70%的藥物被釋放出來，且兩組間累積釋放量差異不大(P>0.05)。由于PDA涂層對孔道的封堵，在生理 pH值(pH值 7.4)條件下，兩組的藥物釋放較DOX@HMSN更為緩慢?？傊?，經(jīng)PEOz修飾后，制劑的釋放行為表現(xiàn)出明顯的 pH 依賴性，即酸性(pH值5.0)條件下藥物快速釋放，而在生理pH值(pH值7.4)條件下藥物釋放緩慢。這種pH依賴性的釋藥是由于PEOz鏈上的叔氨基強烈的質子化引起的。因為PEOz的質子化，納米粒子表面的電荷密度增加，PEOz鏈段之間的靜電斥力促使長鏈舒張，孔道打開而釋放藥物[16]。這種pH值觸發(fā)的快速釋藥除了能在短時間內(nèi)顯著增加胞內(nèi)藥物的濃度、從而有效殺死腫瘤細胞之外，膠束在短時間內(nèi)的快速釋藥還可能避免腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性。

2.5 載藥體系的靶向性研究

2.5.1 生物相容性評價

作為靶向遞送載體，良好的生物相容性是其體內(nèi)作用的首要條件。對HMSN各修飾載體進行生物相容性評價，結果見圖5。

圖5 生物相容性實驗結果Fig.5 Results of biocompatibility experiments

由圖5可知，在2.5～80 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，MCF-7細胞存活率均大于89%。表明，不論是HMSN本身還是其修飾載體均對細胞代謝沒有影響。因此，制備的各HMSN載體均具有較好的生物相容性，是良好的藥物遞送載體。

2.5.2 體外細胞生長抑制率

各載藥制劑對MCF-7的細胞毒性結果見圖6。

圖6 體外細胞生長抑制率結果Fig.6 Results of in vitro cell growth inhibition rate

由圖6可知，游離DOX和各載藥制劑都對MCF-7細胞的增殖表現(xiàn)出明顯的抑制，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。游離DOX的IC50值為5.583 μg·mL-1，而DOX@HMSN的IC50值顯著增大，為9.050 μg·mL-1，這可能是因為PDA封堵了HMSN的孔道，導致釋藥速率減慢。DOX@HMSN-PEOz和DOX@HMSN-PEOz-RGD的IC50值分別為5.621 μg·mL-1和2.460 μg·mL-1，DOX@HMSN的IC50值分別是其的1.61倍和3.68倍，說明兩種制劑均表現(xiàn)出增強的細胞毒性，DOX@HMSN-PEOz-RGD抑制腫瘤細胞生長的作用最強。這可能是由于，MCF-7細胞是αvβ3陽性的細胞，RGD肽與MCF-7細胞表面過度表達的αvβ3整合素受體具有高親和力，使其對腫瘤的抑制效果最好。

2.5.3 細胞攝取實驗

納米粒子主要通過內(nèi)吞的方式內(nèi)化進入細胞，而經(jīng)配體的修飾能夠促進這種內(nèi)吞作用。研究了MCF-7細胞對各載藥制劑的攝取，結果見圖7。

a.DOX b.DOX@HMSN c.DOX@HMSN-PEOz

由圖7可知，與游離DOX相比，DOX@HMSN組的細胞攝取明顯下降，而DOX@HMSN-PEOz組在細胞內(nèi)的熒光強度與游離DOX之間差異不大，但是顯著強于DOX@HMSN組;DOX@HMSN-PEOz-RGD組具有最高的細胞攝取，說明RGD修飾顯著促進了MCF-7細胞對藥物的攝取。

3 結論

以聚多巴胺(PDA)為反應平臺，對中空介孔二氧化硅納米粒子(HMSN)進行RGD肽和聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOz)雙重修飾，構建了RGD肽和PEOz共同修飾的中空介孔二氧化硅納米載體(HMSN-PEOz-RGD)，制備條件溫和簡單。以鹽酸阿霉素(DOX)為模型藥物構建載藥體系DOX@HMSN-PEOz-RGD，通過體外釋藥實驗研究了載藥體系在不同pH值下的響應性釋放，以人乳腺癌細胞MCF-7為模型，考察了載體的生物相容性及載藥體系的細胞毒性及細胞攝取過程。DOX@HMSN-PEOz組和DOX@HMSN-PEOz-RGD組的體外釋藥都表現(xiàn)出明顯的pH依賴性，即酸性(pH值5.0)條件下藥物快速釋放，而在生理 pH 值(pH值 7.4)條件下藥物釋放緩慢；生物相容性實驗結果顯示，各載體在2.5～89 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，與MCF-7細胞共培養(yǎng)24 h后，細胞存活率均在89%以上，表明載體具有良好的生物相容性；體外抗腫瘤活性實驗結果表明，相比于其余載藥制劑組，DOX@HMSN-PEOz-RGD組的細胞攝取作用最強，說明RGD修飾顯著促進了DOX的細胞攝取。本研究所構建的納米載體能夠特異性靶向遞送DOX，具有一定的應用前景。

HMSN雖可生物降解，但其在體內(nèi)的降解速率很慢，會產(chǎn)生蓄積[17]，因此，HMSN在體內(nèi)的降解及排泄都需要進一步研究。