劉政，曲淼，楊殿靜，王丹萍，李立才，張功

(通化市園藝研究所，吉林通化 134000)

軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)果面光滑無毛，果實(shí)含有脂肪、氨基酸、多種維生素和微量元素、果膠等營養(yǎng)成分[1]，適合鮮食、加工罐頭、果脯等，具有健胃、解熱、止血等醫(yī)療保健功能，根及根皮對(duì)消化道癌癥具有一定的抑制和治療作用[2],發(fā)展前景較廣[3]，以中國東北三省的野生資源最為豐富。目前多采用常規(guī)的種子播種、枝條扦插、嫁接等方式進(jìn)行繁殖。種子繁殖易產(chǎn)生性狀分離，扦插和嫁接繁殖速度慢。

延龍二號(hào)是延邊大學(xué)2008年在吉林省蛟河市漂河鎮(zhèn)青背村發(fā)現(xiàn)的，屬于長白山野生軟棗獼猴桃優(yōu)良單株，自然雜交種。該品種為大果型，平均單果重為19.74 g，果實(shí)為扁長方形且具豎棱溝，果實(shí)成熟期果皮黃綠色。果肉細(xì)膩，高糖和低酸是該品種的最大特點(diǎn)，糖酸比高，口感好?？扇苄怨绦挝锖?7.5%，可滴定酸含量0.42%，維生素C含量176.7 mg/100 g。果實(shí)9月中旬成熟(圖1)。筆者以延龍二號(hào)品種為材料，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑類物質(zhì)誘導(dǎo)愈傷組織的分化，為軟棗獼猴桃生理、育種及繁殖研究提供參考。

圖1 軟棗獼猴桃延龍二號(hào)結(jié)果狀

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

軟棗獼猴桃延龍二號(hào)莖組培的無菌愈傷組織。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+Zt 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+GA3 1.0 mg/L +2,4-D 1.0 mg/L，培養(yǎng)時(shí)間40 d。愈傷組織生長分化培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS、瓊脂4 g/L、糖30 g/L、pH值5.6～5.8。植物生長調(diào)節(jié)劑類：玉米素Zt(細(xì)胞分裂素類)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA，細(xì)胞分裂素類)、萘乙酸(NAA，生長素類)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、赤霉素(GA3)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)于2019年12月中旬至2020年1月中旬進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)兩部分處理(表1)。試驗(yàn)一，篩選適宜愈傷組織生長分化的細(xì)胞分裂素類生長調(diào)節(jié)劑Zt、6-BA的濃度：在基本培養(yǎng)基MS中，分別加入Zt和6-BA各4個(gè)濃度(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L)，計(jì)8個(gè)處理，重復(fù)4次。試驗(yàn)二，應(yīng)用試驗(yàn)一篩選出的Zt和6-BA的適宜濃度(1.0 mg/L)，再以生長素類生長調(diào)節(jié)劑NAA 6個(gè)濃度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L)進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出適宜莖愈傷組織生長分化的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合，計(jì)12個(gè)處理，重復(fù)4次。

所有試驗(yàn)在無菌超凈工作臺(tái)上操作。愈傷組織培養(yǎng)基制作，MS加瓊脂、糖、植物生長調(diào)節(jié)劑，混勻，以NaOH調(diào)節(jié)pH值，置于電磁爐上加熱至沸騰，倒入培養(yǎng)瓶中，擰好瓶蓋，再置于高壓滅菌鍋內(nèi)，121 ℃、滅菌20 min后，培養(yǎng)莖愈傷組織。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用鑷子從培養(yǎng)瓶中取出莖愈傷組織，在操作盤上，用手術(shù)刀去掉莖部分，將愈傷組織接種在新配置的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于溫度25±2 ℃、空氣相對(duì)濕度40%～50%培養(yǎng)室內(nèi)，全天光照，光強(qiáng)1 500～2 000 lx。培養(yǎng)10、20、30 d時(shí)3次觀察愈傷組織的誘導(dǎo)及分化情況，其中愈傷組織生長發(fā)育情況以正常生長，無褐化現(xiàn)象發(fā)生(或褐化輕且時(shí)間晚)，及有芽或根分化為好。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zt和6-BA對(duì)軟棗獼猴桃莖愈傷組織生長發(fā)育的影響

由表2可知，MS+Zt培養(yǎng)基較MS+6-BA培養(yǎng)基的愈傷組織褐化輕。MS+6-BA各處理20 d時(shí)均有褐化現(xiàn)象，而MS+Zt除0.5 mg/L外其他各濃度無褐變。MS+6-BA 1.0 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)10 d均有根分化，1.0 mg/L 6-BA較2.0 mg/L的愈傷組織褐化時(shí)間晚，程度輕。MS+Zt處理中，以MS+Zt 0.5 mg/L 10 d時(shí)有芽分化，MS+Zt 1.0 mg/L生長正常，無褐化現(xiàn)象。說明Zt對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)生長效果好，表現(xiàn)褐化輕且持續(xù)生長；6-BA促進(jìn)酚類物質(zhì)產(chǎn)生，使愈傷組織出現(xiàn)了不同程度的褐化，但6-BA促進(jìn)愈傷組織分化根。據(jù)已有數(shù)據(jù)并參考文獻(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞分裂素濃度為1.0 mg/L時(shí)效果較好，表現(xiàn)為褐化時(shí)間晚，程度輕，有根分化，分化生長速度快。

表2 Zt和6-BA對(duì)軟棗獼猴桃莖愈傷組織生長發(fā)育的影響

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)軟棗獼猴桃莖愈傷組織生長分化的影響

如表3，以篩選出的適宜Zt和6-BA濃度1.0 mg/L為基礎(chǔ)，分別與6個(gè)濃度的NAA(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L)組合配制培養(yǎng)基，接種莖愈傷組織后的組培表現(xiàn)為：MS+Zt+NAA處理中，以MS+Zt 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的莖愈傷組織培養(yǎng)效果為好，表現(xiàn)生長，無褐化。MS+6-BA+NAA處理中，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)10 d愈傷組織有芽分化，但培養(yǎng)20 d時(shí)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，根分化、生長明顯，至30 d時(shí)愈傷組織才出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，但仍繼續(xù)生長(圖2，圖3)。

添加NAA后能促進(jìn)愈傷組織生長，且愈傷組織褐化程度輕，可能NAA對(duì)酚類物質(zhì)有一定的抑制作用。

圖2 軟棗獼猴桃延龍二號(hào)莖愈傷組織生長分化芽情況注：A1、A2、A3為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上10 d、20 d、30 d的生長分化情況。

圖3 軟棗獼猴桃延龍二號(hào)莖愈傷組織生長分化根情況注：B1、B2、B3為在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上10 d、20 d、30 d的生長分化情況。

3 小結(jié)與討論

對(duì)延龍二號(hào)軟棗獼猴桃莖愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，在基本培養(yǎng)基MS中，添加不同濃度不同種類的植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的生長、芽分化、根分化作用不同。在MS中單添加細(xì)胞分裂素時(shí)，Zt比6-BA褐化程度輕。當(dāng)MS+Zt 0.5 mg/L培養(yǎng)時(shí)，愈傷組織生長10 d時(shí)就有芽分化，但20 d時(shí)已嚴(yán)重褐化不能繼續(xù)生長。MS+Zt 1.0 mg/L培養(yǎng)時(shí)，愈傷組織變化小，無褐化，至30 d時(shí)正常生長。當(dāng)MS+6-BA 1.0 mg/L、2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織培養(yǎng)10 d時(shí)均有根分化，繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，但直至30 d時(shí)仍能生長、分化根。以MS+6-BA 1.0 mg/L效果好，只有部分褐化。所以在MS中單添加細(xì)胞分裂素Zt、6-BA時(shí)，都以濃度1.0 mg/L培養(yǎng)時(shí)效果為好。莖愈傷組織于MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L上培養(yǎng)10 d時(shí)有芽分化。在MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L上培養(yǎng)10 d時(shí)根系明顯生長，且有次生根生長。故認(rèn)為MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)效果最好，褐化晚且輕，有根分化。

在MS添加細(xì)胞分裂素Zt、6-BA濃度都為1.0 mg/L基礎(chǔ)上，再添加不同濃度的生長素NAA時(shí)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織褐變程度有所減輕。筆者在軟棗獼猴桃魁綠、綠王品種上試驗(yàn)有同樣結(jié)果。這與Matkow等人[4]研究結(jié)果一致。細(xì)胞分裂素刺激酚類產(chǎn)生而發(fā)生褐變，生長素NAA能夠延緩多酚合成，減輕褐變。劉小剛等[5]也有生長素NAA可以防止愈傷組織繼代中的褐變的研究結(jié)論。

外植體來源不同，內(nèi)源激素水平也不同，培養(yǎng)基中所含生長調(diào)節(jié)劑濃度不同時(shí)，導(dǎo)致來源不同的外植體在分化能力等方面存有差異[6,7]。劉延吉等[8]研究發(fā)現(xiàn)，野生軟棗獼猴桃H1在6-BA、NAA濃度分別為1.0 mg/L、0.2 mg/L時(shí)分化率、增殖系數(shù)、成活率最高，適宜擴(kuò)繁。樸一龍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，用MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L做培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，芽分化率達(dá)95.83%，新芽形成30 d左右，長度3 cm時(shí)宜轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)基MS+Zt 2.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L +GA3 1.0 mg/L培養(yǎng)。