鄒 科 楊弋弋 周新歡 楊小卓 王遠(yuǎn)航 徐小晶 張廣敏 雷 雯

高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染與宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，宮頸浸潤癌中超過90%存在高危HPV感染。與HPV DNA分型檢測相比，HPV E6/E7 mRNA檢測更能反映HPV病毒感染活性狀況，對(duì)篩查宮頸癌敏感度較高，但尚不明確其與宮頸癌病情進(jìn)展的關(guān)聯(lián)。鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)、癌胚抗原(carcino embryonic antigen，CEA)均為宮頸癌特異性腫瘤標(biāo)志物，兩者與HPV E6/E7 mRNA均為目前宮頸癌輔助診斷的重要依據(jù)，其中SCCA具有絲氨酸蛋白酶抑制劑作用，屬癌細(xì)胞相關(guān)抗原，被認(rèn)為是鱗癌敏感性標(biāo)志物，其滴度與宮頸癌分期、癌細(xì)胞浸潤深度均有關(guān)；CEA為分布于人類胚胎、黏膜組織中特異性酸性糖蛋白抗原，已證實(shí)在宮頸癌、乳腺癌中均呈明顯高表達(dá)，與腫瘤負(fù)荷存在一定關(guān)聯(lián)。為明確宮頸癌患者HPV E6/E7、SCCA、CEA表達(dá)特點(diǎn)、相互關(guān)系及其與宮頸癌病理進(jìn)展的關(guān)系，對(duì)178例行宮頸病變篩查的可疑宮頸癌患者展開研究分析，以期為宮頸癌診治提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月至2020年3月于河南省南陽市中心醫(yī)院行宮頸病變篩查的178例的可疑宮頸癌女性作為研究對(duì)象，年齡25～59歲，平均(45.14±10.65)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡>18歲；經(jīng)組織病理確診；就診前未接受任何抗腫瘤治療；采血時(shí)處于非經(jīng)期。排除標(biāo)準(zhǔn)：已接受放化療、手術(shù)或其他抗腫瘤治療；子宮切除史；宮頸手術(shù)史；近期有陰道用藥或陰道沖洗史；心肝腎肺功能不全；合并卵巢、膽道系統(tǒng)、消化系統(tǒng)病變；孕期或哺乳期女性。178例受試者經(jīng)病理確診正常/炎癥25例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ級(jí)22例，CIN Ⅱ級(jí)26例，CIN Ⅲ級(jí)35例，宮頸癌70例。正常/炎癥受試者年齡26～58歲，平均(44.76±9.86)歲；CIN Ⅰ級(jí)患者年齡25～57歲，平均(45.76±10.07)歲；CIN Ⅱ級(jí)患者年齡25～59歲，平均(45.71±9.96)歲；CIN Ⅲ級(jí)患者年齡26～59歲，平均(45.52±9.75)歲；宮頸癌患者年齡26～59歲，平均(45.32±10.47)例。宮頸癌TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例，Ⅳ期10例；其中鱗癌59例，腺癌11例；組織學(xué)分級(jí)：低分化8例，中分化27例，高分化35例。本研究通過河南省南陽市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，研究對(duì)象均知曉研究內(nèi)容，已簽訂知情同意書。

1.2 方法 ①HPV E6/E7 mRNA檢測。避開經(jīng)期，患者取膀胱截石位，使用宮頸專用刷自宮頸外口、頸管內(nèi)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈，停留10 s，刷子置于專用保存液內(nèi)，折斷多余部分，刷頭留置管內(nèi)，收集宮頸口、宮頸管脫落上皮細(xì)胞，標(biāo)本送實(shí)驗(yàn)室，采用HPV定量檢測試劑盒檢測HPV E6/E7 mRNA(支鏈DNA信號(hào)擴(kuò)增檢測試劑盒購自中國貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司)，標(biāo)本水平離心2次，3 000 r/min，每次5 min，加600 μL細(xì)胞裂解液+5 μL蛋白酶K，吹打混合均勻，65℃恒溫孵育60 min，振蕩2～3次，充分裂解細(xì)胞，按宮頸穩(wěn)態(tài)試劑盒(科蒂亞新鄉(xiāng)生物技術(shù)有限公司)配置溶液配置，布板，設(shè)立陽性對(duì)照孔、空白對(duì)照孔(均設(shè)2個(gè)復(fù)孔)，信號(hào)放大，加熒光標(biāo)記底物，Quanti Virus便攜式冷光儀(美國Diacarta LLC公司)上檢測，讀板，軟件自動(dòng)計(jì)算結(jié)果。HPV E6/E7 mRNA copies≥1.0 copies/mL視為陽性。②血清SCCA、CEA檢測。就診時(shí)均采血，采用微粒子酶聯(lián)免疫分析法測定SCCA水平，采用酶聯(lián)免疫法測定CEA水平，試劑盒購自德國羅氏公司，嚴(yán)格按試劑使用說明操作。SCCA正常參考值范圍0～1.81 μg/L，CEA正常參考值范圍0～4.7 ng/mL，數(shù)據(jù)高于參考值則視為陽性。③組織病理學(xué)檢查。陰道鏡下取宮頸活體組織，送病理檢測，依據(jù)陰道細(xì)胞學(xué)的分類及報(bào)告細(xì)則(the bethesda system，TBS)分類系統(tǒng)，所有受試者分為正常/炎癥組、CIN Ⅰ級(jí)組、CIN Ⅱ級(jí)組、CIN Ⅲ級(jí)組、宮頸癌組；宮頸癌患者按TNM分期分為I～Ⅱ期組、Ⅲ～Ⅳ期組，按組織學(xué)分級(jí)分為低分化組、中分化組與高分化組。比較各亞組HPV E6/E7 mRNA及SCCA、CEA水平差異。

2 結(jié)果

2.1 不同病理級(jí)別宮頸病變患者HPV E6/E7 mRNA表達(dá)及血清SCCA、CEA水平比較 正常/炎癥組、CIN Ⅰ級(jí)組、CIN Ⅱ級(jí)組、CIN Ⅲ級(jí)組、宮頸癌組，HPV E6/E7 mRNA陽性率、HPV E6/E7 mRNA copies及SCCA、CEA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 宮頸不同病理級(jí)別受試者HPV E6/E7 mRNA表達(dá)及血清SCCA、CEA水平比較

2.2 不同分期宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA陽性率及血清SCCA、CEA水平比較 宮頸癌Ⅲ～Ⅳ期組HPV E6/E7 mRNA陽性率和Ⅰ～Ⅱ期組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，Ⅲ～Ⅳ期組血清SCCA、CEA水平均高于Ⅰ～Ⅱ期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 不同分期宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA陽性率及血清SCCA、CEA水平比較

2.3 不同分化程度宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA陽性率及血清SCCA、CEA水平比較 不同分化程度宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，血清SCCA、CEA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表3。

表3 不同分化程度宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA陽性率及血清SCCA、CEA水平比較

2.4 HPV E6/E7 mRNA陽性與陰性宮頸癌患者血清SCCA、CEA水平比較 HPV E6/E7 mRNA陽性宮頸癌患者血清SCCA、CEA水平高于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表4。

表4 HPV E6/E7 mRNA陽性與陰性宮頸癌患者血清SCCA、CEA水平比較

2.5 宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA copies與血清SCCA、CEA水平的相關(guān)性分析 相關(guān)分析結(jié)果顯示，宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA copies與血清SCCA、CEA呈正相關(guān)(

r

=0.525、0.655，

P

均<0.001)。見圖1、2。

圖1 HPV E6/E7 mRNA與SCCA相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

圖2 HPV E6/E7 mRNA與CEA相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

3 討論

我國宮頸癌發(fā)病率位居全球前二位。早期篩出高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變并行阻斷性治療是預(yù)防宮頸癌變、改善預(yù)后的關(guān)鍵。HPV感染監(jiān)測分為HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)監(jiān)測，后者不僅可提示HPV病毒感染情況，同時(shí)可明確HPV E6/E7 mRNA是否處于活躍期及其活動(dòng)程度，與宮頸癌變相關(guān)性更高。本研究結(jié)果顯示，正常/炎癥、CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)、宮頸癌組患者HPV E6/E7 mRNA表達(dá)強(qiáng)度逐漸上升，陽性率增加，該結(jié)果與前期研究結(jié)果存在共性，說明HPV E6/E7 mRNA表達(dá)與宮頸病變發(fā)生及進(jìn)展可能有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同臨床分期、不同病理分化程度宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA陽性率存在差別，臨床分期越晚、分化程度越低的宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA陽性率更高，支持趙涌等研究結(jié)果。考慮原因?yàn)?，分期越晚、分化越差的宮頸癌患者HPV E6/E7編碼蛋白活性更強(qiáng)，此兩類蛋白可與抑癌蛋白p53和pRb結(jié)合，降低抑癌活性，直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞突變風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，引起A、E細(xì)胞周期蛋白過表達(dá)，G/S節(jié)點(diǎn)調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致細(xì)胞癌變，引起宮頸癌進(jìn)展，造成不良預(yù)后。但本研究中不同分化程度宮頸癌患者HPV E6/E7陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與樣本量偏少所造成統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差有關(guān)，后續(xù)需擴(kuò)充樣本量論證該結(jié)論。

腫瘤標(biāo)志物一般分布于癌變組織、宿主體液內(nèi)，具有較高的特異性，通常非腫瘤患者體液內(nèi)無腫瘤標(biāo)志物存在或表達(dá)水平極低。SCCA、CEA均為宮頸癌特異性腫瘤標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清SCCA、CEA水平均高于正常/炎癥及CIN組患者，且期別越晚、分化越差的宮頸癌患者SCCA、CEA表達(dá)水平越高，這與國外Takakura等研究結(jié)論一致，說明隨宮頸病變的進(jìn)展，SCCA、CEA水平升高，與HPV E6/E7 mRNA趨勢一致。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7 mRNA陽性宮頸癌患者血清SCCA、CEA表達(dá)水平明顯高于陰性者，支持王元元等相關(guān)研究結(jié)論。同時(shí)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7 mRNA copies與SCCA、CEA表達(dá)均呈正相關(guān)性，說明宮頸癌患者SCCA、CEA水平與HPV E6/E7 mRNA病毒活性存在一定的關(guān)聯(lián)。推測隨宮頸病變的進(jìn)展，HPV病毒活躍程度增加，可能引起腫瘤標(biāo)志物水平越高。

綜上，宮頸癌患者HPV E6/E7 mRNA陽性率較高，血清腫瘤標(biāo)志物SCCA、CEA水平較高，隨宮頸病變程度的增加，HPV E6/E7 mRNA陽性率上升，血清SCCA、CEA表達(dá)水平提高，三者均可能與宮頸病變進(jìn)展存在一定的關(guān)聯(lián)。但本研究尚未明確三者聯(lián)合篩查早期宮頸癌的價(jià)值，后續(xù)需擴(kuò)充樣本量。