魯云風(fēng)，劉智興，張四普，牛佳佳，胡瑞英，田龍，楊永峰

獼猴桃被稱為果中之王，含有10 多種氨基酸、礦物質(zhì)及多種維生素，對保持人體健康具有重要的作用[1-2]。獼猴桃果酒以獼猴桃果實為原料，經(jīng)過酵母發(fā)酵而成，維生素C含量亦高于其他各類果酒[3-4]。

目前，我國在獼猴桃釀酒研究和釀制過程中，所使用的酵母基本是釀酒活性干酵母或葡萄酒酵母[5]，這些酵母大多是針對葡萄酒的生產(chǎn)工藝特點開發(fā)出來的，具有明顯的針對性，在其他果酒生產(chǎn)中效果并不顯著[6]，使得獼猴桃果酒的特有風(fēng)味和營養(yǎng)特征并不突出，缺乏與獼猴桃香氣相協(xié)調(diào)的果香與酒香。因此，篩選適于獼猴桃果酒發(fā)酵的專用酵母顯得極為重要。韋婷等[7]從高糖發(fā)酵完成的酒液中篩選獼猴桃果酒專用酵母，伍強等[8]從野生獼猴桃汁中分離篩選出1株適于獼猴桃果酒發(fā)酵的釀酒酵母JM11，但關(guān)于獼猴桃生香酵母分離篩選及其發(fā)酵特性的研究尚不多見。河南西峽位于溫帶和亞熱帶交界區(qū)，地處伏牛山系，生物多樣性豐富，是獼猴桃最佳適生區(qū)之一。為此，從西峽太平鎮(zhèn)山區(qū)多年野生獼猴桃樹葉、枝干、果皮及樹下土壤中分離獼猴桃生香酵母，對菌株進行鑒定，研究其發(fā)酵特性，以期為開發(fā)獼猴桃果酒專用菌種或選育馴化的出發(fā)菌株提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品與培養(yǎng)基

樣品采自西峽太平鎮(zhèn)山區(qū)多年野生獼猴桃樹葉（標記為Y）、枝干（標記為Z）、果皮（標記為R）及樹下土壤（標記為X），土壤分為表層土壤（標記為X0cm）、5 cm 處土壤（標記為X5cm）、10～20 cm 處土壤（標記為X10～20cm）、20～40 cm 處土壤（標記為X20～40cm），每份樣品采集3份。徐香獼猴桃選自內(nèi)鄉(xiāng)獼猴桃合作社，糖度9.86°Bx。

YPD 培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、WL 瓊脂培養(yǎng)基、獼猴桃果汁培養(yǎng)基及菌種保藏培養(yǎng)基依據(jù)文獻[9-12]方法配制。YPD培養(yǎng)基：酵母浸膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%（固體YPD 培養(yǎng)基：添加2%瓊脂粉）。麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基130.1 g/L，115 ℃滅菌15 min（固體培養(yǎng)基：添加2%瓊脂粉）。WL 瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸粉0.500 00%，胰蛋白胨0.500 00%，葡萄糖5%，瓊脂2%，磷酸二氫鉀0.055 00%，氯化鉀0.042 50%，氯化鈣0.012 50%，氯化鐵0.000 25%，硫酸鎂0.012 50%，硫酸錳0.000 25%，溴甲酚綠0.002 20%，pH 值6.5。獼猴桃果汁培養(yǎng)基：選八成熟、發(fā)軟的果實，清洗干凈，加偏重亞硫酸鉀，使SO2含量為0.06 g/kg（1 g偏重亞硫酸鉀可產(chǎn)生560 mg SO2，1 L溶液中加入0.107 g偏重亞硫酸鉀），打漿，加入1 mL/kg 的果膠酶，40 ℃水浴中酶解2 h后滅活，放涼。4 層紗布過濾上述果漿，放置過夜，取上清液，62～65 ℃滅菌30 min。菌種保藏培養(yǎng)基：酵母浸粉1.5 g/L，蛋白胨3.5 g/L，葡萄糖15.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。所需試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TU-1810 紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），手持糖度計（上海米青科實業(yè)有限公司），SW-CJ-1F 型單人雙面凈化臺（江蘇蘇中凈化設(shè)備有限公司），立式實驗室高壓滅菌器（上海申安LDZM-40KCS），微分干涉顯微鏡（德國徠卡DMI1）。

1.3 生香酵母的分離、純化及篩選

按常規(guī)方法處理1.1 中的樣品，然后分別在YPD 培養(yǎng)基中富集微生物。將富集培養(yǎng)液稀釋至10-4、10-5、10-6，各取0.1 mL 涂布于麥芽汁培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落質(zhì)地、菌落顏色及菌落表面特征。用接種環(huán)挑取表面光滑、濕潤的酵母單菌落，接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h，備用。酵母的分離、純化依據(jù)文獻[11]的方法。酵母菌一級復(fù)篩：采用杜氏管發(fā)酵法，根據(jù)菌株產(chǎn)氣速率及產(chǎn)氣量，初步獲得發(fā)酵性能較強菌株[11]。酵母菌二級復(fù)篩：將一級復(fù)篩的菌種活化后接入獼猴桃汁培養(yǎng)基中，28 ℃條件下發(fā)酵8 d，測定殘?zhí)呛途凭?，采用CO2失重法比較各菌株發(fā)酵能力[12]。酵母菌三級復(fù)篩：根據(jù)二級復(fù)篩的菌種發(fā)酵性能，挑取YPD 培養(yǎng)基上的單菌落接種于50 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24～72 h，采用嗅聞法判斷產(chǎn)香情況[13]。綜合三級復(fù)篩結(jié)果，篩選出生香能力強、發(fā)酵力好的獼猴桃生香酵母。

1.4 生香酵母的鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[14]進行，初步確定1.3 中篩選出的獼猴桃生香酵母分類地位。

1.4.2 生理生化鑒定 參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[14]和馬榮山等[15]的方法，通過糖發(fā)酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗等生理生化試驗對分離出的生香酵母進行鑒定，初步判斷菌株的種屬。

1.4.3 分子鑒定 參照文獻[15]的方法，提取酵母總DNA，純化擴增26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列，送往上海生工生物工程公司測序，將得到的測序結(jié)果與NCBI基因序列庫中已知序列進行同源性比對，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹圖譜，確定目的菌株種屬。

1.5 發(fā)酵特性研究

1.5.1 耐性試驗 參照文獻[16-17]的方法，將生香酵母種子液接入YPD 液體培養(yǎng)基中，接種量為8%（1.1×106cfu/mL），分別調(diào)整SO2質(zhì)量濃度（0.10～0.30 mg/L）、酒精度（6%～18%）和葡萄糖質(zhì)量濃度（100～300 g/L），28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后測定菌懸液600 nm 處OD 值，依據(jù)OD 值大小判定生香酵母的耐受性。

1.5.2 最適發(fā)酵溫度和pH 值確定 參照文獻[18]的方法，將生香酵母種子液接入24°Bx 獼猴桃果汁培養(yǎng)基中，接種量為8%，分別在不同溫度和不同pH值條件下恒溫培養(yǎng)72 h，用酒精計法測定酒精度，依據(jù)酒精度的大小確定最適發(fā)酵溫度和pH值。

1.5.3 發(fā)酵效果評價 將篩選到的生香酵母活化后，接種于糖度240 g/kg 獼猴桃果汁，接種量為8%，調(diào)整pH 值為4.0，25 ℃發(fā)酵8 d 后測定每瓶發(fā)酵液的殘?zhí)恰⒕S生素C、總酸含量及酒精度、澄清度、色度，感官評定酒的風(fēng)味（色澤、香味等）[12]。

其中，殘?zhí)牵ㄒ赃€原糖計）、總酸（以檸檬酸計）、維生素C含量采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定；酒精度采用GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》方法進行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

加快推進全市基礎(chǔ)行業(yè)和優(yōu)勢行業(yè)的轉(zhuǎn)型升級和提質(zhì)增效。發(fā)揮百色鋁產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢，合理開發(fā)利用鋁土礦資源，著力構(gòu)建鋁產(chǎn)業(yè)鏈和配套產(chǎn)業(yè)鏈。加快淘汰冶煉行業(yè)落后產(chǎn)能、改造提升技術(shù)裝備水平；整合全市礦產(chǎn)資源，發(fā)展鋁銅深加工行業(yè)。全面提升鋁加工行業(yè)的整體競爭力，加快發(fā)展高性能、綠色環(huán)保的精細化工產(chǎn)品和高端化工新材料產(chǎn)品。加強與貴州、云南區(qū)域間的電力合作，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，降低工業(yè)用電成本。提升改造傳統(tǒng)建材行業(yè)，突破發(fā)展新興建材行業(yè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生香酵母的篩選與鑒定

2.1.1 天然酵母的分離、純化及初篩 經(jīng)富集培養(yǎng)以及分離，WL 瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察菌落的特征，最終得到了18株初篩酵母。WL瓊脂培養(yǎng)基上菌落的顏色為奶油色（淺黃色）至綠色，表面為球形突起、光滑、不透明、奶油狀。

2.1.2 酵母菌的一級復(fù)篩 將初篩得到的酵母菌株分別接入獼猴桃果汁培養(yǎng)基中發(fā)酵進行酵母菌的一級復(fù)篩，28 ℃培養(yǎng)48 h，分別在第12、24、36 h和48 h 觀察杜氏小管中產(chǎn)氣情況和絮凝情況。共獲得6株產(chǎn)氣效果好（產(chǎn)氣達到1/2杜氏小管體積以上）、絮凝能力好的菌株。

2.1.3 酵母菌的二級復(fù)篩 以每天酵母失重量為指標做發(fā)酵力測試進行酵母菌的二級復(fù)篩，結(jié)果見圖1。6 株菌株中，X-35cm起酵速度最快，1 d 達到最高發(fā)酵速率，且CO2失重量最高，發(fā)酵能力最好，其次為Z-3。

發(fā)酵8 d 后，發(fā)酵液的酒精度、殘?zhí)呛虲O2總失重量見表1。酒精度在5.6%以上的有菌株X-35cm、Z-3 和X-110～20cm，CO2總失重量在7.0 g 以上的有菌株X-35cm和Z-3，顯著高于其他菌株，菌株X-35cm、Z-3 和X-110～20cm發(fā)酵液殘?zhí)窍鄬^低。綜合評價，篩選出X-35cm、Z-3 和X-110～20cm3 株菌株，作為三級復(fù)篩的出發(fā)菌株。

表1 不同菌株的發(fā)酵指標Tab.1 Fermentation indexes of different strains

2.1.4 酵母菌的三級復(fù)篩 按1.3 所述方法進行酵母菌的三級復(fù)篩，采用嗅聞法判斷產(chǎn)香情況，結(jié)果見表2。綜合發(fā)酵性能和產(chǎn)香能力，選擇X-35cm為獼猴桃發(fā)酵生香酵母（將X-35cm命名為X-5）。

表2 不同菌株產(chǎn)香情況Tab.2 Aroma production of different strains

2.1.5 菌株的形態(tài)鑒定 X-5 菌落突起，顏色呈乳白色，不透明，表面光滑，濕潤，邊緣整齊。顯微鏡檢結(jié)果（圖2）顯示，X-5 菌株形態(tài)為橢圓形，無性繁殖方式均為多端出芽繁殖。

2.1.6 菌株生理生化鑒定 通過糖發(fā)酵試驗、同化碳源、同化氮源和其他生理生化試驗對分離出的生香酵母X-5 進行鑒定，結(jié)果見表3。經(jīng)形態(tài)觀察和生理生化試驗，并根據(jù)國際權(quán)威的酵母菌鑒定系統(tǒng)[14]鑒定，分離菌株為有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora) 的葡萄園有孢漢遜酵母(Hanseniaspora vineae)。

表3 菌株X-5生理生化鑒定試驗結(jié)果Tab.3 The results of physiological and biochemical identification of strain X-5

2.1.7 菌株26S rDNA 鑒定 經(jīng)測序獲得X-5 菌株的26S rDNA序列，長度為523 bp，與PCR結(jié)果（圖3）一致。將此序列提交到NCBI 基因數(shù)據(jù)庫進行序列對比分析，結(jié)果表明，分離菌株的序列與葡萄園有孢漢遜酵母的26S rDNA 序列相似性最高為96%。應(yīng)用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株X-5與葡萄園有孢漢遜酵母親緣關(guān)系最近，且在一個分支上（圖4）。綜合形態(tài)特征、生理生化試驗結(jié)果以及序列比對結(jié)果，初步鑒定菌株X-5 為典型性生香酵母葡萄園有孢漢遜酵母。

2.2 生香酵母X-5的發(fā)酵性能

2.2.1 耐受性 高質(zhì)量濃度SO2、糖和酒精度會對酵母產(chǎn)生脅迫作用[16-17]，抑制其生長與發(fā)酵，進而影響果酒品質(zhì)。耐受性試驗結(jié)果（表4）表明，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度超過0.20 g/L、酒精度大于12%時，生香酵母X-5 生長均受到抑制；糖質(zhì)量濃度低于300 g/L 時,對其影響不大。

表4 菌株X-5耐受性試驗結(jié)果Tab.4 The results of physiological tolerance test of strain X-5

2.2.2 最適發(fā)酵溫度和pH 值 發(fā)酵溫度和pH 值變化對生香酵母X-5 發(fā)酵影響較大，隨著溫度上升，酵母生長活性變大，發(fā)酵能力增強。當(dāng)溫度為26 ℃時，酒精度最大，之后隨著溫度上升，酵母活性有所降低，產(chǎn)酒精能力下降。pH值變化對酵母產(chǎn)酒精能力影響有相同的趨勢。由圖5 和圖6 可以看出，生香酵母X-5 最適的發(fā)酵溫度為26 ℃，最適pH值為4.0。

2.2.3 發(fā)酵效果評價 將生香酵母X-5 活化后，接種于糖度240 g/kg獼猴桃果汁中，25 ℃發(fā)酵8 d后測理化指標和感官指標，X-5 發(fā)酵性能測定結(jié)果見表5。由表5 可知，生香酵母X-5 發(fā)酵的獼猴桃果酒，酒度較低，維生素C含量高，感官評價高，酒香濃郁，香氣、口感好。

表5 生香酵母X-5發(fā)酵獼猴桃酒的理化指標和感官指標Tab.5 Physico-chemical and sensory indexes of sweet kiwifruit wine fermented by yeast X-5

3 結(jié)論與討論

從獼猴桃種植園土壤或獼猴桃表皮及汁中分離釀酒或非釀酒酵母是篩選獼猴桃果酒發(fā)酵專用菌種或選育馴化出發(fā)菌株的主要方法和重要途徑。研究者先后篩選分離出多種釀酒和非釀酒酵母[7-8,17,19-20]。然而，釀酒酵母釀造的酒通常存在風(fēng)味平淡的缺陷[21]。產(chǎn)香酵母會賦于酒不同的風(fēng)味特征[22]。因此，篩選生香酵母等非釀酒酵母用于果酒發(fā)酵成為近些年的研究熱點，主要應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)葡萄酒和梨酒的釀造[16，23]。

本研究以多年野生獼猴桃樹葉、枝干、果皮及樹下土壤為材料，通過分離、純化后篩選出1株產(chǎn)香能力強、發(fā)酵性能優(yōu)良的生香酵母。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗和26S rDNA基因序列同源性分析，鑒定為葡萄園有孢漢遜酵母。耐受性試驗結(jié)果表明，該菌株可耐受12%的酒精度、300 g/L 的糖和0.20 g/L SO2，發(fā)酵后酒液澄清透明，酒香果香濃郁，酒精度9.6%，維生素C 含量0.327 7 g/L，感官品質(zhì)高，可作為獼猴桃果酒發(fā)酵的專用菌種或選育馴化的出發(fā)菌株。該菌株在乙醇耐受性及產(chǎn)酒精度等方面與釀酒酵母相比還有差距，但果酒中乙醇含量過高時會影響酒的風(fēng)味特征，生產(chǎn)低醇果酒成為新的趨勢[23-24]。因此，可以利用該菌株生產(chǎn)低醇優(yōu)質(zhì)獼猴桃果酒，也可以此菌株為出發(fā)菌株，進行化學(xué)、物理及ARTP 等誘變育種，以及利用基因組重排技術(shù)、基因工程技術(shù)等改造培育遺傳穩(wěn)定的工程菌，提升其發(fā)酵特性。另外，當(dāng)前將釀酒酵母和生香、產(chǎn)脂等非釀酒酵母混合發(fā)酵釀造果酒取得了較好的效果，劉曉柱等[16]將葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母X16混合發(fā)酵刺梨果汁，降低了刺梨果酒中揮發(fā)酸和殘?zhí)橇?，提升了果酒品質(zhì)。閻賀靜等[25]利用釀酒酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母混合發(fā)酵玫瑰香葡萄酒，顯著提高了玫瑰香葡萄酒中乙酸乙酯等典型特征香氣成分的含量。張博欽等[23]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄園有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵可使葡萄酒中乙酸苯乙酯含量提升36.04 倍。因此，將本研究篩選鑒定的生香酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵獼猴桃果酒值得進一步研究。

綜上，本研究從多年野生獼猴桃樹下土壤中分離到1 株發(fā)酵能力較強的生香酵母，對SO2、糖和酒精度耐受性較好，產(chǎn)香力強，可作為獼猴桃果酒發(fā)酵的專用菌種或選育馴化的出發(fā)菌株開展進一步研究。