郭振華，邢廣旭，翁茂洋，金前躍，喬松林，張改平，2，3

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）也稱奧耶斯基氏病（Aujeszky’s disease，AD），最早由匈牙利科學(xué)家?jiàn)W耶斯基（Aujeszky）于1902年報(bào)道。其致病病原是偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV），也稱為豬皰疹病毒1 型（Suid herpesvirus 1，SuHV-1）和奧耶斯基病毒（AD virus，ADV）[1]。PRV 可以感染多種動(dòng)物，如狗、貓、羊、牛、狐貍、貂和鼠等，致死率幾乎為100%[2]。豬是PRV 唯一的自然宿主，PRV 感染后可以在豬體內(nèi)建立起持續(xù)終身的潛伏感染。母豬感染后主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、返情和死胎等繁殖障礙癥狀；仔豬主要表現(xiàn)為流涎、口吐白沫、顫抖、角弓反張等神經(jīng)癥狀，死亡率很高[3]；保育豬通常以神經(jīng)癥狀為主，同時(shí)伴有一定的呼吸道癥狀，但死亡率大大降低；育肥豬則以呼吸道癥狀為主，偶見(jiàn)輕微的神經(jīng)癥狀[4]。

從20 世紀(jì)90 年代到2010 年，我國(guó)主要通過(guò)接種PRV 弱毒疫苗（如Bartha-K61 株和HB-98 株）防控該病，并取得了良好的效果。2011 年開(kāi)始，許多接種疫苗的豬場(chǎng)相繼暴發(fā)了PR[5-6]。AN等[1]證實(shí)，該次疫情是由新出現(xiàn)的PRV 變異株引起的，且現(xiàn)有疫苗（Bartha-K61 株）針對(duì)變異株感染不能提供完全保護(hù)。隨后PRV 變異株在我國(guó)多個(gè)省份迅速傳播，GU等[7]于2013—2016年對(duì)山東省采集的5 033份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PRV gE 抗體陽(yáng)性率為57.8%；解偉濤等[8]于2014—2016 年針對(duì)河南地區(qū)臨床樣本的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，PRV 野毒感染的豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)到了90%左右，血清樣品的gE 抗體陽(yáng)性率為46.2%。PRV 變異株的再度流行給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。

gB、gC和gD 蛋白是PRV 主要的保護(hù)性抗原，與免疫保護(hù)緊密相關(guān)[9-12]，研究其變異特征對(duì)監(jiān)測(cè)我國(guó)PRV 毒株的遺傳變異情況具有重要意義。鑒于此，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離的PRV 毒株HeNLH/2017 和HeNZM/2017 進(jìn)行全基因組序列的測(cè)定，并利用生物信息學(xué)方法分析其主要保護(hù)性抗原的遺傳變異情況，以豐富我國(guó)PRV 流行毒株的基因組數(shù)據(jù)，旨在為PR的流行與防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 毒株及細(xì)胞

HeNLH/2017 和HeNZM/2017 PRV 毒株由本 實(shí)驗(yàn)室從河南漯河地區(qū)和中牟地區(qū)臨床病料中分離獲得。病毒的擴(kuò)繁在PK-15細(xì)胞上進(jìn)行。

1.2 病毒培養(yǎng)與核酸提取

將HeNLH/2017 和HeNZM/2017 兩個(gè)PRV 毒株分別接種于PK-15 細(xì)胞，待病變率達(dá)到80%時(shí)，收集培養(yǎng)上清并保存；貼壁細(xì)胞用PBS洗1遍，然后按照基因組提取試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)胞和病毒的總DNA。用NanoDrop One（ThermoFisher Scientific公司）儀器測(cè)定提取核酸的濃度。

1.3 病毒基因組測(cè)序

將提取的總DNA 送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行病毒基因組測(cè)序，采用Illumina NovaSeq 二代測(cè)序方法。序列的拼接和標(biāo)注參照HN1201毒株（GenBank No.KP722022）進(jìn)行。

1.4 基因組同源性分析

基因組同源性分析采用平均核苷酸相似性（Average nucleotide identity，ANI）（https://www.ezbiocloud.net/tools/orthoani）進(jìn)行。

1.5 進(jìn)化樹(shù)及主要抗原氨基酸變異分析

從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得參考毒株的序列（表1）。全基因組 序列的比對(duì)采用MAFFT（Multiple alignment using fast fourier transform）程序進(jìn)行；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建采用MEGA 6.0的鄰位法（Neighbor-joining tree with 1 000 bootstrap）進(jìn)行。利用DNAStar 軟件中的MegAlign（Clustal W method）程序進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)分析。

表1 毒株序列信息Tab.1 The strain sequence information in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV分離毒株基因組測(cè)序結(jié)果

按照基因組提取試劑盒（TaKaRa）操作說(shuō)明提取細(xì)胞和PRV 的總DNA，采用Illumina NovaSeq二代測(cè)序方法（上海派森諾生物科技股份有限公司）完成了PRV 的全基因組序列測(cè)定，結(jié)果顯示，HeNLH/2017 和HeNZM/2017 PRV 分離株基因組全長(zhǎng)約為143 kb，GC 含量約為73.8%（表2），基因組結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的結(jié)果一致（圖1），包含1 個(gè)UL區(qū)（Unique long region）和1 個(gè)US 區(qū)（Unique short region），以及位于US 區(qū)兩側(cè)的內(nèi)部重復(fù)區(qū)（Internal repeat sequence，IR）和末端重 復(fù)區(qū)（Terminal repeat sequence，TR）。PRV 基因組共編碼70 個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open reading fram，ORF），其中，UL 區(qū)包含59 個(gè)基因，參與病毒DNA 復(fù)制以及病毒粒子的組裝和成熟；US 區(qū)7 個(gè)基因，主要與病毒的感染和毒力有關(guān)；IR 區(qū)和TR 區(qū)則各包含2 個(gè)基因US1 和ICP4/IE180。2 株P(guān)RV 分離株的全基因組序列已上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（MT775883 和MW560175）。

表2 2株P(guān)RV分離株基因組序列分析Tab.2 Genome sequence analysis of two PRV isolates

2.2 PRV分離毒株基因組同源性分析

PRV 基因組核苷酸同源性分析顯示（圖2），HeNLH/2017 和HeNZM/2017 PRV 分離株間的基因組核苷酸同源性為99.59%。我國(guó)流行毒株與歐美代表性毒株Bartha 株的遺傳差異較大，為4.36%～4.72%；而我國(guó)流行毒株之間的同源性均較高，為98.31%～99.59%，其中2011 年以來(lái)流行的變異毒株與我國(guó)經(jīng)典毒株Ea 和Fa 的同源性為98.31%～98.90%，遺傳差異為1.10%～1.69%；變異毒株彼此之間的同源性為98.90%～99.59%，遺傳差異為0.41%～1.10%。

2.3 PRV分離毒株遺傳進(jìn)化分析

分別基于PRV 全基因組序列和gC 基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。從圖3 可以看出，PRV 毒株可以明顯分為2 個(gè)基因型，基因1 型（Genotype 1）主要包括歐美地區(qū)的流行毒株，如Bartha、Kaplan 和Becker 等；基因2 型（Genotype 2）主要包括我國(guó)流行的毒株，又進(jìn)一步分為基因2.1 亞型（Genotype 2.1）（以Ea 和Fa 株為代表）和基因2.2 亞型（Genotype 2.2）（以HeN1 和HN1201 株為代表）。本研究分離的HeNLH/2017 和HeNZM/2017 PRV 毒株均屬于基因2.2亞型。

2.4 PRV分離毒株主要保護(hù)性抗原氨基酸變異分析

通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，分析了PRV 不同毒株gB、gC和gD蛋白的氨基酸變異情況。從圖4可以看出，與Bartha 株相比，2 株P(guān)RV 分離株以及我國(guó)其他PRV 流行毒株的gB 蛋白有36 個(gè)氨基酸的差異，包括75SPG77的缺失和94G 的插入，氨基酸差異達(dá)到3.93%；gC 蛋白有40 個(gè)氨基酸的差異，包括63AAASTPA69連續(xù)7個(gè)氨基酸的插入，氨基酸突變率達(dá)到了8.21%；gD 蛋白共有14 個(gè)氨基酸的差異，包括278S/RPRP281氨基酸的插入，氨基酸突變率約為3.47%。

與經(jīng)典毒株Ea和Fa相比，2株P(guān)RV分離株以及我國(guó)2011 年以來(lái)流行的其他PRV 變異毒株氨基酸序列均非常保守，gB 蛋白僅有5 個(gè)氨基酸的差異，分別是T85A、R454K、H563K、T740A、V898A；gC 蛋白有3個(gè)氨基酸的變異，分別是T34N、E99K、G194E；gD 蛋白有278S/RP279的缺失和V338A位點(diǎn)的變異。

3 結(jié)論與討論

PRV 基因組大小約140 kb，且具有高GC 含量（70%以上）和存在反復(fù)出現(xiàn)的重復(fù)序列等特征，這為PRV 全基因組序列的測(cè)定帶來(lái)了困難[13]。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展成熟和成本的降低，能夠高效率地完成復(fù)雜基因組的測(cè)序工作。本研究利用Illumina NovaSeq 二代測(cè)序方法，成功獲得了2 株P(guān)RV 變異毒株的全基因組序列。核苷酸同源性分析顯示，HeNLH/2017 和HeNZM/2017 分離株與Bartha 株的核苷酸同源性為95.28%～95.37%；而與我國(guó)早期流行毒株Ea 和Fa 的同源性為98.70%～98.80%，與我國(guó)2011年以來(lái)新出現(xiàn)的變異毒株的同源性為98.90%～99.42%。說(shuō)明分離毒株與變異毒株的核苷酸同源性更高。

根據(jù)地域分布和遺傳差異，PRV 可以分為基因1 型和基因2 型[13-14]?；? 型主要在歐美地區(qū)流行，并且大部分地區(qū)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了該病的凈化；而基因2 型則在亞洲主要是在中國(guó)流行，根據(jù)遺傳和致病性差異，又進(jìn)一步分為基因2.1 亞型和基因2.2 亞型[15]?；?.1亞型即通常說(shuō)的經(jīng)典毒株，以我國(guó)早期分離株Ea 和Fa 為代表；基因2.2 亞型即通常所說(shuō)的變異毒株，主要指2011 年以來(lái)引起我國(guó)PRV 再度流行的毒株。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，本研究分離的2株P(guān)RV 與我國(guó)流行的變異毒株處于同一進(jìn)化分支，均屬于基因2.2 亞型。此外，也有多個(gè)研究報(bào)道了PRV 不同毒株之間的基因重組現(xiàn)象，其中具有代表性的是SC 株和HLJ-2013 株，通過(guò)全基因組序列的分析，發(fā)現(xiàn)它們?cè)贐artha 毒株與我國(guó)本土流行毒株之間發(fā)生了基因序列重組[15-18]。進(jìn)化樹(shù)分析也與這一發(fā)現(xiàn)一致，當(dāng)以全基因組構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí)，SC株和HLJ-2013 株屬于基因2 型；而以gC基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，SC 株和HLJ-2013 株同屬于基因1型。

變異毒株的致病性顯著高于經(jīng)典毒株[19]，且接種Bartha-K61 和Bucharest 疫苗后針對(duì)該類毒株的中和抗體水平較低[1，12]；豬群接種Bartha-K61 疫苗后，可以針對(duì)我國(guó)早期流行毒株（Ea 和SC）提供良好的免疫保護(hù)，但對(duì)流行毒株（PRV-XT和JS-2012）僅能提供部分保護(hù)[12，20]。本研究采集病料的2 個(gè)豬場(chǎng)豬群均接種了Bartha-K61 疫苗，母豬每年接種4次，無(wú)明顯臨床癥狀；新生仔豬表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀、流涎等，多在48 h 內(nèi)死亡。因此，有必要加緊研發(fā)針對(duì)我國(guó)PRV 新流行變異毒株的疫苗，從而更好地開(kāi)展防控凈化工作。

gB、gC和gD 蛋白是PRV 主要的保護(hù)性抗原，與不同流行毒株間的交叉保護(hù)和免疫逃逸緊密相關(guān)[9-12]。與Bartha疫苗毒株相比，我國(guó)PRV 流行毒株gB、gC 和gD 蛋白均廣泛發(fā)生了氨基酸變異[21-22]。其中，gB 蛋白還包括特征性的75SPG77位的缺失和94G位的插入，gC 蛋白包括63AAASTPA69連續(xù)7 個(gè)氨基酸的插入，gD 蛋白包括278S/RPRP281位氨基酸的插入。此外，gB蛋白主要有3個(gè)抗原表位區(qū)域，分別是59—126 aa、214—279 aa 和540—734 aa[23]，而gB 蛋白發(fā)生變異和插入的位置大部分位于59—126 aa和540—734 aa 抗原表位區(qū)，這在一定程度上解釋了Bartha 疫苗對(duì)我國(guó)流行毒株保護(hù)效果不佳的原因。另外，需要注意的是，與早期PRV 毒株相比，我國(guó)流行的PRV 變異毒株較為保守（gD 蛋白具有278S/RP279的缺失），僅發(fā)生了個(gè)別氨基酸的變異，且這些發(fā)生變異的氨基酸與Bartha 株中對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)一致。在gB 蛋白發(fā)生變異的5 個(gè)氨基酸中，有4 個(gè)（T85A、H563K、T740A和V898A）與Bartha 株中一致；在gC 蛋白發(fā)生變異的3 個(gè)氨基酸中，有2個(gè)（T34N和E99K）與Bartha 株一致；gD 蛋白僅有的1 個(gè)氨基酸變異（V338A）也與Bartha 株一致。因此，變異毒株的免疫逃逸機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究測(cè)定分析了2 株P(guān)RV 的基因組遺傳特征，并進(jìn)一步分析了主要保護(hù)性抗原gB、gC 和gD 蛋白的氨基酸變異情況。我國(guó)流行毒株與歐美地區(qū)的毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，且主要保護(hù)性抗原均廣泛發(fā)生了基因突變，并包含特征性的氨基酸插入或缺失序列。我國(guó)2011 年以來(lái)流行的變異毒株與早期流行毒株之間雖然存在一定的遺傳差異，但整體同源性依然很高。