王秋宇 姜平 朱軍義 許靜 郭哲 孫慧霞

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2021.02.008

宮頸癌作為婦科最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中高居第2位[1-2]，3年生存率低于15%，且中晚期宮頸癌主要的治療方法—放療常產(chǎn)生放射耐受性，患者預(yù)后較差，生存質(zhì)量較低[3]。因此，研究宮頸癌放療耐受的分子機(jī)制已成為其臨床治療基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和微小RNA(microRNA, miRNA)參與腫瘤發(fā)展進(jìn)程，且lncRNA可作為miRNA分子海綿發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)功能[4-7]。核富集轉(zhuǎn)錄本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1, NEAT1)是一種lncRNA，其表達(dá)水平與宮頸癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移能力和侵襲力關(guān)系密切，可能成為宮頸癌精準(zhǔn)的治療靶點(diǎn)[8]。但目前，NEAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞放療敏感性的影響和機(jī)制還未知。本研究前期通過Targetscan靶基因預(yù)測(cè)軟件顯示，NEAT1可能靶向結(jié)合miR-195。研究顯示，過表達(dá)miR-195可增加人喉癌和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性[9-11]。而NEAT1能否靶向調(diào)控miR-195表達(dá)，影響宮頸癌SiHa細(xì)胞放射敏感性尚還未知。本文將討論NEAT1對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞放射敏感性的影響及其能否靶向負(fù)調(diào)控miR-195表達(dá)，以期為提高宮頸癌放療敏感性提供分子靶點(diǎn)。

材料與方法

一、材料

宮頸癌細(xì)胞株SiHa和正常宮頸細(xì)胞株Ect1/E6E7購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；四氮唑藍(lán)(blue tetrazolium chloride, BTC)、二甲基亞砜和胰蛋白酶購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；Transwell板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Lipofectamine 2000試劑盒、Trizol試劑、實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；NEAT1小干擾RNA(si-NEAT1,5′-UAGGUCAGUGCGCCUAGUC-3′)、不含人體DNA分子同源序列的小RNA分子作為隨機(jī)dsRNA對(duì)照組(si-con,5′-CUGAUGCUAGCGAUCG-UC-3′)、miR-195抑制劑(anti-miR-195,5′-CGA-UAGCUAGCUACGGGGA-3′)及抑制劑陰性對(duì)照序列(anti-miR-con,5′-CGAAUUAAGCACAGUC-3′)、miR-195模擬物(mimics，5′-ACGAUAUAC-GUAC-GUA-3′)及模擬對(duì)照序列(miR-con,5′-CGA-GAUAUACGUACGUAAG-3′)、NEAT1過表達(dá)載體(pcDNA-NEAT1,5′-CAACGAAUA-UGCUAG-CAC-3′)及對(duì)照空載體(pcDNA,5′-CAUACUACGAUAUCUACCGC-3′)、NEAT1野生型質(zhì)粒(WT-NEAT1)及突變型質(zhì)粒(MUT-NEAT1)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；光學(xué)顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：使用含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)液(含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)SiHa和Ect1/E6E7細(xì)胞，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度95%，培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將對(duì)數(shù)增殖期的SiHa和Ect1/E6E7細(xì)胞均稀釋濃度至1×106/ml，200 μl細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)SiHa和Ect1/E6E7細(xì)胞中NEAT1和miR-195RNA的表達(dá)水平。

2.SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染：SiHa細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，稀釋細(xì)胞濃度至1×106/ml，200 μl細(xì)胞/孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至基本融合為一層時(shí)，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-con(si-con組)、si-NEAT1(si-NEAT1組)、pcDNA(pcDNA組)、pcDNA-NEAT1(pcDNA-NEAT1組)、共轉(zhuǎn)染si-NEAT1與anti-miR-con(si-NEAT1+anti-miR-con組)、si-NEAT1與anti-miR-195(si-NEAT1+anti-miR-195組)。轉(zhuǎn)染12 h后，換成完全培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)檢測(cè)NEAT1和miR-195RNA的表達(dá)：轉(zhuǎn)染后的SiHa細(xì)胞(si-con組、si-NEAT1組、pcDNA組、pcDNA-NEAT1組)，用Trizol試劑提取總RNA，測(cè)定濃度和純度，保存于-80 ℃。然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃ 30 min、42 ℃ 45 min、72 ℃ 10 min；4 ℃放置10 min，合成的cDNA測(cè)定濃度和純度后置于-80 ℃保存。取cDNA按照RT-qPCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。引物如下：miR-195上游：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，下游：5′-TGCTTAGCAGCACAGAAA-3′；NEAT1上游：5′-TGG-CTAGCTCAGGGCT-3′，下游：5′-TCTCC-TTGCCAAGCTTCCTTC-3′。運(yùn)用Bio-RadIQ5TM系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

4.克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定放射處理后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)：收集轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞(si-con組、si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-miR-con組、si-NEAT1+anti-miR-195組)，以2.5×104個(gè)/孔接種于6孔板培養(yǎng)過夜。然后用不同劑量(0、2、4、6、8 Gy) 6 MV-X照射細(xì)胞，照射均為一次性照射。照射條件：室溫，源靶距100 cm，劑量率200 cGy/min，照射面積12 cm×10 cm，射野覆蓋全細(xì)胞培養(yǎng)板。取照射后細(xì)胞500個(gè)/皿接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10 ml培養(yǎng)液混勻，培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼能清晰可見的細(xì)胞克隆(約2周)，棄培養(yǎng)液，洗滌2次，甲醛固定細(xì)胞20 min，棄固定液，洗滌2次，吉姆薩染色30 min，清洗晾干后計(jì)數(shù)，細(xì)胞克隆數(shù)>50個(gè)時(shí)為有效菌落。細(xì)胞克隆形成率=(克隆數(shù)平均值/鋪板細(xì)胞總數(shù))×100%，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction, SF)=(受照射細(xì)胞克隆形成率/對(duì)照細(xì)胞克隆形成率)×100%。根據(jù)單機(jī)多靶模型SF=1-(1-e-D/D0)N，擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算放射增敏比(sensitization ratio,SER)，其中D為放射線劑量，D0為平均致死劑量，Dq為準(zhǔn)域劑量，N為外推數(shù)。

5.BTC實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活性：收集轉(zhuǎn)染后的SiHa細(xì)胞(si-con組、si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-miR-con組、si-NEAT1+anti-miR-195組)以2×104/孔接種于96孔板中，經(jīng)4 Gy 6 MV-X照射2 h，然后分別培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加20 μl(5 mg/ml)BTC，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清培養(yǎng)液。每孔加入150 μl二甲基亞砜，室溫振蕩5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處的吸光度(A)值。

6.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染48 h后的SiHa細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化、計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h ，若細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，則按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-NEAT1與miR-con或miR-195 mimics、MUT-NEAT1與miR-con或miR-195 mimics。轉(zhuǎn)染12 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，加入配制好的裂解緩沖液，室溫裂解15 min，離心收集上清，-20 ℃保存或直接檢測(cè)。加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果以螢火蟲與海腎的熒光強(qiáng)度比值表示。

7.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率：轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞(si-con組、si-NEAT1組、si-NEAT1+anti-miR-con組、si-NEAT1+anti-miR-195組)以2×104個(gè)/孔接種于6孔板，經(jīng)4 Gy 6 MV-X照射2 h，然后培養(yǎng)72 h。棄去培養(yǎng)液，洗滌2次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞。加200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μl膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記的異硫氰酸熒光素和5 μl碘化丙啶混勻，室溫避光反應(yīng)20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、宮頸癌SiHa細(xì)胞中NEAT1和miR-195的表達(dá)

宮頸癌SiHa細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)高于正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7(P<0.05)，而miR-195的表達(dá)低于Ect1/E6E7細(xì)胞(P<0.05)。見表1。

表1 人宮頸癌細(xì)胞中NEAT1和miR-195的表達(dá)

二、不同劑量的放射照射對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞中NEAT1和miR-195表達(dá)的影響

與0 Gy組相比，(2、4、6、8 Gy)組照射的宮頸癌SiHa細(xì)胞中NEAT1表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，而miR-195的表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)；而正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7經(jīng)照射后細(xì)胞中NEAT1和miR-195的表達(dá)量均無(wú)顯著變化(P>0.05)，見表2。選擇有顯著差異且對(duì)SiHa細(xì)胞傷害小的照射劑量4 Gy進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同劑量的放射照射對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞中NEAT1和miR-195表達(dá)的影響

三、NEAT1靶向調(diào)控miR-195的表達(dá)

Targetscan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NEAT1與miR-195存在互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖1。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果如表3所示，共轉(zhuǎn)染miR-con與WT-NEAT1的細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-195與WT-NEAT1的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染miR-con與MUT-NEAT1的細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-195與MUT-NEAT1的熒光素酶活性沒有明顯變化。RT-qPCR結(jié)果顯示，與si-con組相比，si-NEAT1組miR-195表達(dá)量顯著上升(P<0.05)；與pcDNA組相比，pcDNA-NEAT1組miR-195表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，見表4。說明NEAT1靶向負(fù)調(diào)控miR-195的表達(dá)。

圖1 NEAT1與miR-195互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表4 NEAT1調(diào)控miR-195的表達(dá)

四、抑制NEAT1表達(dá)和敲除miR-195對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著照射劑量的增加，與si-con組相比，si-NEAT1組SiHa的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)逐漸下降，且差異顯著(P<0.05,圖2)，放射增敏比為1.45(表5)；與si-NEAT1+anti-miR-con組相比，si-NEAT1+anti-miR-195組SiHa的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)逐漸升高，且差異顯著(P<0.05)(圖2)，放射增敏比為0.66(表5)。表明抑制NEAT1表達(dá)可增加宮頸癌SiHa細(xì)胞的放射敏感性，敲除miR-195則會(huì)逆轉(zhuǎn)抑制NEAT1表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞的放射敏感性。

注：與si-con組比較，*P<0.05; 與si-NEAT1+anti-miR-con組比較，#P<0.05圖2 不同劑量放射下各組宮頸癌細(xì)胞生存曲線

表5 抑制NEAT1表達(dá)和敲除miR-195宮頸癌細(xì)胞放射后單擊多靶模型擬合的參數(shù)值

五、抑制NEAT1表達(dá)和敲除miR-195對(duì)放射照射(4 Gy)后宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

BTC結(jié)果顯示(表6)，在48 h和72 h時(shí)，與si-con組相比，si-NEAT1組SiHa的細(xì)胞增殖活性逐漸下降，且差異顯著(P<0.05)；與si-NEAT1+anti-miR-con組相比，si-NEAT1+anti-miR-195組SiHa的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)逐漸升高，且差異顯著(P<0.05)。說明抑制NEAT1表達(dá)可抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，敲除miR-195則會(huì)逆轉(zhuǎn)抑制NEAT1表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞的增殖抑制作用。

表6 抑制NEAT1表達(dá)和敲除miR-195對(duì)放射照射(4 Gy)后宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

六、抑制NEAT1表達(dá)和敲除miR-195對(duì)放射照射(4 Gy)后宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示(表7)，與si-con組相比，si-NEAT1組SiHa的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與si-NEAT1+anti-miR-con組相比，si-NEAT1+anti-miR-195組SiHa的細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)。說明抑制NEAT1表達(dá)可誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡，敲除miR-195則會(huì)逆轉(zhuǎn)抑制NEAT1表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

表7 抑制NEAT1表達(dá)和敲除miR-195對(duì)放射照射(4 Gy)后宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

討 論

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織及放射線處理的宮頸癌SiHa細(xì)胞中NEAT1表達(dá)升高，抑制NEAT1表達(dá)的宮頸癌SiHa細(xì)胞經(jīng)不同放射線處理后，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低，增敏比為1.45，同時(shí)增殖能力降低，凋亡加劇，說明抑制NEAT1表達(dá)可增強(qiáng)SiHa細(xì)胞放射敏感性。NEAT1屬于lncRNA家族成員，參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。Guo等[12]研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制NEAT1可通過調(diào)節(jié)Akt/PI3K信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Han等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1在宮頸癌組織及抗輻射細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，抑制NEAT1可抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，NEAT1通過靶向結(jié)合miR-193b-3p上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，從而增強(qiáng)宮頸癌的放射敏感性。這些報(bào)道結(jié)果與本文的研究結(jié)果相一致，提示NEAT1有可能成為增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的分子靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步探究NEAT1影響宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了NEAT1可靶向結(jié)合miR-195；同時(shí)抑制NEAT1可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞中miR-195的表達(dá)，而上調(diào)NEAT1則抑制miR-195的表達(dá)，說明NEAT1靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-195。miR-195參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程及腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。研究顯示[14]，miR-195在耐5-氟尿嘧啶胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可增強(qiáng)耐5-氟尿嘧啶胃癌細(xì)胞對(duì)5-氟的敏感性；miR-195在放射處理的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-195的過表達(dá)可能通過下調(diào)BCL-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的放射敏感性[15]。桂云等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-195在宮頸癌組織或血清樣本中表達(dá)下調(diào)，這與本研究宮頸癌SiHa細(xì)胞中miR-195的表達(dá)低于正常宮頸細(xì)胞的結(jié)果一致。本研究還表明，miR-195在放射處理的SiHa細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，敲除miR-195則會(huì)逆轉(zhuǎn)抑制NEAT1表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞放射敏感性的影響，說明NEAT1可能通過靶向負(fù)調(diào)控miR-195來(lái)影響SiHa細(xì)胞的放射敏感性。

綜上，放射線處理可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)，而抑制NEAT1表達(dá)可阻礙宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)SiHa細(xì)胞的放射敏感性，其作用機(jī)制可能與靶向負(fù)調(diào)控miR-195表達(dá)有關(guān)，NEAT1可能為提高宮頸癌放射治療效率提供新的治療靶點(diǎn)。