羅 葵，宋學英

（首都醫(yī)科大學中心實驗室，北京 100069）

神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸是人體內(nèi)的重要組成物質(zhì)，參與各種代謝途徑，可通過調(diào)控中樞神經(jīng)元的興奮或抑制，參與神經(jīng)元信息傳遞、認知、學習和記憶等過程[1?2]。據(jù)文獻[3?7]報道，神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸主要有甘氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺等，可分為興奮性和抑制性兩類，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸等，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸包括γ-氨基丁酸和甘氨酸等。γ-氨基丁酸和谷氨酸參與調(diào)節(jié)學習和記憶過程[8?9]，γ-氨基丁酸還能改善睡眠和預(yù)防抑郁[10?11]，天冬氨酸與智能、情緒和警覺性有關(guān)[12]，甘氨酸對傳遞痛覺信息、加工聽覺信息和處理傳感信號必不可少[13]。谷氨酰胺在神經(jīng)傳遞中的主要作用是參與谷氨酸/γ-氨基丁酸-谷氨酰胺循環(huán)，可緩解疼痛和治療抑郁等[14]。天冬酰胺可通過天冬酰胺合酶由天冬氨酸合成，該酶的缺陷會導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)異常和認知障礙[6]。

神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸不僅在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，在非神經(jīng)系統(tǒng)中也有重要的生理意義。γ-氨基丁酸能調(diào)節(jié)免疫[15]、保護和改善胰島功能[16?18]。谷氨酸在體內(nèi)外調(diào)節(jié)肝細胞群的共同節(jié)律[19]。甘氨酸參與保護心血管功能[20]。谷氨酰胺參與免疫調(diào)節(jié)[21]。

人類飲食不僅直接影響身體狀況，也會影響大腦功能和精神狀態(tài)[22]。食品是神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的天然來源，飲食調(diào)整和補充在神經(jīng)疾病等許多疾病的治療中有積極的作用[23]。神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸廣泛存在于食品中，其中黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等豆類食品不僅含有豐富的神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸，同時也是人們膳食中普遍常見且不可缺少的部分[24]。因此，建立黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆這4種豆類食品中神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的檢測方法非常有必要。

目前，氨基酸和神經(jīng)遞質(zhì)的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[25?27]、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法[28?30]、電化學法[31]、氨基酸自動分析儀法[32?33]、離子色譜法[34]、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法[35?36]等。其中，液相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法檢測氨基酸需要做柱前衍生化處理，前處理過程復(fù)雜，而氨基酸自動分析儀法耗時比較長。因此，本文在已有的文獻研究基礎(chǔ)上，簡化前處理方法，優(yōu)化儀器測定條件，建立豆類食品中神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的檢測方法，以期為豆類食品的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆 產(chǎn)地均為山東，購于市場；乙酸銨、甘氨酸（glycine, Gly）、谷氨酸（glutamate, Glu）、谷氨酰胺（glutamine, Gln）、天冬氨酸（Aspartic acid, Asp）、天冬酰胺（Asparagine,Asn）和γ-氨基丁酸（Gamma aminobutyric acid，GABA）

美國Merck公司，純度≥98%；甲醇、乙腈、甲酸

美國Fisher公司，色譜純。

1290超高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Qtrap 6500三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 配有電噴霧離子源（ESI）、Analyst采集軟件及Multi Quant數(shù)據(jù)處理軟件，美國AB SCIEX公司；MS204型電子天平

梅特勒-托利多儀器（上海）公司；MS3 Digital渦旋混勻器 德國IKA公司；Fresco21離心機 美國Thermo Scientific公司；KQ-500E超聲波清洗器（功率500 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q型超純水機 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別稱取適量的甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺和γ-氨基丁酸標準品用超純水配制成1 mg/mL單標標準品儲備液，儲存于4 ℃冰箱中。取適量各標準儲備液，用超純水稀釋成0.5 mg/mL混合標準溶液，用于繪制標準曲線。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SBAq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：1 μL。流動相為：A為0.5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0~1 min, 30% B；1~2 min，30%~90% B；2~3 min，90% B；3~4 min，30% B。

1.2.2.1 色譜柱的選擇 分別使用SB-C18（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）、Zorbax SB-Aq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）和Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）三種不同的色譜柱對1 μg/mL的甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺和γ-氨基丁酸混合標準品溶液進行檢測，考察色譜柱對目標化合物的分離效果及峰形的影響。

1.2.2.2 流動相的優(yōu)化 首先分別使用水-甲醇和水-乙腈作為流動相進行檢測，考察對目標化合物響應(yīng)強度的影響，然后分別使用0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇作為流動相進行檢測，考察對目標化合物分離度和峰形的影響。

1.2.2.3 柱溫的選擇 分別使用20、25、30、35、40、45 ℃柱溫進行檢測，考察柱溫對目標化合物響應(yīng)強度的影響。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：550 ℃；離子化電壓：4500 V；霧化氣（N2）壓力：55 psi；氣簾氣（N2）壓力：35 psi；輔助加熱氣（N2）為55 psi；各目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MS acquisition parameters of 6 neurotransmitter amino acids

1.2.4 樣品前處理 在相關(guān)文獻的研究[37?39]基礎(chǔ)上，采用水作為溶劑，超聲提取目標化合物。分別稱取粉碎后過60目篩的黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆粉末2.5 mg于1.5 mL離心管中，加入1 mL超純水，渦旋混勻后，超聲提取30 s，以13500 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供UPLCMS/MS分析。

1.2.4.1 提取料液比的優(yōu)化 分別稱取2.5、5、10、20、50、80 mg豆類食品粉末，加入1 mL超純水，混勻，超聲提取30 s，過0.22 μm濾膜后，進樣檢測。

1.2.4.2 超聲提取時間的優(yōu)化 稱取2.5 mg豆類食品粉末，加入1 mL超純水，混勻，分別超聲提取10、20、30、60、120、300、600、1200 s，過0.22 μm濾膜后，進樣檢測。

1.2.5 方法學驗證

1.2.5.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限的測定 配制濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000 μg/L的6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸混合標準工作溶液，進行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的定量離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并計算信噪比，以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限。

1.2.5.2 加標回收率實驗 在已知含量的樣品溶液中分別添加低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液，各濃度水平6個平行樣本分析，計算各目標化合物的平均回收率。

1.2.5.3 穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性實驗 取6份平行的樣品按1.2.4方法處理后，分別在0、2、4、8、12、24、48、72 h測定，進行穩(wěn)定性試驗。取1份樣品溶液連續(xù)進樣測定6次，進行精密度試驗。取6份平行的樣品溶液進行測定，進行重復(fù)性試驗。在上述試驗中，記錄各目標化合物的峰面積，并計算相對標準偏差（RSD）。

1.2.6 樣品測定 用1.2.4方法對市售的黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等4種豆類食品進行前處理，用1.2.2和1.2.3方法進行上樣檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst 1.6.2軟件控制儀器，采集數(shù)據(jù)，Multi Quant 3.0.1軟件進行數(shù)據(jù)處理，Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)匯總和分析，Origin 2021軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 使用SB-C18色譜柱和Eclipse Plus C18RRHD色譜柱對1 μg/mL混合標準品溶液進行檢測時，分離度不如Zorbax SB-Aq RRHT色譜柱，且基線噪音較高，最終選擇Zorbax SB-Aq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）色譜柱（見圖1）。

圖 1 不同色譜柱對6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸檢測的影響Fig.1 Effect of different columns on the detection of 6 neurotransmitter amino acids

2.1.2 流動相的優(yōu)化 使用水-甲醇作為流動相時，目標化合物的響應(yīng)強度略高于使用水-乙腈作為流動相時的響應(yīng)強度，但在水-甲醇和水-乙腈兩種流動相體系里，目標化合物的分離度和峰形都有待改善，因此，考慮在流動相中加入甲酸、乙酸銨等改性劑。使用0.1%甲酸水溶液-甲醇做流動相時，響應(yīng)強度低，分離度差且基線噪音高（見圖2）。因此，最終選擇0.5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇體系作為流動相。

2.1.3 柱溫的優(yōu)化 柱溫對目標化合物的響應(yīng)強度沒有明顯的影響（見圖3），最終選擇接近于室溫的25 ℃作為柱溫。

圖 2 不同流動相對6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸檢測的影響Fig.2 Effect of different mobile phases on the detection of 6 neurotransmitter amino acids

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸均屬于極性化合物且化學結(jié)構(gòu)中含有氨基，易結(jié)合H+，因此，采用正模式測定。分別配制濃度為1 μg/mL的各目標化合物單標溶液，使用針泵恒流進樣的方式注入離子源，首先進行一級質(zhì)譜掃描，確定各目標化合物的母離子為[M+H]+，然后進行產(chǎn)物離子掃描，確定2個響應(yīng)強、干擾小的特征碎片離子，優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），使得確定的兩個子離子響應(yīng)最佳。6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的總離子流圖（TIC）見圖4，提取離子譜圖（XIC）見圖5。

圖 3 柱溫對6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸響應(yīng)強度的影響Fig.3 Effect of column temperature on response intensity of 6 neurotransmitter amino acids

圖 4 6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的總離子流圖（TIC）Fig.4 Total ion chromatogram(TIC) of 6 neurotransmitter amino acids

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取料液比的優(yōu)化 隨著豆類食品粉末在水溶液中的比例越來越小，基線噪音越來越小，同時目標化合物的響應(yīng)也越來越高（見圖6），最終選擇2.5 mg豆類食品粉末加入1 mL超純水的提取比例。

2.3.2 超聲提取時間的優(yōu)化 隨著超聲提取時間的延長，目標化合物的響應(yīng)強度先小幅上升，在超聲提取時間為30 s時達到最大，隨后開始下降，在超聲提取時間延長到600 s以上時，目標化合物的響應(yīng)強度開始大幅下降（見圖7），最終選擇超聲提取時間為

圖 5 甘氨酸（Gly）、γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、天冬氨酸（Asp）和天冬酰胺（Asn）的提取離子譜圖（XIC）Fig.5 Extracted ion chromatogram(XIC) of Gly, γ-GABA, Glu, Gln, Asp and Asn

圖 6 不同提取比例對6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸檢測的影響Fig.6 Effect of different extraction ratio on response intensity of 6 neurotransmitter amino acids

圖 7 不同超聲提取時間對6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸響應(yīng)強度的影響Fig.7 Effect of ultrasonic extraction time on response intensity of 6 neurotransmitter amino acids

30 s。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限 6種目標化合物在各自范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）為0.991~0.999。以信噪比S/N≥3計算，檢出限（LOD）為2~8 μg/kg，以信噪比S/N≥10計算，定量限（LOQ）為8~40 μg/kg（見表2）。

2.4.2 加標回收率 各目標化合物的平均回收率為80.30%~109.97%，相對標準偏差（RSD）為0.12%~7.20%（見表3）。

2.4.3 穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性 穩(wěn)定性實驗的相對標準偏差（RSD）值為4.74%~6.98%，精密度實驗的RSD值為0.63%~7.27%，重復(fù)性實驗的RSD值為0.46%~5.17%（見表4）。

2.5 樣品的測定

樣品測定結(jié)果如表5所示，黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆四種豆類食品中的甘氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺的平均含量（n=6）分別為14.96~56.89、6.37~59.6、443.43~653.63、9.15~22.47、71.54~95.06和472.08~2880.17 μg/g。

表 2 6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的線性關(guān)系、檢出限與定量限Table 2 Liner relationships, LODs and LOQs of 6 neurotransmitter amino acids

表 3 6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的加標回收率和相對標準偏差RSD（n=6）Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 6 neurotransmitter amino acids(n=6)

表 4 穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性試驗的相對標準偏差RSD（n=6）Table 4 The RSDs of stability, precision and repeatability tests (n=6)

表 5 豆類食品中6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的含量Table 5 Content of 6 neurotransmitter amino acids in legume foods

3 結(jié)論與討論

神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸是極性化合物，而黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆都是固體食品，本文在相關(guān)文獻[30,40?43]的研究基礎(chǔ)上，采用超聲輔助水提取法，提取豆類食品中的神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸，通過優(yōu)化前處理方法、色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)，建立了4種豆類食品中同時檢測6種神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的UPLCMS/MS分析方法。谷氨酰胺在1~100 μg/L范圍內(nèi)，天冬氨酸在5~500 μg/L范圍內(nèi)，甘氨酸和γ-氨基丁酸在10~200 μg/L，谷氨酸和天冬酰胺在100~2000 μg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）在0.991~0.999之間，在低、中、高三個不同加標濃度下的回收率為80.30%~109.97%，相對標準偏差（RSD）為0.12%~7.20%，檢出限和定量限分別為2~8、8~40 μg/kg。用該方法測得的黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等四種豆類食品中甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的含量低于文獻[44?47]中所報道的含量，原因在于該方法檢測的是游離態(tài)神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸，而文獻報道的是游離態(tài)和水解之后的結(jié)合態(tài)神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的總含量。黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等四種豆類食品中的天冬酰胺、谷氨酰胺和γ-氨基丁酸的含量尚未見文獻報道。

本文所建立的方法前處理簡單、分析時間短、靈敏度和準確度高，適用于黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆4種豆類食品的檢測，可推廣應(yīng)用于固體豆類食品中神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸的檢測分析，也為固體食品中氨基酸的測定提供參考，為我國的食品安全和質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。