楊 坤，劉桂瓊，管春成，陳光靜

（1.黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州凱里 556012；2.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550005）

磺胺類藥物（sulfonamides，sAs）是人工合成的具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的抗生素[1?3]，能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，具有較強(qiáng)的抗菌作用，因其優(yōu)異的抗菌譜廣、價(jià)廉、使用方便而廣泛用于畜牧生產(chǎn)。但磺胺類藥物的不合理使用，可通過肉類食品在人體內(nèi)蓄積而給人體造成各種潛在危害[4?6]，且磺胺類藥物存在嚴(yán)重副作用和潛在的致癌性，其耐藥性問題也日益嚴(yán)重。因此，我國(guó)以及歐盟、美國(guó)等大多數(shù)國(guó)家對(duì)食品中磺胺類藥物的最高殘留量均有明確規(guī)定，如我國(guó)規(guī)定所有食用動(dòng)物的肌肉、脂肪、肝、腎食品中磺胺類藥物的最大殘留量為0.1 mg/kg[7]。

磺胺類藥物殘留問題越來(lái)越受社會(huì)的關(guān)注，其檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法[8]、液相色譜法[9?10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11?17]等。酶聯(lián)免疫法屬于半定量篩查法，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。液相色譜法靈敏度低，抗干擾能力弱，定性效果差。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度和準(zhǔn)確度，但存在分析時(shí)間較長(zhǎng)。超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法可在較短時(shí)間內(nèi)分析目標(biāo)化合物，正逐漸成為獸藥殘留分析的有效手段。

磺胺類藥物殘留的前處理主要有液液萃取[18?19]、固相萃取[20?23]、基質(zhì)固相分散萃取[24?25]等方法，這些方法存在有機(jī)溶劑消耗量較大，操作復(fù)雜，檢測(cè)成本高等問題。PRiME HLB采用通過型的新型固相萃取柱，無(wú)需活化與平衡，只需上樣、淋洗和洗脫3個(gè)步驟即可完成樣品凈化過程，可將凈化速度提高40%[26]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)PRiME HLB前處理的研究報(bào)道，主要為孫曉冬等[27]測(cè)定了液態(tài)乳中14種真菌毒素；方靈等[28]測(cè)定了牛奶中38種抗生素；郝杰等[29]僅研究14種磺胺類藥物殘留等。而通過型固相萃取凈化技術(shù)，應(yīng)用于檢測(cè)雞肉中多種磺胺類藥物殘留的研究尚未報(bào)道。本研究采用PRiME HLB前處理方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立測(cè)定雞肉中23種磺胺類藥物的測(cè)定方法。該方法簡(jiǎn)便快速，易于操作，可為雞肉中多種磺胺類藥物殘留提供快速檢測(cè)方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇和乙腈 色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司；甲酸色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑；固相萃取小柱：Oasis PRiME HLB（60 mg，3 mL） 美國(guó)Waters公司；試驗(yàn)用水為超純水；16批雞肉樣品 購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；23種磺胺標(biāo)準(zhǔn)品（磺胺脒、磺胺醋酰、磺胺索嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧芐氨嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噁唑、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲基異噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺硝苯） 純度均≥98%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

Agilent 1290 Infinity II型液相色譜儀 配二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱，美國(guó)Agilent公司；AB SCIEX API 4000+質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) 配電噴霧離子源（ESI）及Analyst1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件，美國(guó)AB SCIEX公司；Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、手動(dòng)固相萃取裝置 美國(guó)Waters公司；Milli-Q純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；MS205DU電子天平 瑞士梅特勒-托利多（上海）儀器公司；3-18k型高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司；E.T平行氮吹濃縮儀 北京萊伯泰科儀器公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理方法 稱取2.5 g（精確至0.01 g）雞肉樣品至50 mL聚丙烯離心管中，加入80%乙腈溶液（含0.2%甲酸）10 mL，渦旋振蕩10 min，8000 r/min冷凍離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于20 mL容量瓶中，重復(fù)提取一次，合并上清液，用提取液定容至刻度，待凈化。

取Oasis PRiME HLB固相萃取柱，無(wú)需活化與平衡，用移液管吸取5.0 mL提取液上固相萃取柱，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，再用2 mL 80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）沖洗，收集并合并流出液，40 ℃氮吹干，用10%的甲醇溶液（含0.1%甲酸）溶解并定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液上機(jī)分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取10 mg（精確至0.1 mg）各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度均為1.00 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液；吸取各單標(biāo)儲(chǔ)備液1.0 mL至同一100 mL容量瓶中，以甲醇定容并混勻，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于?18 ℃下密閉保存。

1.2.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 按1.2.3操作獲得空白樣品凈化溶液。分別移取6份空白樣品凈化溶液1.0 mL于10 mL離心管中，分別加入質(zhì)量濃度為20 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、50、100、200、1000 μL，氮吹至近干，用10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的甲醇水溶液（含0.1%甲酸）溶解并定容至1.00 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、20.00 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液系列（該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用），經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液用于上機(jī)分析。

1.2.4 色譜條件 Waters Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；流速0.25 mL/min；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0~1.00 min，10%B；1.00~3.00 min，10%~20% B；3.00~7.00 min，20%~25% B；7.00~7.50 min，25%~60% B；7.50~9.00 min，60%~90% B；9.00~9.10 min，90%~10% B；9.10~12.00 min，10% B。

1.2.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）：正離子電離模式；去溶劑溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：172 kPa；碰撞氣壓力：41 kPa；離子氣1壓力：414 kPa；離子氣2壓力：379 kPa；噴霧電壓：5500 V；掃描方式：依賴保留時(shí)間的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（scheduled MRM），其他質(zhì)譜參數(shù)條件見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

方法重復(fù)性及回收率試驗(yàn)均做6次重復(fù)試驗(yàn)，采用Excel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析，儀器數(shù)據(jù)采集軟件為Analyst1.6.3，數(shù)據(jù)分析軟件為MultiQuant2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化 磺胺類藥物分析常用的提取溶劑為乙酸乙酯[19]、乙腈[4,25,28]、乙腈水溶液[17,26]等。乙腈為提取液為中等極性溶劑與磺胺類藥物的極性接近，能使蛋白質(zhì)變性沉淀且相對(duì)于乙酸乙酯不易提取出磷酯類等雜質(zhì)，因此，選擇乙腈作為提取溶劑，并分別考察90%乙腈水溶液、80%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液和60%乙腈水溶液4種提取溶液對(duì)目標(biāo)化合物提取效果，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，80%乙腈水溶液作為提取液時(shí)23種磺胺類藥物的回收率較高，分析原因是60%乙腈水溶液和70%乙腈水溶液提取后的提取液較混濁，基質(zhì)效應(yīng)大，90%乙腈水溶液提取液雖較澄清，但90%乙腈水溶液過固相萃取柱時(shí)由于乙腈比例過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)快速凝結(jié)成團(tuán)，從而阻止提取液進(jìn)入萃取柱內(nèi)部發(fā)生作用，這印證龔蘭[30]等在雞肉樣品中用80%乙腈水溶液提取6種磺胺類藥物回收率高。

由于磺胺類藥物化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有氨基和磺酰胺基，具有酸堿兩性，在提取液中加入一定比例的酸或堿提取可顯著提高回收率?？疾炝?0%乙腈水、80%乙腈水（含0.2%甲酸）和80%乙腈水（含0.2%氨水）3種提取溶液對(duì)回收率的影響，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，酸性提取劑可獲得更優(yōu)的回收率。因此，最終確定提取溶劑為80%乙腈水（含0.2%甲酸）。

圖 1 不同提取劑對(duì)磺胺藥物的平均回收率比較Fig.1 Comparison of average recovery rates of sulfonamides by different extracters

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)采用PRiME HLB固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，因此，需要考察Oasis PRiME HLB（200 mg，6 mL）的柱容量，比較了不同上樣體積的樣品凈化程度。結(jié)果表明，上樣液中體積≤5 mL時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)小，凈化效果明顯，而上樣體積為5~10 mL時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)逐漸增加，說(shuō)明上樣體積為5 mL時(shí)該柱對(duì)雜質(zhì)的吸附能力接近飽和，過多的上樣體積會(huì)造成部分雜質(zhì)無(wú)法吸附，隨目標(biāo)化合物共流出，導(dǎo)致凈化效果不理想。因此，本實(shí)驗(yàn)確定上樣體積為5 mL。

表 1 23種磺胺類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 23 sulfonamides

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)考察了Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）對(duì)23種磺胺類藥物的分離效果。發(fā)現(xiàn)Waters Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離效果好且有較高的靈敏度，質(zhì)譜圖見圖2。因此，選擇Waters Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為分離柱。

進(jìn)一步對(duì)流動(dòng)相的種類進(jìn)行考察，當(dāng)0.1%甲酸溶液作為水相選擇乙腈作為有機(jī)相時(shí)，磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺間甲氧嘧啶3種同分異構(gòu)體分離效果較差，把乙腈更換為甲醇為有機(jī)相時(shí)，上述3種待測(cè)物的分離的較好，結(jié)果見圖3，因此選擇甲醇作為有機(jī)相。選擇甲酸銨和乙酸銨作為水相時(shí)，磺胺硝苯和磺胺喹沙啉離子響應(yīng)特別低，在水溶液中加入少量甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)能改善磺胺硝苯和磺胺喹沙啉的響應(yīng)。因此，選擇0.1%甲酸溶液和甲醇作為流動(dòng)相。

圖 2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of mixed standard solution

圖 3 3種磺胺的同分異構(gòu)體色譜圖Fig.3 Chromatograms of three sulfonamides

2.2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 以流動(dòng)注射方式在離子源正離子模式下對(duì)23種磺胺藥物進(jìn)行母離子（Q1）全掃描，確定目標(biāo)化合物的母離子，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描（MS2），對(duì)去蔟電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)化合物選擇2對(duì)響應(yīng)值高的特征離子對(duì)作為定量及定性離子對(duì)，優(yōu)化后的質(zhì)譜具體參數(shù)見表1。在優(yōu)化后的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)下，23種磺胺藥物化合物的質(zhì)譜圖見圖3，從圖可知，23種磺胺類藥物具有較好的分離度和靈敏度。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估 按“1.2.1”方法進(jìn)行前處理，“1.2.2”方法配制雞肉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液及純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液并作校準(zhǔn)曲線，按基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值大小顯示基質(zhì)效應(yīng)，斜率比越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小[31?32]，結(jié)果見圖4。從圖可知，只有磺胺脒和磺胺硝苯基質(zhì)效應(yīng)抑制較大。因此，選擇用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線來(lái)校正基質(zhì)效應(yīng)對(duì)其定量的影響。

圖 4 23種磺胺化合物在雞肉中的基質(zhì)效應(yīng)圖Fig.4 Matrix effect diagram of 23 sulfonamides in chicken

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限 在優(yōu)化的提取凈化和UPLC-MS/MS分析條件下，23種化合物在雞肉空白樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9996~0.9999，以定量離子3倍信噪比（S/N=3）得到檢出限（LOD），以定量離子10倍信噪比（S/N=10）得到定量限（LOQ），雞肉樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)見表2。

2.3.3 實(shí)際樣品的檢測(cè)和加標(biāo)回收率 采用本方法對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)16批次雞肉進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出目標(biāo)化合物。在雞肉空白樣品基質(zhì)中各添加質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0 μg/kg三水平的23種磺胺類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定回收率，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，3個(gè)添加水平下雞肉樣品中23種磺胺獸藥的平均回收率為66.12%~99.83%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.72%~10.36%。結(jié)果表明，該方法回收率較好，適用于雞肉中23種磺胺類藥物殘留檢測(cè)的方法要求。

表 2 23種磺胺類獸藥在雞肉樣品中標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Standard curve, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 23 sulfonamides in chicken samples

表 3 實(shí)際空白樣品中23種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Spiked recoveries rate and relative standard deviations of 23 sulfonamide drugs in real blank samples (n=6)

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用PRiME HLB前處理凈化技術(shù)，以超高效液相色譜-四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法建立了雞肉中23種磺胺類藥物殘留的檢測(cè)方法，通過對(duì)提取溶劑和凈化條件的優(yōu)化，樣品經(jīng)80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）提取，取5 mL提取液過固相萃取柱，在優(yōu)化后的儀器條件下，23種磺胺類藥物在線性范圍0.2~20 ng/mL上具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.1~2.0 μg/kg，定量限為0.25~5.0 μg/kg，在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下上平均回收率為66.12%~99.83%，RSD為0.72%~10.36%，本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，適用于雞肉中多種磺胺類藥物殘留的檢測(cè)。