吳鵬濤，李杭慶，李 琛，李 鵬，王珍珍，章亭洲，葛 青,, ，毛建衛(wèi),3,

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同中心，浙江杭州 310023；2.浙江科峰生物科技有限公司，浙江嘉興 314000；3.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江紹興 312000）

隨著生活水平的提高，人們對肉制品的需求量日益劇增，從而促使了畜牧業(yè)的快速發(fā)展。目前，作為飼料資源的餅粕、牧草及常規(guī)飼料糧的供需缺口已經(jīng)越來越大。需要發(fā)展新型飼料來填補(bǔ)空缺，而構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）是一種優(yōu)質(zhì)的非常規(guī)蛋白飼料資源，具有極強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性，廣泛分布于我國黃河、長江及珠江流域，是一種多功能綜合性經(jīng)濟(jì)樹種，應(yīng)用于造紙、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)[1?2]。雖然構(gòu)樹葉含有豐富的粗蛋白，但是因?yàn)榭範(fàn)I養(yǎng)因子的存在，動物不能完全吸收利用構(gòu)樹葉飼料。研究表明構(gòu)樹葉中的抗?fàn)I養(yǎng)因子主要為單寧[3]。單寧能與生物堿、核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生很強(qiáng)的復(fù)合作用，從而阻礙這些物質(zhì)的生物降解[4]。單寧與生物大分子的這種結(jié)合會對動物產(chǎn)生許多不利影響，例如與動物口腔中唾液蛋白結(jié)合，產(chǎn)生苦澀味道；與動物細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)、磷脂和多糖等成分結(jié)合，使動物細(xì)胞膜通透性改變；與蛋白質(zhì)結(jié)合，降低動物對飼料的消化率[5?7]。Teixeira等[8]發(fā)現(xiàn)用部分高粱（高粱主要抗?fàn)I養(yǎng)因子為單寧）代替大米進(jìn)行飼養(yǎng)成犬，消化率明顯降低。Omnes等[9]飼喂10 g/kg含單寧日糧的魚類其蛋白質(zhì)消化率明顯低于飼喂對照日糧的魚類，添加單寧到魚飼料中，單寧攝入可顯著降低累積采食量、生長、飼料和蛋白質(zhì)效率、表觀消化系數(shù)、肝體指數(shù)和胴體脂類。

目前，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧有很多途徑。通過物理、化學(xué)、生物和其他方法處理來削弱單寧的抗?fàn)I養(yǎng)性。現(xiàn)有研究表明，通過微生物來降解植物飼料中的單寧，不僅對單寧的去除高效徹底，而且成本較低、不污染環(huán)境，是解決其抗?fàn)I養(yǎng)性的有效途徑[10]。微生物對單寧的降解主要通過兩種途徑來實(shí)現(xiàn)：一是微生物向細(xì)胞外分泌可以和單寧高度親和的物質(zhì)，使其不能與生物體內(nèi)維持生命所必需的物質(zhì)相結(jié)合；二是分泌可使單寧降解的酶類并作用于單寧，使其轉(zhuǎn)化成微生物生長所需要的物質(zhì)和能量[11]。

蒸汽爆破預(yù)處理主要是利用高溫高壓蒸汽，通過瞬間釋放壓力過程，實(shí)現(xiàn)原料的組分離散和結(jié)構(gòu)變化[12]。汽爆使接觸面積增大，更有利于發(fā)酵。應(yīng)用球磨技術(shù)，可將各類構(gòu)樹葉加工成超細(xì)粉，具有很好的固香性、分散性和溶解性，特別容易消化吸收，能最大限度地利用原料、節(jié)約資源。楊華等[13]通過高壓蒸汽爆破處理使秸稈的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)得到改變，結(jié)合有益菌發(fā)酵顯著提高了秸稈的營養(yǎng)價(jià)值。本文旨在研究不同處理方式復(fù)合菌固體發(fā)酵構(gòu)樹葉制備蛋白飼料的工藝條件優(yōu)化，并跟蹤發(fā)酵過程中酶活力和微生物生長情況。實(shí)驗(yàn)為后續(xù)構(gòu)樹葉作為非常規(guī)飼料投入生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

構(gòu)樹葉 采自于杭州市西湖區(qū)浙江科技學(xué)院，曬干磨粉過20目篩；釀酒酵母菌BY4741、乳酸菌JI2176、枯草芽孢桿菌KD-N2 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；沒食子酸（分析純）

國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；無水碳酸鈉（分析純） 天津市化學(xué)試劑研究所有限公司；乙醇、單寧酸等（以上均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚（分析純） 上海長哲生物科技有限公司；胰蛋白胨、蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉等（以上均為生物試劑） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MRS肉湯（生物試劑） 杭州百思生物技術(shù)有限公司。

UDK159凱氏定氮儀、FIWE6纖維素測定儀、SER 148脂肪測定儀 意大利VELP；X3R高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV-5500PC型紫外分光光度計(jì) 上海市元析儀器有限公司；PTXFA210型電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司；SB-130旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化；JXFSTPRP-24全自動樣品快速研磨機(jī) 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；QBS-800汽爆試驗(yàn)臺 鶴壁正道生物能源有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵飼料的制作 稱取適量的構(gòu)樹葉粉置于250 mL錐形瓶內(nèi)在超凈臺上紫外滅菌2 h。按物料:菌液:去離子水一定比例配比混合拌勻，加塞，置于培養(yǎng)箱在合適溫度的環(huán)境下培養(yǎng)。菌種發(fā)酵構(gòu)樹葉到一定時(shí)間取出置于烘箱60 ℃下烘干，冷卻裝入樣品袋。

1.2.2 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取單寧酸5 mg，用少量去離子水溶解后移入50 mL容量瓶中定容，配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。取6個(gè)50 mL容量瓶，先在每個(gè)容量瓶中裝約30 mL去離子水，再分別量取單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于容量瓶中，分別加入2.5 mL福林酚試劑、5 mL飽和碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度處，最后超聲使溶液混勻，放置30 min后開始測定吸光度，以未加單寧的混合液做空白，在756 nm處[14]測定吸光值，并以單寧含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：

y=1.946x+0.00589，R2=0.9994。

1.2.3 單寧的提取及含量測定 準(zhǔn)確稱取構(gòu)樹葉飼料樣品1 g（精確到0.0001 g），加入50 mL提取試劑（體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇溶液），置于70 ℃的恒溫水浴鍋中加熱回流40 min，以雙層濾紙過濾，得到的澄清溶液即為單寧溶液。量取1 mL單寧溶液于裝有30 mL去離子水的容量瓶中，按照上述制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的順序依次加入2.5 mL福林酚試劑、5 mL飽和碳酸鈉溶液，靜置30 min后，在756 nm處測定吸光度[15]。單寧含量的計(jì)算，公式如下：

式中：B：測定到的吸光光度值并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算處相應(yīng)50 mL溶液里面的單寧含量，mg；m：樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 不同預(yù)處理對構(gòu)樹葉抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響

1.2.4.1 汽爆條件優(yōu)化 稱取300 g構(gòu)樹葉原料，用汽爆試驗(yàn)臺爆破，在蒸汽壓強(qiáng)1.4 MPa的條件下，考察維壓時(shí)間（60、120、180、240、300 s）對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響；在維壓時(shí)間120 s的條件下，考察蒸汽壓強(qiáng)（1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 MPa）對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響，每個(gè)處理三組重復(fù)。

在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取蒸汽壓強(qiáng)（1.3、1.4、1.5 MPa）和維壓時(shí)間（90、120、150 s），并研究不同條件下對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響，每個(gè)處理三組重復(fù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。得到構(gòu)樹葉汽爆粉。

表 1 汽爆條件優(yōu)化設(shè)計(jì)Table 1 Optimization design of steam explosion conditions

1.2.4.2 球磨條件研究 稱取1 g構(gòu)樹葉原料置于研磨儀中，考查球磨時(shí)間（5、10、15、20、25 min），研究球磨時(shí)間對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響。得到構(gòu)樹葉球磨粉。

1.2.5 構(gòu)樹葉發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

1.2.5.1 構(gòu)樹葉發(fā)酵菌種配比的優(yōu)化 稱取5 g構(gòu)樹葉原料，按1.2.1方法發(fā)酵，在30 ℃、含水量40%，發(fā)酵3 d的條件下考查菌種配比（酵母菌:芽孢桿菌:乳酸菌分別為1:1:1、2:1:1、3:1:1、1:2:1、2:2:1、3:2:1、1:3:1、2:3:1、3:3:1），研究菌種配比對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響，每個(gè)處理三組重復(fù)。

1.2.5.2 發(fā)酵溫度對單寧含量的影響 稱取5 g構(gòu)樹葉原料，按1.2.1方法發(fā)酵，在發(fā)酵3 d、含水量40%的條件下，把構(gòu)樹葉分別置于24、27、30、33、36、39 ℃的培養(yǎng)箱恒溫發(fā)酵，通過測定單寧含量來確定最佳的發(fā)酵溫度。

1.2.5.3 發(fā)酵時(shí)間對單寧含量的影響 稱取5 g構(gòu)樹葉原料，按1.2.1方法發(fā)酵，在33 ℃、含水量40%的條件下，構(gòu)樹葉分別發(fā)酵1、2、3、4、5、6 d，通過測定單寧含量來確定最佳的發(fā)酵時(shí)間。

1.2.5.4 含水量對單寧含量的影響 稱取5 g構(gòu)樹葉原料，按1.2.1方法發(fā)酵，構(gòu)樹葉含水量20%、30%、40%、50%、60%、70%，在33 ℃、發(fā)酵4 d的條件下，通過測定單寧含量來確定最佳的含水量。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度（A，℃）、發(fā)酵時(shí)間（B，d）、含水量（C，%），以構(gòu)樹葉中單寧含量（%）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。其因素水平編碼表見表2。

表 2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平表及編碼Table 2 Box-Behnken experimental factor level table and coding

1.2.7 不同方式處理發(fā)酵參數(shù) 原料發(fā)酵參數(shù)：構(gòu)樹葉原料，發(fā)酵時(shí)間4 d，含水量60%，發(fā)酵溫度32.50 ℃，釀酒酵母菌:乳酸菌:枯草芽孢桿菌為1:1:1。

球磨發(fā)酵參數(shù)：構(gòu)樹葉球磨粉，發(fā)酵時(shí)間4 d，含水量60%，發(fā)酵溫度32.50 ℃，釀酒酵母菌:乳酸菌:枯草芽孢桿菌為1:1:1。

汽爆發(fā)酵參數(shù)：構(gòu)樹葉汽爆粉，發(fā)酵時(shí)間4 d，含水量60%，發(fā)酵溫度32.50 ℃，釀酒酵母菌:乳酸菌:枯草芽孢桿菌為1:1:1。

1.2.8 營養(yǎng)成分測定方法 粗蛋白（CP）的測定采用GB/T 6432-2018的方法，粗纖維（CF）的測定采用DB37/T 3370-2018的方法；粗灰分（Ash）的測定采用GB/T 6438-2007的方法；粗脂肪（EE）的測定采用GB/T 6433-2006的方法；鈣（Ca）的測定采用GB/T 6436-2018的方法，磷（P）的測定采用GB/T 6437-2018的方法。

1.2.9 單寧酶活力測定

1.2.9.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取0.1701 g沒食子酸用去離子水溶解后移入1000 mL容量瓶中定容，配制成0.1 mmol/L溶液，分別吸取0、2、4、6、8、10 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液到50 mL容量瓶中定容，配制成6個(gè)不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取0.5 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.3 mL甲醇繞丹寧溶液（0.05 mol/L)，加到所有試管中，在30 ℃反應(yīng)5 min。將0.2 mL（0.5 mol/L）的KOH水溶液加入到所有的試管后，再次在30 ℃水浴5 min，最后在所有試管中加入4 mL蒸餾水稀釋,以蒸餾水作空白，在520 nm波長下測定吸光值，得到?jīng)]食子酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。并以沒食子酸濃度（μmol/L）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：

y=0.003x?0.0023，R2=0.9988。

1.2.9.2 單寧酶活力測定 此方法是根據(jù)沒食子酸（單寧酶催化沒食子酸丙酯水解產(chǎn)生沒食子酸）與甲醇羅丹寧在堿性條件下之間形成色團(tuán)物質(zhì)的方法來測定單寧酶的活性，將30 ℃條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol沒食子酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（1 U）。取三支潔凈的試管分別標(biāo)記為空白管、測試管、對照管。將底物沒食子酸丙酯（0.01 mol/L）以及粗酶液在反應(yīng)開始之前先放入30 ℃水浴中預(yù)熱10 min。在被標(biāo)記的三支試管中都加入0.25 mL沒食子酸丙酯溶液，接著取0.25 mL檸檬酸緩沖液（pH=5，0.1 mol/L）加入空白管中，0.25 mL粗酶液加入到測試管中后將三支試管都放入30 ℃水浴10 min，然后將0.3 mL甲醇羅丹寧溶液（0.05 mol/L）加入所有試管中，30 ℃水浴10 min，之后取0.2 mL的KOH（0.5 mol/L）溶液加入所有試管中，30 ℃水浴10 min，然后僅在對照管的反應(yīng)混合物中加入0.25 mL粗酶液，搖勻充分混合。最后每支試管都加入4 mL去離子水，在30 ℃下保溫10 min后，在520 nm波長下測定反應(yīng)混合物的吸光值，以去離子水為參比溶液。所有測試都做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取算術(shù)平均值。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線換算酶活力。

1.2.10 微生物多樣性 參照GB 4789.35-2016對飼料中的乳酸菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，參照GB/T 26428-2010對飼料中的枯草芽孢桿菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，參照GB 4789.15-2016對飼料中的酵母菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin2017和SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測定數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各項(xiàng)測定均三次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 汽爆條件優(yōu)化

2.1.1 維壓時(shí)間對單寧含量的影響 由圖1可知，在汽爆壓強(qiáng)1.6 MPa的條件下，隨著維壓時(shí)間的延長，單寧含量呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢。維壓120 s時(shí)具有顯著性差異（P<0.05）。原因是由于水蒸氣與構(gòu)樹葉接觸的時(shí)間延長，讓一部分單寧發(fā)生了聚合或縮合反應(yīng)，同時(shí)將構(gòu)樹葉中未被檢測出的單寧釋放出來。當(dāng)維壓時(shí)間在120 s對構(gòu)樹葉中得到單寧含量最低，此時(shí)構(gòu)樹葉中的單寧含量為2.19%，因此選擇維壓時(shí)間120 s進(jìn)一步優(yōu)化汽爆條件。

圖 1 維壓時(shí)間對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響Fig.1 Effect of pressure maintaining time on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

圖 2 汽爆壓強(qiáng)對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響Fig.2 Effect of steam explosion pressure on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.1.2 汽爆壓強(qiáng)對單寧含量的影響 由圖2可知，在維壓時(shí)間120 s的條件下，構(gòu)樹葉中單寧含量隨著汽爆壓強(qiáng)的增加先增加后降低最后又呈增加趨勢。汽爆壓強(qiáng)為1.4 MPa時(shí)含量最低，單寧含量為1.68%。剛開始單寧含量升高的原因是構(gòu)樹葉中未被檢測到的單寧釋放出來，隨著壓強(qiáng)的增加，蒸汽不斷擠壓構(gòu)樹葉結(jié)塊，導(dǎo)致蒸汽無法進(jìn)去結(jié)塊內(nèi)部，使單寧無法被降解[16]。汽爆壓強(qiáng)在1.4 MPa時(shí)最有利分解單寧。因此選擇汽爆壓強(qiáng)1.4 MPa、維壓時(shí)間120 s進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.3 汽爆條件的優(yōu)化與選擇 由圖3可知，汽爆壓強(qiáng)1.3 MPa時(shí)，構(gòu)樹葉中單寧含量隨著維壓時(shí)間的增加而減少。汽爆壓強(qiáng)在1.4、1.5 MPa時(shí)，單寧含量隨著維壓時(shí)間的增加而增加。相同維壓時(shí)間，單寧含量隨著汽爆壓強(qiáng)的增加先減小后增加。驗(yàn)證了汽爆壓強(qiáng)和維壓時(shí)間對構(gòu)樹葉中單寧含量具有一定的影響，單寧含量減低是因?yàn)槠瑫到鈫螌帯Ｉ呤且驗(yàn)檎羝粩鄶D壓構(gòu)樹葉結(jié)塊，導(dǎo)致蒸汽無法就如結(jié)塊內(nèi)部。氣爆壓強(qiáng)1.4 MPa、維壓時(shí)間90 s時(shí)構(gòu)樹葉中的單寧含量最低，有顯著性差異（P<0.05）。因此，以單寧含量為指標(biāo)，汽爆的最佳條件選擇汽爆壓強(qiáng)1.4 MPa、維壓時(shí)間90 s。

圖 3 汽爆條件對構(gòu)樹葉單寧含量的影響Fig.3 Effect of steam explosion conditions on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.2 球磨對單寧含量的影響

由圖4可知，構(gòu)樹葉中單寧含量先隨著球磨時(shí)間的延長而增加，到了10 min之后，單寧含量呈下降趨勢，20 min之后單寧含量呈上升趨勢。球磨20 min時(shí)，構(gòu)樹葉中單寧含量最低，單寧含量為1.7%，降單寧效果具有顯著性差異（P<0.05）。單寧含量降低的原因是，球磨過程中產(chǎn)生大量熱量導(dǎo)致單寧降解。因此，以單寧含量為指標(biāo)，球磨構(gòu)樹葉的球磨時(shí)間宜選擇20 min。

圖 4 球磨時(shí)間對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響Fig.4 Effect of ball milling time on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.3 發(fā)酵構(gòu)樹葉菌種配比的選擇

從圖5可知，酵母菌:芽孢桿菌:乳酸菌=1:1:1時(shí)發(fā)酵構(gòu)樹葉，單寧含量最低，此時(shí)含量為1.81%，降單寧效果有顯著性差異（P<0.05）?；炀l(fā)酵時(shí)，菌種會有協(xié)同作用，也會抑制其他菌的生長，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇酵母菌:芽孢桿菌:乳酸菌=1:1:1時(shí)發(fā)酵構(gòu)樹葉。

圖 5 菌種配比對發(fā)酵構(gòu)樹葉單寧含量的影響Fig.5 Effect of strain ratio on tannin content in fermented Broussonetia papyrifera leaves

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 發(fā)酵溫度對單寧含量的影響 由圖6可知，發(fā)酵溫度在24~33 ℃，單寧含量呈下降趨勢；超過33 ℃，單寧含量呈上升趨勢，因此可以確定33 ℃是構(gòu)樹葉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的最佳溫度，此時(shí)單寧含量1.31%。一部分原因是因?yàn)殡S著溫度對菌種活性的影響，酵母菌產(chǎn)生胞外單寧酶對單寧進(jìn)行一定的降解，當(dāng)溫度超過33 ℃時(shí)，菌種的活性變?nèi)酰瑢螌幍慕到庖沧內(nèi)?，?dǎo)致溫度升高，單寧的含量反而呈上升趨勢；另一個(gè)原因是單寧屬于多酚，多酚隨著溫度升高會發(fā)生自縮合或聚合，含量降低[17]。因此，確定最近的發(fā)酵溫度是33 ℃。

圖 6 發(fā)酵溫度對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.4.2 發(fā)酵時(shí)間對單寧含量的影響 由圖7可知，發(fā)酵第1~2 d時(shí)，構(gòu)樹葉單寧含量呈降低趨勢，第3 d單寧含量增加，到第4 d時(shí)降單寧效果最佳，此時(shí)單寧含量為1.53%，之后又開始呈升高趨勢?？赡茉蚴?，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌的活性變強(qiáng)，單寧酶增加導(dǎo)致單寧分解。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物把許多大分子降解為小分子，其中含有酚類物質(zhì)，這就導(dǎo)致了單寧含量又開始上升。構(gòu)樹葉中的單寧縮合物在發(fā)酵開始時(shí)處于不溶于水的狀態(tài)而未被檢測出來，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，縮合物水解出來進(jìn)而轉(zhuǎn)化成了單寧[18]。由于微生物在固態(tài)發(fā)酵的封閉環(huán)境中，氧氣被逐漸消耗，微生物的呼吸方式變成無氧呼吸，微生物體內(nèi)的新陳代謝途徑發(fā)生變化，導(dǎo)致新生成的單寧未被立即分解[19]。因此，確定最佳的發(fā)酵時(shí)間是4 d。

圖 7 發(fā)酵時(shí)間對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.4.3 含水量對單寧含量的影響 由圖8可知，隨著含水量增加，構(gòu)樹葉單寧含量呈降低趨勢，此時(shí)單寧含量為1.50%，含水量60%時(shí)降單寧具有顯著性差異（P<0.05），之后又開始呈升高趨勢?？赡茉蚴怯捎诟咚衷黾恿斯腆w構(gòu)樹葉中的物料膨脹，微生物能更充分地與物料接觸獲得營養(yǎng)物質(zhì)和足夠的氧氣，更好地生長[20]。含水量對發(fā)酵飼料pH變化有顯著影響，但含水量過高或過低不利于pH的降低[21]。因此，確定最佳的含水量是60%。

圖 8 含水量對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響Fig.8 Effect of water content on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及回歸方程擬合 利用Design-Expert V8.0.6軟件，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式回歸方程分析，結(jié)果見表3。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸擬合，得到自變量與單寧含量的二次回歸方程方程式為：Y=1.35+0.12C?0.075AC+0.48A2+0.63B2+0.38C2。

表 3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

2.5.2 響應(yīng)面模型方差及顯著性分析 對回歸方程進(jìn)行方差分析結(jié)果如表4。由表4可知，該回歸模型高度顯著（P<0.001），失擬項(xiàng)F值為1.06，P為0.4584（P>0.05），失擬項(xiàng)不顯著，表明擬合度良好，能較好解釋響應(yīng)面中的變異。模型決定系數(shù)R2=0.9876，校準(zhǔn)決定系數(shù)R2Adj=0.9716，說明該擬合度良好，能用該模型分析和預(yù)測發(fā)酵構(gòu)樹葉制備工藝過程中各參數(shù)的變化。模型回歸系數(shù)顯著性分析顯示，一次項(xiàng)C極顯著（P<0.01），二次項(xiàng)A2、B2、C2對降抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響均為高度顯著（P<0.001）。各因素顯著性程度依次為發(fā)酵溫度>含水量>發(fā)酵時(shí)間。

表 4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.5.3 交互作用分析結(jié)果 由圖9可知，單寧含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，含水量增加以及發(fā)酵溫度的升高均呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢，說明兩兩因素交互中均存在極小值且極值對應(yīng)的點(diǎn)接近橢圓的中心。同時(shí)觀察到響應(yīng)面斜率隨發(fā)酵溫度的變化而變化較大，說明發(fā)酵溫度對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響大于發(fā)酵時(shí)間和含水量，與上述方差分析結(jié)果相一致。

圖 9 各因素交互作用對構(gòu)樹葉中單寧含量的影響Fig.9 Effect of interaction of various factors on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.5.4 模型驗(yàn)證結(jié)果 經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時(shí)間4 d，含水量60%，發(fā)酵溫度32.50 ℃，預(yù)測該條件下構(gòu)樹葉單寧含量為1.34%。根據(jù)所擬合的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行三次，取平均值得到構(gòu)樹葉單寧含量為1.42%，誤差值為0.03%，與預(yù)測值接近，證明了該方程的可行度和準(zhǔn)確性。

2.6 常規(guī)營養(yǎng)成分分析

由表5可知，原料的粗蛋白含量為16.83%，經(jīng)過發(fā)酵構(gòu)樹葉中粗蛋白含量為20.80%，差異性顯著（P<0.05），粗蛋白含量提高了23.59%，經(jīng)汽爆后發(fā)酵和球磨后發(fā)酵的粗蛋白分別提高了10.28%和7.84%；原料的粗纖維含量為15.66%，經(jīng)過發(fā)酵粗纖維含量降低了15.33%（P<0.05），經(jīng)汽爆后發(fā)酵和球磨后發(fā)酵的粗纖維分別降低了12.32%和7.85%；原料的鈣含量為2.70%，經(jīng)發(fā)酵后鈣含量無明顯變化，經(jīng)汽爆發(fā)酵后和球磨后發(fā)酵分別增加了23.33%和22.22%（P<0.05）。預(yù)處理和發(fā)酵對磷、粗灰分和粗脂肪的含量幾乎無影響，磷含量在0.3%左右，粗脂肪含量在2.4%左右。

表 5 常規(guī)營養(yǎng)成分表（%，干基）Table 5 Table of conventional nutrients (%, dry basis)

2.7 發(fā)酵過程中的酶活力

由圖10可知，從發(fā)酵開始到發(fā)酵第3 d，酶活力不斷增加，且在第3 d酶活力最高，球磨發(fā)酵、汽爆發(fā)酵和原料發(fā)酵的酶活力分別達(dá)到了65.10、44.77和41.43 U。到了第4 d，酶活力開始下降。在第3 d的時(shí)間，按酶活力大小進(jìn)行排序：球磨發(fā)酵>汽爆發(fā)酵>原料發(fā)酵。與2.6中降單寧的結(jié)果一致，說明單寧酶活力越大，降單寧效果越好，符合實(shí)驗(yàn)的規(guī)律。

圖 10 構(gòu)樹葉發(fā)酵過程中的酶活力Fig.10 Enzyme activity of Broussonetia papyrifera leaves during fermentation

2.8 發(fā)酵過程中微生物多樣性

構(gòu)樹葉發(fā)酵過程中的益生菌計(jì)數(shù)結(jié)果見表6。酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌的總菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，發(fā)酵到第3 d的時(shí)候，菌落總數(shù)最多。原料發(fā)酵的酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌分別為6.0×107、1.1×108和3.0×106CFU·g?1。球磨發(fā)酵的酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌分別為2.25×107、1.1×108和5.5×106CFU·g?1。汽爆發(fā)酵的酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌分別為2.0×107、9.0×107和2.5×106CFU·g?1。

表 6 構(gòu)樹葉發(fā)酵過程中的益生菌計(jì)數(shù)結(jié)果Table 6 Probiotic counting results during fermentation of Broussonetia papyrifera leaves

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用蒸汽爆破、球磨等方式對構(gòu)樹葉進(jìn)行預(yù)處理，以抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧含量為考察指標(biāo)，通過響應(yīng)面分析法確定枯草芽孢桿菌、乳酸菌和釀酒酵母菌的復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵構(gòu)樹葉制備蛋白飼料的最佳工藝。最佳工藝條件為：汽爆壓強(qiáng)1.4 MPa，維壓時(shí)間90 s；球磨時(shí)間20 min；發(fā)酵時(shí)間4 d，含水量60%，發(fā)酵溫度32.50 ℃，釀酒酵母菌:乳酸菌:枯草芽孢桿菌=1:1:1。構(gòu)樹葉經(jīng)發(fā)酵、汽爆后發(fā)酵和球磨后發(fā)酵單寧含量分別降低了36.2%、39.5%和60.5%；粗蛋白含量分別增加了23.59%、10.28%和7.84%。原料發(fā)酵、汽爆發(fā)酵和球磨發(fā)酵的酶活力分別高達(dá)41.43、44.77和65.10 U。

本實(shí)驗(yàn)通過球磨和汽爆處理構(gòu)樹葉發(fā)酵的蛋白質(zhì)增加率低于未處理是因?yàn)槲⑸锏纳顒舆^程中會消耗營養(yǎng)物質(zhì)，球磨和汽爆處理可以加快發(fā)酵時(shí)間，其發(fā)酵條件還可以進(jìn)一步優(yōu)化。發(fā)酵構(gòu)樹葉提高了蛋白質(zhì)含量，降低了單寧含量，大大提高了構(gòu)樹葉的利用度，可以緩解目前畜禽飼料短缺的問題。

構(gòu)樹葉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜和抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧的存在，導(dǎo)致動物難以消化和吸收利用，這降低了飼料的營養(yǎng)價(jià)值。通過微生物的發(fā)酵，降解構(gòu)樹葉中復(fù)雜蛋白質(zhì)為動物可消化的氨基酸、小肽等易被動物消化利用的形式并降解掉其中的粗纖維，構(gòu)樹葉完全可以成為應(yīng)用廣發(fā)的綠色飼料資源[22]。通過發(fā)酵，微生物降解單寧，實(shí)質(zhì)上是微生物分泌的單寧酶作用于單寧分子中的醋鍵，使之降解成倍酸（或靴花酸）和葡萄糖，而且微生物還可繼續(xù)分泌其他酶（如多酚氧化酶等），進(jìn)一步將其降解為芳香族脂肪酸等小分子物質(zhì)[3]。管維等[23]等通過微生物發(fā)酵，菜籽餅的單寧降解率14.75%，葉添梅等[24]等通過混菌發(fā)酵處理，桑葉的單寧降解率46.35%。本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)樹葉直接發(fā)酵，單寧降解率為36.2%，通過球磨處理后發(fā)酵，單寧降解率為60.5%，大大提高了降解率。Jazi等[25]通過發(fā)酵處理，發(fā)酵7 d后棉粕中粗蛋白含量增加了7.92%。李海新[22]用米酒曲酶發(fā)酵構(gòu)樹葉，粗蛋白含量增加了5.29%。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)發(fā)酵構(gòu)樹葉中粗蛋白含量為20.80%，差異性顯著（P<0.05），粗蛋白含量提高了23.59%，汽爆后發(fā)酵和球磨后發(fā)酵粗蛋白含量分別增加了10.28%和7.84%，本實(shí)驗(yàn)大大提高了粗蛋白的增加量。