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        體外模擬胃腸消化對古茶樹葉酵素中活性成分和抗氧化活性的影響

        2021-09-29 14:13:36葉超悅范昊安鮑海媚王珍珍沙如意胡新榮李朵矯袁名安毛建衛(wèi)
        食品工業(yè)科技 2021年18期
        關(guān)鍵詞:酵素胃液兒茶素

        葉超悅,范昊安,鮑海媚,王珍珍,沙如意, ,方 晟,胡新榮,江 麗,李朵矯,袁名安,毛建衛(wèi),4,

        (1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310023;2.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院,浙江紹興 312000;3.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江金華 321000;4.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江紹興 312000)

        食用酵素是以一種或幾種新鮮的果蔬、谷豆類和食藥兩用草本類等食材為原料,經(jīng)多種微生物長時間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性產(chǎn)品[1],含有豐富的次級代謝物、益生菌和原料本身的維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分等[2],具有清除自由基、抗氧化[3]、降血脂、提高免疫力等[4]生理功能。

        茶樹(Camellia sinensisL.)是屬于山茶科(Theaceae)、山茶屬(Camellia)的植物[5],樹齡達(dá)百年以上可稱作古茶樹。茶樹葉是茶樹的葉子和芽,對人體具有減脂[6]、抗氧化[7]等保健功能。目前,以茶樹葉為原料加工制作的保健品較少,通過微生物發(fā)酵制備古茶樹葉酵素,可以在保留茶葉本身活性成分的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步增強(qiáng)其營養(yǎng)價值及和保健功能,實(shí)現(xiàn)其高價值利用的目的。

        茶葉中的主要生物活性成分有多酚、類黃酮、花青素等物質(zhì),類黃酮物質(zhì)是茶葉中普遍存在的次生代謝產(chǎn)物,類黃酮途徑包括花青素、原花青素、黃酮醇等多個途徑。其中花青素在花青素還原酶的作用下生產(chǎn)表兒茶素,無色花青素在五色花青素還原酶作用下生成兒茶素,兒茶素、表兒茶素等類黃酮途徑產(chǎn)物可聚合成原花青素。其中,多酚類、黃酮類物質(zhì)、花青素類以及兒茶素類物質(zhì)有著密不可分的關(guān)系[8]。研究表明,茶葉中的多酚類物質(zhì)被吸收之前,易在胃腸道中發(fā)生降解或結(jié)構(gòu)變化,導(dǎo)致其生物活性隨之改變,尤其是抗氧化活性在消化前后差異巨大[9?10]。茶葉酵素作為即食食品,其生物活性成分在消化過程中也會發(fā)生變化,但體內(nèi)研究天然產(chǎn)物的生物活性較為復(fù)雜且昂貴,采用體外模擬胃腸消化則是一種低成本且較接近真實(shí)體內(nèi)消化的方法。國內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)對藍(lán)莓、山楂、柑橘等多種食品進(jìn)行了體外消化模擬實(shí)驗(yàn),研究其在消化模擬過程中酚類物質(zhì)的變化規(guī)律[11?13]。

        目前尚未有探究茶樹葉酵素在消化過程中活性成分含量及抗氧化活性變化規(guī)律的相關(guān)研究報(bào)道,故本試驗(yàn)采用體外模擬胃腸消化法,探討消化過程中茶樹葉酵素總酚、黃酮、原花青素含量的變化規(guī)律,同時對模擬胃腸消化前后茶葉酵素中的5種兒茶素類物質(zhì)含量變化進(jìn)行了研究,通過DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力和還原力考察茶樹葉酵素抗氧化能力的變化,以期正確評價茶樹葉酵素的營養(yǎng)價值和抗氧化活性。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        古茶樹葉酵素(古茶樹樹葉與發(fā)酵液和糖液按一定比例加入高壓蒸汽滅菌過的20 L不銹鋼發(fā)酵罐中,于20 ℃下發(fā)酵70 d制成) 由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 日本TCI公司;2,2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、磷酸(色譜純)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG) 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶、福林酚試劑、豬膽鹽 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純) 美國Thermo Fisher Scientific公司。

        PHS-3C精密酸度計(jì) 杭州齊威儀器有限公司;XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 常州諾基儀器有限公司;TS-110X50水浴搖床 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;Waters e2695高效液相色譜(配Waters 2998二極管陣列檢測器和SunFire C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)色譜柱) 美國Waters公司;SpectraMax iD5多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 體外模擬胃腸消化 參考文獻(xiàn)[12,14?15]的方法并改進(jìn)。

        酵素稀釋液的制備:取4 mL酵素樣品與16 mL 9 mg/mL NaCl溶液混合均勻,設(shè)立三個平行實(shí)驗(yàn)組。

        模擬胃液消化組:取20 mL上述稀釋液,HCl溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH至2.0±0.1,加入4 mL模擬胃液(0.2 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L的HCl溶液);胃酸對照組:20 mL稀釋液加入4 mL 0.01 mol/L 的HCl溶液,調(diào)節(jié)pH至2.0±0.1;空白對照組:20 mL稀釋液加入等體積生理鹽水代替胃液。于37 ℃,100 r/min水浴振蕩2 h,分別在消化的0.0、0.5、1.0、2.0 h取樣,并于4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min,取上清液,待測。

        模擬腸液消化:取模擬胃消化2 h的樣品,用1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0±0.1。模擬腸液消化組:加入4 mL模擬腸液(0.4 g胰蛋白酶、2.5 g豬膽鹽溶于100 mL 0.1 mol/L pH 7.0的NaHCO3-Na2CO3緩沖液,即0.4 mg/mL胰蛋白酶溶液和25 mg/mL膽汁提取物);腸空白對照組:加入等體積0.1 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液代替腸液。

        將上述各組于37 ℃,100 r/min水浴振蕩2 h。于消化的0.0、0.5、1.0、2.0 h取樣,并于4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min,取上清液,待測。

        1.2.2 總酚含量測定 采用福林酚法[16]測定總酚,取樣品各階段消化液1 mL,分別加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的福林酚溶液,避光常溫放置反應(yīng)3 min后加入75 g/L Na2CO3溶液4 mL,混勻。于25 ℃反應(yīng)1 h,以水為空白對照,在波長765 nm處測定吸光度值,以沒食子酸為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量(mg GAE/mL)表示。

        1.2.3 總黃酮含量測定 根據(jù)硝酸鋁比色法[17]測定總黃酮,取樣品各階段消化液5 μL,分別加入7.5 μL 5%的NaNO2,靜置6 min后加入7.5 μL 10%的Al(NO3)3靜置6 min,再加入50 μL 4%氫氧化鈉溶液,用水補(bǔ)至250 μL,靜置15 min,在波長510 nm處測定吸光度值,以蘆丁為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果以蘆丁當(dāng)量(mg RE/mL)表示。

        1.2.4 原花青素含量測定 采用香草醛-甲醇-鹽酸顯色法[18]測定原花青素,取樣品各階段消化液20 μL,分別加入120 μL 4%香草醛-甲醇溶液和60 μL濃HCl,于25 ℃避光孵育15 min,在波長500 nm處測定吸光度值,以兒茶素為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果以兒茶素當(dāng)量(mg CE/mL)表示。

        1.2.5 兒茶素類物質(zhì)含量測定

        1.2.5.1 HPLC條件 將樣品各階段消化液用0.22 μm濾膜過濾,待測。色譜柱:SunFire C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);流動相:乙腈(A)和0.2%磷酸溶液(B);梯度洗脫(0 min,5%A;0~15 min,5%~15%A;15~40 min,15%~25%A;40~45 min,25%~5%A);流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;檢測波長:280 nm[19]。

        1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 稱取C 5 mg、EC 5 mg、EGC 10 mg、EGCG 10 mg、ECG 10 mg分別于5 mL容量瓶中,用穩(wěn)定溶液(移取25 mL 10 mg/mL EDTA-2Na、25 mL 10 mg/mL抗壞血酸和50 mL乙腈,并用超純水定容至500 mL)定容至5 mL。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取1.2.5.2節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)溶液過0.22 μm的濾膜,按1.2.5.1節(jié)中色譜條件進(jìn)行分析。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量。

        1.2.6 抗氧化能力測定

        1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 取5 μL樣品,加水至50 μL,加入到100 μL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液中,再加入11.3 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH7.4),25 ℃下恒溫反應(yīng)30 min。以去離子水為對照,在517 nm下測定吸光度。按式(1)計(jì)算樣品的DPPH自由基清除能力[20]。

        式中:A0為空白對照液的吸光度;A1為樣品測定管的吸光度;A2為樣品本底管的吸光度。

        1.2.6.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定 用7 mmol/L ABTS(用5 mmol/L PBS,pH7.4配制),加入過硫酸鉀最終濃度為2.45 mmol/L,在室溫下黑暗放置12~16 h。使用前把ABTS+溶液用PBS稀釋成在734 nm下吸光度為0.70±0.02。取8 μL樣品,用磷酸緩沖液(5 mmol/L,pH7.4)補(bǔ)至12 μL,再加入200 μL ABTS溶液,在30 ℃下,反應(yīng)1 h。以去離子水為對照,在734 nm下測定吸光度。按式(2)計(jì)算樣品的ABTS陽離子自由基清除能力[21]。

        式中:A0為空白對照液的吸光度;A1為樣品測定管的吸光度;A2為樣品本底管的吸光度。

        1.2.6.3 還原力測定 取3 μL樣品,用磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)至250 μL,然后加入250 μL 1%鐵氰化鉀(w/v),混合均勻,50 ℃,反應(yīng)30 min,再加入10%三氯乙酸(w/v)250 μL,混合均勻,靜止10 min,立即取100 μL上清液,加入100 μL去離子水和20 μL 0.1%三氯化鐵(w/v),混合均勻,以去離子水為對照,在700 nm下測定[22]。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        以上實(shí)驗(yàn)均平行3次,得到數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),平均值的差異性采用單因素分析(one-way analysis of variance,ANOVA)中的最小顯著差異法(least significant difference,LSD)檢驗(yàn),以P<0.05為差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 體外模擬消化過程中活性成分含量的變化

        2.1.1 體外模擬消化過程中總酚含量的變化 如圖1所示,胃液消化組的總酚含量在0.5~1 h顯著上升(P<0.05),1 h后顯著下降(P<0.05);胃酸對照組和胃空白對照組的總酚含量在消化0.5~1 h內(nèi)有所下降后趨于穩(wěn)定,且胃酸對照組的總酚含量顯著高于胃空白對照組(P<0.05)。在模擬胃液消化過程中,消化0~2.0 h內(nèi),總酚含量依次為胃液消化組>胃酸對照組>胃空白對照組,這說明模擬胃消化過程中的胃蛋白酶和胃酸均有利于古茶樹葉酵素中多酚釋放量的增加,其中胃蛋白酶起主要作用,這可能是某些與蛋白質(zhì)以氫鍵等非共價結(jié)合的多酚物質(zhì),在蛋白質(zhì)被胃蛋白酶水解后釋放[13];而胃液消化組1 h后總酚含量的降低可能是由多酚類物質(zhì)降解量大于釋放量引起的。

        在模擬腸消化過程中,與模擬腸消化0 h比較,總酚含量在0.5 h內(nèi)顯著下降(P<0.05),而腸消化1 h后又顯著上升(P<0.05)。腸消化前期多酚含量顯著下降的原因可能是部分酸性酚類化合物在中性環(huán)境下發(fā)生降解降解生成其他物質(zhì)[12];后期顯著上升則可能是由于與多糖以酯鍵形式結(jié)合形成糖苷的多酚分子在酶的作用下水解釋放,導(dǎo)致整體酚羥基含量有所上升所致[23?24]。

        2.1.2 體外模擬消化過程中總黃酮含量的變化 如圖2所示,胃液消化組和胃酸對照組的黃酮含量在0.5 h內(nèi)顯著提高(P<0.05),0.5~1 h內(nèi)胃酸對照組趨于穩(wěn)定,胃液消化組仍顯著升高(P<0.05),而空白對照組的總黃酮含量在胃消化過程中的無顯著變化。在模擬胃液消化2 h過程中,黃酮含量的最大值(6.258±0.122 mg RE/mL)為胃消化0 h(4.745±0.018 mg RE/mL)的1.32倍。胃酸對照組的黃酮含量最大值(5.458±0.138 mg RE/mL)為胃消化0 h的1.15倍。在胃消化階段,黃酮含量依次為模擬胃液消化組>胃酸對照組>胃空白對照組,這表明胃蛋白酶和胃酸能夠?qū)S酮的釋放共同起促進(jìn)作用。在模擬胃消化階段,黃酮和總酚含量變化規(guī)律較為相似,胃液消化均可促進(jìn)兩者含量增加直至穩(wěn)定;而與總酚含量變化規(guī)律不同的是,胃酸對照組的黃酮含量同樣顯著提高(P<0.05),說明較低pH可以促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的釋放[9,14?15]。

        圖 1 古茶樹葉酵素模擬消化過程中總酚含量的變化Fig.1 Changes of polyphenols in fermented tea Jiaosu during simulated gastric and intestinal digestion

        圖 2 古茶樹葉酵素模擬消化過程中總黃酮含量的變化Fig.2 Changes of flavonoids in fermented tea Jiaosu during simulated gastric and intestinal digestion

        在模擬腸消化過程中,腸液消化組與腸空白對照組的總黃酮含量均呈現(xiàn)先上升后下降又上升的趨勢,且兩組之間無顯著性差異,說明胰酶對黃酮釋放量影響較小。腸液消化1 h內(nèi),黃酮含量有所降低可能是因?yàn)閮翰杷亍⒈韮翰杷氐赛S烷-3-醇類物質(zhì)在環(huán)境變化的情況下不穩(wěn)定所致[25],后期黃酮含量出現(xiàn)上升趨勢可能是酶水解蛋白質(zhì),將一些與蛋白質(zhì)復(fù)合的黃酮類化合物水解出來。

        2.1.3 體外模擬消化過程中原花青素含量的變化如圖3所示,胃液消化組的原花青素含量在0.5~2 h顯著上升(P<0.05);胃酸對照組和胃空白對照組的原花青素含量在消化過程中均無顯著差異,這表明胃蛋白酶可以促進(jìn)原花青素的釋放。

        圖 3 古茶樹葉酵素模擬消化過程中原花青素含量的變化Fig.3 Changes of proanthocyanidins in fermented tea Jiaosu during simulated gastric and intestinal digestion

        在模擬腸消化過程中,與模擬腸消化0 h相比,模擬腸液組的原花青素含量在1 h時顯著下降(P<0.05);而空白對照組在腸消化過程中原花青素含量無顯著差異,說明胰蛋白酶和膽汁對原花青素含量有顯著影響,可能是在腸環(huán)境下原花青素單體降解引起的[25]。劉靜敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)紫娟等四種茶葉在模擬腸消化階段中原花青素含量均顯著下降,與本文結(jié)論一致。本文的古茶樹葉酵素經(jīng)模擬腸消化2 h后,原花青素含量與空白對照組相比未發(fā)生顯著的變化。

        2.1.4 體外模擬消化過程中兒茶素類物質(zhì)含量的變化 為進(jìn)一步探究和明確在胃腸環(huán)境下兒茶素類物質(zhì)具體變化,本研究選取了兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯等5種兒茶素單體作為代表,研究其在胃腸消化過程中的變化情況。圖4為混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖。

        圖 4 混合標(biāo)品的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatagrams of mixed standards

        如表1所示,5種兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,R2值均在0.9978以上。

        如表2所示,模擬胃消化對C、EGC和ECG無顯著影響(P>0.05),但胃液消化0 h與2 h相比,EC含量顯著上升(P<0.05)。兒茶素在體外模擬胃消化過程中的降解不顯著,說明胃液中的強(qiáng)酸環(huán)境和胃蛋白酶對兒茶素類物質(zhì)影響較小,這可能是因?yàn)閮翰杷仡愇镔|(zhì)在酸性條件下較為穩(wěn)定[26]。

        表 1 兒茶素類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 1 Linear regresslon equations for five catechins standards

        表 2 古茶樹茶葉酵素模擬胃消化過程中兒茶素類物質(zhì)含量的變化Table 2 Changes of catechins in fermented tea Jiaosu during simulated gastric digestion

        表 3 古茶樹茶葉酵素模擬腸消化過程中兒茶素類物質(zhì)含量的變化Table 3 Changes of catechins in fermented tea Jiaosu during simulated intestinal digestion

        如表3所示,模擬腸消化2 h后,EGC、C、EC、ECG含 量 從21.83±1.88、18.25±0.09、83.67±7.50、16.76±0.42 μg/mL降 低 至10.51±2.18、6.24±0.46、14.20±1.33、3.92±1.33 μg/mL,均顯著下降(P<0.05),分別下降了64.40%、74.58%、86.95%、48.21%;腸空白對照組的EGC、C、EC、ECG含量同樣顯著降低(P<0.05),分別下降了51.86%、65.81%、83.03%、76.61%。結(jié)果表明,兒茶素類物質(zhì)的降解大多發(fā)生在腸消化階段,其在模擬腸液中的不穩(wěn)定性主要是酸堿環(huán)境變化引起的,與消化酶作用無關(guān)。Tenore等[27]研究表明,兒茶素經(jīng)過胃、腸消化含量有所降低,這是由于兒茶素對胃腸道的pH敏感引起的,添加消化酶并不能顯著影響兒茶素含量。小腸環(huán)境中pH、殘留溶解氧和來自正常消化功能的活性氧都可能促進(jìn)腸道內(nèi)兒茶素的環(huán)聚和自氧化等反應(yīng),如EGC的B環(huán)上相鄰的3’,4’和5’羥基具有不穩(wěn)定性,易導(dǎo)致B環(huán)去質(zhì)子化以及半醌自由基的形成,而中性條件附近會進(jìn)一步使得穩(wěn)定的兒茶素半醌中間體發(fā)生自氧化反應(yīng),生成二聚體等最終產(chǎn)物。此外,B環(huán)結(jié)構(gòu)的差異也決定了不同兒茶素類物質(zhì)的穩(wěn)定性[28?29]。

        2.2 體外模擬消化過程中抗氧化活性的變化

        2.2.1 體外模擬消化過程中DPPH自由基清除率的變化 如圖5所示,胃液消化組在消化過程中DPPH自由基清除率與0 h相比無顯著變化(P>0.05);胃酸對照組在消化0.5~1 h內(nèi)顯著下降(P<0.05)后上升至與0 h無顯著差異(P>0.05);空白對照組在消化0.5 h內(nèi)顯著下降(P<0.05)后緩慢上升至與0 h無顯著差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明,胃消化對DPPH自由基清除能力無顯著影響。

        腸消化組中DPPH自由基清除率的變化趨勢表現(xiàn)為先下降再上升,但腸液消化組和腸空白對照組之間無顯著差異(P>0.05),這說明胰酶對DPPH自由基清除能力無顯著影響。模擬腸道環(huán)境中,古茶樹葉酵素的DPPH自由基清除能力隨著總酚含量的下降而降低。

        2.2.2 體外模擬消化過程中ABTS陽離子自由基清除率的變化 如圖6所示,與模擬胃消化0 h相比,胃液消化組在消化過程中1 h內(nèi)顯著上升(P<0.05),1 h后顯著下降(P<0.05),但清除率仍然高于模擬胃消化0 h;胃酸消化組在消化過程中1 h內(nèi)顯著上升(P<0.05),1 h后顯著下降(P<0.05)至與模擬胃消化0 h相同;空白對照組整體呈現(xiàn)上升趨勢,這表明胃蛋白酶和胃酸均會引起ABTS陽離子自由基清除率的變化。

        圖 5 古茶樹葉酵素模擬消化過程中DPPH自由基清除率的變化Fig.5 Changes of DPPH radical scavenging capacity in fermented tea Jiaosu during simulated intestinal digestion

        圖 6 古茶樹葉酵素模擬消化過程中ABTS陽離子自由基清除率的變化Fig.6 Changes of ABTS cation radical scavenging capacity in fermented tea Jiaosu during simulated intestinal digestion

        圖 7 古茶樹葉酵素模擬消化過程中還原力的變化Fig.7 Changes of reducing force in fermented tea Jiaosu during simulated intestinal digestion

        模擬腸消化過程,與模擬腸消化0 h相比,腸液消化組在0.5 h內(nèi)顯著上升(P<0.05)后趨于穩(wěn)定;空白對照組在0.5~1 h內(nèi)顯著下降(P<0.05)后趨于穩(wěn)定,這表明胰蛋白酶和膽汁可以促進(jìn)ABTS陽離子自由基清除能力的增強(qiáng)。

        2.2.3 體外模擬消化過程中還原力的變化 如圖7所示,與模擬胃消化0 h相比,胃液消化組在消化過程中還原力無顯著變化(P>0.05);胃酸對照組還原力在1 h內(nèi)有所下降,消化2 h又回升至與模擬胃消化0 h無顯著差異(P>0.05);胃空白對照組在1 h內(nèi)顯著(P<0.05)下降后有所回升,還原力依次為模擬胃液消化組>胃酸對照組>胃空白對照組,這表明胃蛋白酶和胃酸是引起還原力的變化的主要原因。

        模擬腸消化階段,腸液消化組和空白對照組均在1 h內(nèi)顯著下降(P<0.05)后回升至與模擬腸消化0 h無顯著差異(P>0.05)。此外,腸液消化組的還原力略高于腸空白對照組,這表明胰蛋白酶和膽汁可以在一定程度上增強(qiáng)還原力。

        結(jié)合圖1和圖2可知,在胃、腸消化階段古茶樹茶葉酵素的DPPH自由基清除能力和還原力與總酚、黃酮含量的變化規(guī)律相似,進(jìn)一步表明多酚類化合物是其抗氧化能力的基礎(chǔ)。在胃腸消化過程中,抗氧化活性物質(zhì)會因?yàn)閜H、消化酶等環(huán)境因素發(fā)生解離、轉(zhuǎn)化、降解等[23]。隨著消化過程的進(jìn)行,酚類等抗氧化活性物質(zhì)可能降解為其他小分子酚類物質(zhì),使酚羥基數(shù)目在單位體積中有所增加[30]。酚羥基具有供氫體活性,在氧化過程中,酚羥基作為主要的還原部位可以與氧化過程中生成的多種自由基反應(yīng),分子內(nèi)氫鍵等形式可以使其自身形成的自由基得以穩(wěn)定,從而阻斷自由基鏈的反應(yīng)[11,30?31],這可能是引起體外抗氧化能力增強(qiáng)的原因之一。此外,抗氧化活性綜合了體系中所有抗氧化物質(zhì)協(xié)同或拮抗的作用,抗氧化活性的變化可能是由于胃腸環(huán)境的變化影響了抗氧化物質(zhì)的相互作用引起的[32]。

        3 結(jié)論

        本文通過體外模擬胃、腸消化法,評價了古茶樹葉酵素在模擬胃腸消化過程中進(jìn)一步探究了主要酚類物質(zhì)的釋放規(guī)律和體外抗氧化活性的變化。結(jié)果表明:不同酚類化合物在模擬胃腸消化過程中穩(wěn)定性不同。體外模擬胃消化能夠促進(jìn)總酚、黃酮和原花青素的釋放;體外模擬腸消化后,總酚含量、黃酮含量和原花青素含量總體水平有所下降,這與C、EGC、ECG、EC含量在模擬腸液消化后顯著降低(P<0.05)一致;古茶樹葉酵素經(jīng)過體外模擬胃腸消化后,其DPPH自由基清除能力無顯著變化,ABTS自由基清除能力、還原力有所增強(qiáng)。體外消化過程中酚類物質(zhì)變化原因有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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