趙西連，莊 莉，肖軍霞,2，李曉丹,2，郭麗萍,2,

（1.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東青島 266109；2.青島特種食品研究院，山東青島 266109）

西蘭花為十字花科蕓苔屬，其芽苗菜富含抗壞血酸、花色苷、可溶性糖、可溶性蛋白、蘿卜硫素、硫代葡萄糖苷等活性成分，具有極高的營養(yǎng)價值和保健作用。研究表明，西蘭花芽苗菜具有降低血糖、抗癌、抗氧化、消炎、降低心血管疾病、調節(jié)機體免疫力等功能，受到國內外廣泛關注，被認定為標準綠色產(chǎn)品[1?3]，這主要是其中的蘿卜硫素所起的作用。蘿卜硫素在西蘭花芽苗菜中以其前體物質蘿卜硫苷的形式存在，細胞破碎后在黑芥子酶的作用下形成；因此，蘿卜硫苷的含量對于蘿卜硫素的形成至關重要。西蘭花芽苗菜既可以作為蔬菜食用，也可以作為功能性食品的原料，雖然在我國應用還很少，但已引起研究者的重視。

光質和光周期是影響植物生長發(fā)育的基本因素之一，對植物的物質代謝、光合作用以及基因表達均有調控作用。通過應用節(jié)能環(huán)保的新型光源——發(fā)光二極管（light emitting diode，LED）調節(jié)光環(huán)境來提高芽苗菜產(chǎn)量及品質已成為研究熱點[4]。劉文科等[5]以豌豆芽為試材，比較白光、藍光、紅光和紅藍光對豌豆苗營養(yǎng)成分的影響，發(fā)現(xiàn)白光處理下豌豆莖中花色苷積累最多，分別是紅光、藍光和紅藍光處理的1.42、3.35和1.81倍。Pérez-Balibrea等[6]研究表明，光照較黑暗下生長的西蘭花芽苗菜總硫苷、總酚和抗壞血酸含量較黑暗分別高33%、61%和83%。張歡等[7]發(fā)現(xiàn)紅光比白光、黃光、藍光和紅藍光等更有利于蘿卜芽苗菜的生長和營養(yǎng)品質的改善。鄔奇等[8]研究了光周期對黃瓜和番茄幼苗生長的影響，發(fā)現(xiàn)隨著光周期的延長，可溶性糖和可溶性蛋白含量逐漸增高，光周期16 h·d?1更利于促進黃瓜和番茄幼苗生長。但以上研究主要集中于不同光質對芽苗菜營養(yǎng)品質的影響，對于光周期調控芽苗菜品質研究較少，尤其對于西蘭花芽苗菜的相關研究還未見報道。此外，LED紅光處理下蘿卜愈傷組織增殖倍數(shù)，蘿卜硫素產(chǎn)量最高[9]；而紅光和藍光對西蘭花愈傷組織中蘿卜硫素的積累效果強于白光[10]，表明光質能夠調控蘿卜硫素的積累。目前，西蘭花芽苗菜的研究主要集中于外源物質（如鈣、ATP、糖、激素等）和環(huán)境（熱激、低氧等）對其品質和蘿卜硫素富集的影響[3,11?14]。關于白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜生理生化和蘿卜硫苷的代謝還未見報道。

因此，本文以黑暗為對照，研究白光和紅光光周期為4、8、12、16、20 h處理下4和7 d的西蘭花芽苗菜的可溶性糖、可溶性蛋白、花色苷、抗壞血酸、硫代葡萄糖苷、黑芥子酶和蘿卜硫素的含量變化，為LED光在西蘭花芽苗菜工業(yè)化生產(chǎn)方面提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

西蘭花種子 濰坊市壽禾種業(yè)公司；乙腈和甲醇 色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；DEAE Sephadex TMA25離子交換樹脂、咪唑 北京索萊寶科技有限公司；二氯甲烷、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍、草酸 國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；烯丙基硫苷標準品、硫酸酯酶 美國Sigma 公司。

光照培養(yǎng)箱 上海高致精密儀器有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國賽默飛公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 西蘭花種子發(fā)芽方法 將西蘭花種子用次氯酸鈉消毒后沖洗至中性后，在30 ℃水浴鍋中浸泡4 h。將浸泡后的種子均勻地平鋪在裝滿蛭石的培養(yǎng)盤中，于25 ℃下黑暗催芽1 d后分別置于黑暗/光照（每天光照時間分別為4、8、12、16和20 h）的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，植株距離光源約50 cm，光照強度為50 μmol·m?2·s?1，每天噴灑去離子水兩次，分別于4和7 d取樣測定。

1.2.2 芽苗菜含水量的測定 從每個光周期的西蘭花芽苗菜中隨機摘取20棵芽苗菜為一個樣本，稱量鮮重后放在55 ℃烘箱中干燥至恒重，稱量干重，計算芽苗含水量。

1.2.3 可溶性蛋白含量的測定 選用王學奎[15]的方法，稱取0.2 g芽苗加入1 mL蒸餾水研磨成勻漿后，再加入4 mL蒸餾水沖洗研缽，全部轉移至10 mL離心管內，10000 r/min離心5 min。取1 mL上清液后再加入5 mL G-250考馬斯亮藍溶液，室溫下反應5 min，在595 nm波長下測吸光值。含量表示為mg/g 鮮重（FW）。

1.2.4 可溶性糖含量的測定 稱取芽苗菜0.5 g加入1 mL蒸餾水研磨后倒入試管中，再加入14 mL蒸餾水持續(xù)煮沸20 min。冷卻后進行過濾，取1 mL濾液加入6 mL蒸餾水稀釋混勻。取1 mL提取液加入5 mL蒽酮溶液，沸水浴反應10 min，在620 nm波長處測吸光值。

1.2.5 花色苷含量的測定 參照于海鑫等[16]的方法測定。稱取0.2 g芽苗，用4 mL酸化乙醇研磨提取，10000×g離心5 min后收集上清液，于535 nm處測定吸光值?；ㄉ蘸堪凑障率接嬎?。

花色苷含量（mg/100 g FW）=（A535×V）/（98.2×W）×100

式中：A535：535 nm處吸光值；V：定容體積，mL；98.2：花色苷在535 nm處的平均消光系數(shù)；W：樣品質量，g。

1.2.6 維生素C含量的測定 根據(jù)王志英等[17]的方法測定。取0.3 g芽苗，用5 mL 2%的草酸研磨提取，勻漿于8000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm膜后進行HPLC測定。HPLC條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18柱，檢測波長為254 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。流動相：0.1%草酸：甲醇=95%：5%。

1.2.7 硫代葡萄糖苷含量的測定 參照Guo等[18]的方法測定。取500 mg西蘭花芽苗，加入4 mL煮沸的75%甲醇于80 ℃下浸提15 min，于10000×g離心5 min，殘渣繼續(xù)浸提2次，上清液過DEAE Sephadex A-25柱；然后加入硫酸酯酶溶液于35 ℃下反應16 h后，用3 mL蒸餾水洗脫得到脫硫硫代葡萄糖苷，過0.45 μm膜后進行HPLC分析。

HPLC分析條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18柱，流動相為超純水和20%乙腈，先用水洗脫1 min；1~21 min，0~100%乙腈；21~26 min，100%~0乙腈；檢測波長為226 nm，流速為1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，以烯丙基硫苷作為內標。

1.2.8 黑芥子酶活性的測定 參照王志英等[17]的方法測定。取0.5 g西蘭花芽苗，用3 mL 0.1 mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液冰浴研磨，4 ℃下10000×g離心15 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液0.5 mL與0.5 mL 1 mmol/L的烯丙基硫苷混合，于37 ℃水浴反應10 min后沸水滅酶5 min，用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖含量。以每分鐘被黑芥子酶轉化生成1 nmol葡萄糖為一個酶活力單位，酶活力單位為U/mg FW。

1.2.9 蘿卜硫素含量的測定 根據(jù)郭麗萍等[19]的方法。取0.5 g新鮮的西蘭花芽苗菜，加4 mL蒸餾水研磨，水解3 h后加入4 mL二氯甲烷萃取，蒸干二氯甲烷相用2 mL體積分數(shù)10%乙腈溶解，進行HPLC分析。檢測波長254 nm，紫外檢測器，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃。洗脫程序：0~20 min，10%~60%乙腈；20~25 min，60%~100%乙腈。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗設3次重復，結果采用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，Duncan’s新復極差法在0.05水平上進行顯著性檢驗。采用Origin 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜生理生化的影響

2.1.1 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜芽長和含水量的影響 由圖1A可以看出，與白光處理相比，紅光處理促進西蘭花芽苗菜芽長增長。光周期12 h·d?1時，4和7 d紅光處理組西蘭花芽苗菜芽長是白光的1.37和1.21倍。與黑暗相比，光照對西蘭花芽苗菜生長有抑制作用。在光周期20 h·d?1時，4 d西蘭花芽苗菜在白光和紅光處理下芽長分別較黑暗降低32.7%和23.0%。張歡等[7]研究發(fā)現(xiàn)，隨光周期從0延長至12 h·d?1油葵芽苗菜在紅光處理下下胚軸長顯著降低，與本研究結果一致。這現(xiàn)象可能主要是因為植物細胞感受到紅光后，導致了植物體內光敏色素紅光（Pr）構型和遠紅光（Pfr）構型的相互轉化，從而影響植株細胞內的內源激素，加速了莖的細胞分裂和莖根伸長[20]。圖1B結果表明，4 d時西蘭花芽苗菜含水量隨著光周期的延長先升高后降低后再升高，相較于紅光，白光顯著降低了西蘭花芽苗菜的含水量（P<0.05）。光周期對7 d西蘭花芽苗菜含水量影響不顯著（P>0.05）。

圖 1 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜芽長（A）和含水量（B）的影響Fig.1 Effect of white and red light photoperiod on sprout length （A） and water content （B） in broccoli sprouts

2.1.2 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響 由圖2A可以看出，4 d西蘭花芽苗菜中可溶性糖含量顯著高于7 d（P<0.05），紅光處理下西蘭花芽苗菜中可溶性糖含量顯著高于白光處理組（P<0.05），在光周期為16 h·d?1時含量最高，紅光處理下4和7 d芽苗菜可溶性糖含量分別是白光的1.46和1.62倍；白光對7 d芽苗菜的可溶性糖含量無顯著影響（P>0.05）。姜宗慶[21]研究發(fā)現(xiàn)，與白光和藍光相比，紅光更有利于提高香椿芽苗菜可溶性糖含量，本研究也發(fā)現(xiàn)紅光處理相較白光處理下西蘭花芽苗菜可溶性糖含量更高。由圖2B知，紅光和白光處理下可溶性蛋白含量變化趨勢基本一致，均在光周期為16 h·d?1達到最高。光周期 為16 h·d?1時，紅光和白光處理下4 d芽苗菜的可溶性蛋白含量分別是黑暗的1.69倍和1.55倍。7 d西蘭花芽苗菜可溶性蛋白含量比4 d顯著降低（P<0.05）。這是由于芽苗菜生長過程中可溶性蛋白和可溶性糖作為主要營養(yǎng)補充物質供給生長而被大量消耗，因此造成含量下降[22]。

圖 2 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜可溶性糖（A）和可溶性蛋白（B）含量的影響Fig.2 Effects of white and red light photoperiod on soluble sugar （A） and soluble protein contents （B） in broccoli sprouts

2.1.3 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜花色苷的影響 白光和紅光不同光周期下西蘭花芽苗菜花色苷含量變化如圖3所示。隨著光周期的延長，紅光處理下花色苷含量先增加后趨于穩(wěn)定，白光處理下花色苷含量不斷增加，白光處理下20 h·d?1時最高，4和7 d白光處理下西蘭花芽苗菜花色苷含量分別是黑暗的9.74倍和6.34倍。當光周期大于4 h·d?1后，白光處理下西蘭花芽苗菜花色苷含量顯著高于紅光（P<0.05），這與在蕎麥芽苗菜和豌豆苗的研究結果一致[5,23]。研究表明，光照通過上調花色苷合成途徑中相關基因表達實現(xiàn)了甘藍芽苗菜中花色苷的積累[24]，因此白光和紅光提高西蘭花芽苗菜中花色苷含量與花色苷合成途徑中相關基因表達和酶活力有關。但是關于不同光質和光周期對花色苷富集的結果不同，其具體機制有待于進一步探究。

圖 3 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜花色苷含量的影響Fig.3 Effects of white and red light photoperiod on anthocyanin contents in broccoli sprouts

2.1.4 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜抗壞血酸含量的影響 研究表明，光照較暗處理顯著提高了西蘭花芽苗菜中抗壞血酸含量[6]。本研究也得到了相似的結果，但白光和紅光處理對西蘭花芽苗菜中抗壞血酸含量的影響效果不同（圖4）。紅光不同光周期處理下，西蘭花芽苗菜中抗壞血酸含量先增加后穩(wěn)定，而白光處理下西蘭花芽苗菜中抗壞血酸含量先增加后降低。張歡等[7]紅光處理較黑暗也顯著提高了油葵芽苗菜中抗壞血酸的含量，隨著光周期的延長，抗壞血酸含量先增加后趨于穩(wěn)定，與本研究結果一致。本研究中紅光處理下抗壞血酸含量顯著高于白光處理，劉素慧等[25]在香椿苗中研究結果一致。光周期16 h·d?1下，紅光4和7 d西蘭花芽苗菜抗壞血酸含量分別較黑暗提高了81.9%和78.5%；白光照射下，7 d西蘭花芽苗菜抗壞血酸含量在光周期20 h·d?1最高，4 d在光周期16 h·d?1達到最高，4 d在光周期16 h·d?1比7 d光周期20 h含量高19.7%（圖4）。紅光處理下7 d西蘭花芽苗菜抗壞血酸含量高于4 d，而白光處理下除光周期20 h·d?1外，4 d芽苗菜的抗壞血酸含量高于7 d。L-半乳糖酸-1，4-內酯脫氫酶是抗壞血酸合成過程中的關鍵酶[26]，本研究中白光和紅光對西蘭花芽苗菜中抗壞血酸含量影響的不同可能與該酶對不同光的敏感性不同，因而導致基因表達和酶活力的差異。

圖 4 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜抗壞血酸含量的影響Fig.4 Effects of white and red photoperiod on ascorbic acid contents of broccoli sprouts

2.2 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜蘿卜硫苷代謝的影響

2.2.1 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜硫代葡萄糖苷的影響 硫代葡萄糖苷是一類含硫、氮的親水性陰離子植物次生代謝產(chǎn)物，是十字花科特有的成分。當細胞破碎時，硫代葡萄糖苷接觸到黑芥子酶，生成異硫氰酸酯、硫氰酸酯和腈類等物質，其中異硫氰酸酯由于顯著的抗癌功效受到廣泛關注[27?28]。蘿卜硫苷屬于脂肪族硫苷，是西蘭花芽苗菜中含量最高的硫代葡萄糖苷。如圖5所示，白光和紅光處理下，總硫代葡萄糖苷含量變化趨勢和蘿卜硫苷、脂肪族硫苷變化趨勢基本一致。Moreira-Rodríguez等[29]研究發(fā)現(xiàn)，UV-B照射可以顯著增加西蘭花芽苗菜硫代葡萄糖苷的含量，本研究發(fā)現(xiàn)白光和紅光處理也顯著提高了西蘭花芽苗菜中蘿卜硫苷、脂肪族硫苷和總硫苷含量。紅光處理后西蘭花芽苗菜蘿卜硫苷含量明顯高于白光，光周期12 h·d?1時，紅光處理下4和7 d蘿卜硫苷含量分別是白光的1.18倍和1.14倍。紅光處理下4和7 d芽苗菜中蘿卜硫苷含量均在光周期16 h·d?1時最高，分別是黑暗的1.88倍和2.30倍。芽苗菜生長過程中伴隨著蘿卜硫苷的分解[28]，因此7 d比4 d芽苗菜中蘿卜硫苷含量減少。

圖 5 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜蘿卜硫苷（A）、脂肪族硫苷（B）和總硫苷含量（C）的影響Fig.5 Effects of white and red photoperiod light on sulforaphane (A), aliphatic sulforaphane (B) and total sulforaphane content (C) contents in broccoli sprouts

2.2.2 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜黑芥子酶活力的影響 除蘿卜硫苷含量外，黑芥子酶活力對于異硫氰酸酯的形成也非常重要。圖6表明，4 d西蘭花芽苗菜黑芥子酶活力明顯高于7 d，4 d紅光和白光處理均在光周期16 h·d?1時含量最高，分別是7 d的1.63倍和2.36倍。紅光比白光處理下西蘭花芽苗菜中黑芥子酶含量更高。Guo等[30]研究表明，在發(fā)芽后3~7 d時西蘭花芽苗的黑芥子酶活力逐漸增強，而本研究中4 d芽苗菜的黑芥子酶活力高于7 d，原因可能是酶活表示的方法不同，本文用的是每克樣品的活性，Guo等[30]用的是比活力。

圖 6 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜黑芥子酶活力的影響Fig.6 Effects of white and red photoperiod light on myrosinase activity in broccoli sprouts

2.2.3 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜蘿卜硫素形成的影響 蘿卜硫素是蘿卜硫苷在黑芥子酶的水解作用下形成的產(chǎn)物之一，是目前已發(fā)現(xiàn)的抗癌活性最強的天然活性物質，因此引起廣泛關注[31]。蘿卜硫素是西蘭花異硫氰酸酯的一種，在種子及芽苗菜中占總揮發(fā)性物質的66.605%和64.399%[19]。如圖7所示，在不同光周期處理下蘿卜硫素的變化趨勢與其底物蘿卜硫苷的變化基本一致，都是先增加后降低。白光和紅光處理下，蘿卜硫素含量均在光周期16 h·d?1達到最高，分別比黑暗提高53%和61%；在光周期小于12 h·d?1時，紅光處理下蘿卜硫素形成量顯著高于白光處理（P<0.05），而當光周期大于12 h·d?1時，紅光處理下蘿卜硫素形成與白光處理之間差異不顯著甚至低于白光處理，這與不同光質和光周期處理下黑芥子酶活力變化有關。

圖 7 白光和紅光光周期對西蘭花芽苗菜蘿卜硫素含量的影響Fig.7 Effects of white and red photoperiod on sulforaphane contents in broccoli sprouts

3 結論

與黑暗相比，白光和紅光處理能夠明顯提高西蘭花芽苗菜的品質。與白光相比，紅光處理明顯促進西蘭花芽苗菜的生長并提高可溶性糖、可溶性蛋白、抗壞血酸和蘿卜硫苷含量，但花色苷含量相反。在光周期小于12 h時，紅光處理下蘿卜硫素形成量顯著高于白光處理（P<0.05），而當光周期大于12 h·d?1時，紅光處理下蘿卜硫素形成與白光處理之間差異不顯著甚至低于白光處理。綜合考慮，紅光光周期12 h·d?1更加有利于西蘭花芽苗菜品質的提高，也更符合經(jīng)濟效益。本研究為LED光在西蘭花芽苗菜的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術支撐和理論基礎；今后，將深入研究紅光調控蘿卜硫苷代謝的機制，為我國功能性芽苗菜類食品的產(chǎn)業(yè)化進一步提供科學依據(jù)。