任 娟，方振宇，金花子

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

越來(lái)越多的證據(jù)顯示[1]，大腦中雌激素水平不僅與生殖相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)有關(guān)，而且可以調(diào)節(jié)大腦的功能，如記憶，認(rèn)知等。雌激素(主要 E2 )是一種甾體激素，主要在卵巢和胎盤(pán)中分泌[2]。它可以促進(jìn)卵泡發(fā)育，同時(shí)對(duì)下丘腦—垂體也有負(fù)反饋?zhàn)饔肹3]。卵巢切除后雌激素的下降，導(dǎo)致FSH及LH因失去E2負(fù)反饋影響而逐漸升高。大量文獻(xiàn)表明，雌激素可影響腦內(nèi)神經(jīng)元的發(fā)育和存活[4]。國(guó)內(nèi)外研究[5-6]已證實(shí)，雌激素分泌下降是導(dǎo)致認(rèn)知功能下降以及癡呆的重要危險(xiǎn)因素。大腦是體內(nèi)雌激素作用的重要的靶器官之一[7]，該試驗(yàn)主要探究切除卵巢和子宮對(duì)小鼠記憶認(rèn)知能力以及體內(nèi)相關(guān)激素水平的影響，通過(guò)小鼠模型來(lái)探究去卵巢和子宮卵巢對(duì)女性記憶力的影響。眾所周知，絕經(jīng)給中老年女性的生活質(zhì)量和健康帶來(lái)嚴(yán)重影響，如記憶力減退[8]等。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者專家研究發(fā)現(xiàn)，用激素治療(HRT)[9]來(lái)緩解更年期癥狀的人群癡呆的發(fā)病率在逐漸降低，這也引發(fā)了對(duì)雌激素的廣泛研究[10-12]，流行病學(xué)研究表明，絕經(jīng)后雌性雌激素的缺失會(huì)增加以認(rèn)知功能下降為主要表現(xiàn)的疾病發(fā)生，如AD[13]。Gibbs等[14]通過(guò)雌激素剝奪來(lái)模擬雌性個(gè)體絕經(jīng)狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去卵巢(OVX)大鼠給予雌激素替代治療后其空間工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)及參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)均改善，結(jié)果顯著。Wilson等[15]研究認(rèn)為，短期的雌激素剝奪對(duì)雌性個(gè)體空間學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有影響，而超過(guò)4～5 w的雌激素剝奪可使大鼠認(rèn)知功能顯著減弱[16]，故接下來(lái)將對(duì)卵巢切除和子宮卵巢切除42 d(6 w)后的小鼠空間記憶力功能進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析探討[17-19]，觀察此時(shí)小鼠體內(nèi)激素變化及空間記憶能力是否受到顯著影響。

1 材料與方法

1.1 時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年2—4月于天津市南開(kāi)醫(yī)院動(dòng)物中心進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)小鼠及飼養(yǎng)管理

8周齡雌性SPF級(jí)昆明鼠18只，體重22～25 g,均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002，于南開(kāi)醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料飼籠飼，每籠3只，均自由攝食，飲水，室溫22～24 ℃，濕度45%～65%，光暗周期為(光照8：00～20：00;黑暗20：00～8：00)，將18只小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只：試驗(yàn)1組不做任何處理，試驗(yàn)2組進(jìn)行卵巢切除，試驗(yàn)3組進(jìn)行子宮和卵巢切除，正常飼養(yǎng)觀察42 d后進(jìn)行為期6 d的Morris水迷宮試驗(yàn)。每日定時(shí)觀察小鼠的健康狀況，減少疾病、營(yíng)養(yǎng)不良等對(duì)試驗(yàn)帶來(lái)的不良影響。該研究符合南開(kāi)醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 分組與模型的制備

1.3.1.1 分組

選取體況相近的18只8周齡昆明鼠，其中，6只為正常組,作為對(duì)照組，只切開(kāi)皮膚及肌肉,實(shí)施入路手術(shù),然后依次縫合肌肉,皮膚,不做進(jìn)一步處理(試驗(yàn)1組)；6只切除卵巢(試驗(yàn)2組)，6只同時(shí)切除子宮與卵巢(試驗(yàn)3組)。在小鼠模型制備完成后在正常飼養(yǎng)42 d后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試[20]。

1.3.1.2 小鼠模型的制備

1) 術(shù)前準(zhǔn)備：75%酒精，棉球，手術(shù)刀片，無(wú)齒鑷，眼科剪，持針器，縫合線4#，圓針，固定手術(shù)臺(tái)。

2) 0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠(0.1 mL/10 g)并于之后進(jìn)行固定，面罩給氣麻藥。

3) 用碘伏棉球擦拭小鼠背下部?jī)蓚?cè)皮膚以消毒。

4) 用手術(shù)刀在肋脊角處切開(kāi)皮膚及肌肉,暴露卵巢。自輸卵管處結(jié)扎卵巢動(dòng)靜脈,用眼科剪完整地切除小鼠自身的雙側(cè)卵巢，如圖1所示。子宮卵巢切除組至此將卵巢與子宮一同切除，對(duì)照組只切開(kāi)皮膚及肌肉,實(shí)施入路手術(shù),然后依次縫合肌肉,皮膚,不做進(jìn)一步處理。

5) 依次逐層縫合組織后進(jìn)行酒精擦拭消毒以及青霉素感染預(yù)防。

6) 解開(kāi)面罩，將小鼠置于28 ℃溫箱中待其蘇醒。

7) 術(shù)后一周內(nèi)密切觀察小鼠的狀態(tài)并于術(shù)后一周逐只進(jìn)行陰道涂片檢查，以確定卵巢切除完全，確保造模成功。

1.3.2 Morris水迷宮行為測(cè)試

Morris水迷宮是英國(guó)心理學(xué)家Morris于1981年設(shè)計(jì)并應(yīng)用于腦學(xué)習(xí)記憶機(jī)制研究的一種試驗(yàn)手段。水迷宮為高0.5 m，直徑1.2 m，深0.3 m的圓形不銹鋼水池，水池內(nèi)第一象限放入直徑9 cm的圓臺(tái)，置于水面下1 cm，池水中加入可食用性黑色素，與池內(nèi)顏色均為黑色，使動(dòng)物無(wú)法用視覺(jué)辨認(rèn)池內(nèi)站臺(tái)的位置，池內(nèi)水溫為21～25 ℃，采用遮光簾有效掩蓋進(jìn)入試驗(yàn)區(qū)域的雜散光。采用間接光源避免對(duì)圖像采集時(shí)的干擾。計(jì)算機(jī)攝像系統(tǒng)自動(dòng)監(jiān)測(cè)小鼠在水池中的游泳情況，并通過(guò)軟件分析獲取試驗(yàn)數(shù)據(jù)(圖2)。整個(gè)水迷宮測(cè)試連續(xù)6 d，主要的試驗(yàn)內(nèi)容包括階段1：定位航行試驗(yàn)(Hidden Platform Text)5 d，階段2：空間探索試驗(yàn)(Probe Trains)1 d。

1.3.2.1 定位航行試驗(yàn)

歷時(shí)5 d，每天定于固定時(shí)間段練習(xí)4次，順序?yàn)橄笙?，3，2，4。練習(xí)開(kāi)始時(shí)，將平臺(tái)置于第一象限，從池壁4個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水池，4個(gè)象限按規(guī)定順序依次進(jìn)行練習(xí)。自由錄像記錄系統(tǒng)記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間和游泳路徑，小鼠找到平臺(tái)后或者60 s內(nèi)找不到平臺(tái)(潛伏期記為60 s)，則由試驗(yàn)者將其引導(dǎo)到平臺(tái)，在平臺(tái)上休息10 s，再進(jìn)行下只小鼠的試驗(yàn)，每日以小鼠4次練習(xí)潛伏期的平均值作為小鼠當(dāng)日的成績(jī)。

1.3.2.2 空間探索試驗(yàn)

定位航行試驗(yàn)結(jié)束24 h后，撤除圓臺(tái)，然后任選一相同入水點(diǎn)將鼠放入水中，記錄鼠在60 s內(nèi)的游泳路徑，同時(shí)也記錄鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間和穿越目標(biāo)象限的次數(shù)，觀察受試鼠的空間定位能力及在空間探索過(guò)程中的變化規(guī)律。在電腦屏幕上用圓形環(huán)標(biāo)記出圓臺(tái)原所在位置，這樣可以記錄穿越原站臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.4 雌激素檢測(cè)

小鼠眼球取血進(jìn)行血清性激素測(cè)定，使用離心管收集并密封1 mL以上血液，離心機(jī)3 000 r/min離心10 min后，使用移液槍移取上層清液即為血清，密封后放入-80 ℃冰箱凍存待用。采用雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測(cè)法檢測(cè)不同組別小鼠的血清FSH、LH、E2水平，并按劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作步驟[22]。酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)(主波450 nm，輔助波長(zhǎng)630 nm)對(duì)不同組別的標(biāo)本OD值進(jìn)行測(cè)量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后計(jì)算不同組別血清中FSH、LH、E2 3種激素含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本間差異的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間的均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 定位航行試驗(yàn)

通過(guò)定位試驗(yàn)的結(jié)果(表1)可以得出，在試驗(yàn)的第2天，初始象限為第2，第4象限時(shí)，1組的逃避潛伏期低于2組和3組，在初始象限為第1，第3象限時(shí)，1組的逃避潛伏期要高于2組和3組；同時(shí)可以看出，通過(guò)3 d的訓(xùn)練后，1組，2組和3組的小鼠空間記憶能力發(fā)生了一些改變，在定位航行的第5天，1組在初始象限為第1，第2，第4象限時(shí)的逃避潛伏期小于3組。經(jīng)SPSS分析得出，不同組別間逃避潛伏期有顯著性差異(P<0.05)。

表1 3組小鼠定位航行試驗(yàn)中的逃避潛伏期

2.2 空間探索試驗(yàn)

不同組別目標(biāo)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比，初始角度和穿越圓臺(tái)次數(shù)比較見(jiàn)表2。由表可知，1組小鼠目標(biāo)象限所占總時(shí)間的百分比高于2組，2組的目標(biāo)象限所占總時(shí)間的百分比高于3組(P>0.05)，差異不顯著；1組的初始角度和穿越圓臺(tái)次數(shù)都高于2組，2組的初始角度和穿越圓臺(tái)次數(shù)都高于3組(P>0.05)，差異不顯著。

表2 空間探索試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)4 d的定位航行試驗(yàn)之后，小鼠對(duì)水迷宮圓臺(tái)的空間位置產(chǎn)生不同程度的記憶，撤除圓臺(tái)后，系統(tǒng)記錄游泳軌跡以反映小鼠對(duì)尋找圓臺(tái)的不同搜尋策略。由圖3，4及表2可知，正常組小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的尋找路程和時(shí)間較其他象限均長(zhǎng)，卵巢切除組和子宮卵巢切除組在目標(biāo)象限游泳路程及時(shí)間較正常組短，其對(duì)圓臺(tái)記憶能力與正常組比較有一定差距，相比較而言，子宮卵巢切除組較卵巢切除組在目標(biāo)象限的時(shí)間短，其對(duì)圓臺(tái)記憶能力與卵巢切除組有一定程度的差異。從穿越圓臺(tái)次數(shù)看，正常組在一定程度上高于其他2個(gè)手術(shù)組，但無(wú)顯著性差異。

2.3 血清性激素水平檢測(cè)

與正常組相比，切除卵巢子宮組和切除卵巢組的FSH、LH水平均顯著升高，兩組小鼠血清E2水平均顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);而與卵巢去勢(shì)組相比，切除卵巢子宮組FSH、LH水平均略升高，E2水平也稍降低，但兩組之間均不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同組別小鼠血清性激素水平比較

3 討論

將試驗(yàn)的第2天作為定位航行試驗(yàn)的開(kāi)始，定位航行試驗(yàn)中的小鼠開(kāi)始時(shí)表現(xiàn)為正常組能更快更準(zhǔn)確地找到平臺(tái)，也可以驗(yàn)證諸多試驗(yàn)中子宮卵巢切除和卵巢切除導(dǎo)致小鼠雌激素水平下降，從而導(dǎo)致小鼠空間記憶力差，但經(jīng)過(guò)幾天的練習(xí)后，試驗(yàn)組小鼠均能更快更準(zhǔn)確地找到平臺(tái)，甚至有幾只試驗(yàn)組小鼠的學(xué)習(xí)能力強(qiáng)過(guò)正常組小鼠，說(shuō)明切除卵巢和切除子宮卵巢的小鼠也具備很強(qiáng)的學(xué)習(xí)能力。在空間探索試驗(yàn)中，正常組小鼠表現(xiàn)為能更長(zhǎng)時(shí)間在目標(biāo)象限進(jìn)行平臺(tái)探索，說(shuō)明了正常組小鼠的記憶能力稍強(qiáng)，切除卵巢組小鼠次之，切除子宮卵巢組小鼠空間記憶力最差，但均具有很強(qiáng)的學(xué)習(xí)能力，也說(shuō)明短時(shí)間內(nèi)激素水平的變化不足以顯著性降低小鼠的空間記憶能力。

3.1 卵巢與卵巢子宮同時(shí)切除對(duì)成年雌鼠空間激素水平的影響

體內(nèi)雌激素主要由卵巢、腎上腺皮質(zhì)分泌，雌激素可促進(jìn)卵泡發(fā)育使成熟的卵子順利排出，同時(shí)對(duì)下丘腦—垂體調(diào)節(jié)機(jī)制有負(fù)反饋?zhàn)饔肹24-25]。卵巢切除后雌激素下降，導(dǎo)致FSH及LH因失去E2的負(fù)反饋效應(yīng)而逐漸升高。人類絕經(jīng)前5～10年，卵巢濾泡功能逐漸衰退，從而FSH和LH水平開(kāi)始逐漸升高，并伴有E2水平的降低[26]。在35～50歲的正常生殖健康婦女的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)[27-28]，隨增齡變化卵巢體積縮小，卵巢的功能降低，發(fā)育成熟的卵泡逐漸減少，內(nèi)分泌紊亂癥狀開(kāi)始出現(xiàn)，血中雌激素水平下降，伴隨而來(lái)的下丘腦促性腺激素釋放激素GnRH水平、FSH和LH明顯上升。該試驗(yàn)使用子宮卵巢切除與卵巢切除造模小鼠進(jìn)行模擬試驗(yàn)，選取E2、LH、FSH這3個(gè)與生殖內(nèi)分泌關(guān)系最密切的激素作為研究指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)切除卵巢與同時(shí)切除子宮和卵巢均能使小鼠血清內(nèi)激素水平發(fā)生上述改變，影響顯著。比較而言，這種改變?cè)谕瑫r(shí)切除卵巢和子宮組中表現(xiàn)更為突出。

3.2 卵巢切除對(duì)成年雌鼠空間記憶能力的影響

Morris水迷宮是20世紀(jì)80年代由英國(guó)生理學(xué)家Morris[29]設(shè)計(jì)并應(yīng)用于評(píng)估嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的重要工具,涉及的被試動(dòng)物主要是鼠，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于認(rèn)知功能方面的研究。田方澤等[30]通過(guò)運(yùn)用Morris水迷宮試驗(yàn)對(duì)去卵巢小鼠所致老年癡呆模型探討研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力下降，很好的模擬了阿爾茨海默癥(Alzheimer disease，AD)外在行為學(xué)的表現(xiàn)。賈曉靜等[31]在研究OVX模型的Morris水迷宮檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，其造模6周后去卵巢所致AD小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期明顯增長(zhǎng)，在目標(biāo)象限的時(shí)間變長(zhǎng)，與對(duì)照組以及ERT代替組相比較有明顯的顯著性差異(P<0.01)，這就說(shuō)明了造模后的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，同時(shí)也很好地模擬了AD外在行為學(xué)表現(xiàn)，趙珩[32]對(duì)去勢(shì)12周后的Wistar大鼠通過(guò)Morris水迷宮檢測(cè)得出，和倍美力組比較來(lái)說(shuō)，模型組大鼠的潛伏期顯著增長(zhǎng)(P<0.01)，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.01)。對(duì)該試驗(yàn)而言，通過(guò)對(duì)卵巢切除組小鼠和正常組小鼠的Morris水迷宮觀察可以得到初步結(jié)論，卵巢切除會(huì)對(duì)昆明小鼠的空間記憶功能有一定程度的損壞，但手術(shù)組小鼠仍有較強(qiáng)的學(xué)習(xí)記憶能力，所以就該試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，結(jié)果分析并未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異，對(duì)于卵巢切除對(duì)小鼠空間記憶能力的影響仍需進(jìn)一步研究。

3.3 子宮卵巢切除對(duì)小鼠空間記憶能力的影響

小鼠的空間記憶能力受到許多方面的影響，其中子宮卵巢切除也是影響小鼠空間記憶能力的一個(gè)可能性的因素，子宮不分泌雌激素，它只是雌激素作用的靶器官[33]，雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜和平滑肌的增殖和代謝有明顯促進(jìn)作用[34]，雌激素水平下降會(huì)導(dǎo)致早老性癡呆癥，明浩[35]等研究認(rèn)為，對(duì)于雌性小鼠的研究表明卵巢激素確實(shí)可以調(diào)節(jié)睡眠，剝奪對(duì)內(nèi)側(cè)顳葉依賴性認(rèn)知的影響，卵巢切除會(huì)使雌激素水平降低，而子宮卵巢同時(shí)切除則會(huì)使降低水平之后的雌激素更無(wú)子宮這一靶器官去作用，從而更加加重影響睡眠，而大腦受到睡眠障礙會(huì)對(duì)認(rèn)知功能有一定的不良影響，確實(shí)有研究已經(jīng)表明，睡眠功能障礙可能會(huì)加速年齡相關(guān)的認(rèn)知能力下降，并轉(zhuǎn)化為AD[36-37]，但并沒(méi)有其他研究可以解釋卵巢激素的丟失對(duì)動(dòng)物睡眠和記憶之間的影響，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)研究驗(yàn)證此結(jié)論。

4 結(jié)論

通過(guò)該試驗(yàn)，切除卵巢和切除子宮卵巢對(duì)小鼠體內(nèi)激素雌激素水平影響顯著，卵巢切除后會(huì)影響雌激素水平導(dǎo)致體內(nèi)其他相關(guān)激素水平的變化，從而造成內(nèi)分泌紊亂；2個(gè)試驗(yàn)組雌激素變化對(duì)小鼠空間記憶能力均有一定的影響，數(shù)據(jù)顯示影響不顯著。分析可知：1) 試驗(yàn)小鼠樣本數(shù)過(guò)少，需在此基礎(chǔ)上加大試驗(yàn)基數(shù)，增大試驗(yàn)樣本數(shù)，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和說(shuō)服力;2) 卵巢切除后雌激素水平發(fā)生變化時(shí)間較短，對(duì)小鼠空間記憶能力沒(méi)有造成顯著影響。該試驗(yàn)為雌激素降低影響空間記憶相關(guān)的時(shí)間周期與激素影響小鼠空間記憶能力路徑的研究提供了研究基礎(chǔ)。