楊冰祎，王振宇，千慧燕，閔鵬飛，張爽，賈立軍*

(1.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，延邊大學(xué)；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院： 吉林 延吉 133002)

新孢子蟲(chóng)病是由犬新孢子蟲(chóng)(Neosporacaninum)引起孕畜流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎，以及新生兒運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙的一種原蟲(chóng)病[1]。弓形蟲(chóng)病是一種人畜共患傳染病，該病多呈隱性感染，嚴(yán)重影響人類、家畜和野生動(dòng)物的健康，被視為一種嚴(yán)重威脅疾病[2]。為減輕新孢子蟲(chóng)病和弓形蟲(chóng)病給畜牧業(yè)帶來(lái)的危害，篩選有效藥物和研制疫苗是當(dāng)前的研究重點(diǎn)[3]。雖然乙胺嘧啶在弓形蟲(chóng)治療方面是首選藥物，青蒿素及其衍生物對(duì)弓形蟲(chóng)和新孢子蟲(chóng)也具有一定抑制作用，但針對(duì)弓形蟲(chóng)與新孢子蟲(chóng)的有效防控仍然是一項(xiàng)急需解決的難題[4-7]。

張步彩等[8]用白牛膽、垂花香薷、黃皮葉、樺褐孔菌多糖進(jìn)行抗弓形蟲(chóng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)幾種藥物均有一定程度的抗弓形蟲(chóng)的作用。而且相關(guān)試驗(yàn)證明，樺褐孔菌多糖也具有一定的抗弓形蟲(chóng)作用[9]。該試驗(yàn)以雙氫青蒿素作為研究對(duì)象，開(kāi)展體外抗新孢子蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)研究，以期確定雙氫青蒿素體外抑制2種蟲(chóng)體的作用效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自Gibico公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自浙江天杭生物科技公司，雙抗(青鏈霉素混合液)、胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS和二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。樺褐孔菌多糖(含量≥85%)由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)試驗(yàn)室提取保存，雙氫青蒿素(含量≥98%)購(gòu)自上海哈靈生物科技有限公司，青蒿素(含量≥98%)和乙胺嘧啶(含量≥98%)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，黃芩苷(含量≥95% )由上海源葉生物科技有限公司。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將樺褐孔菌多糖稀釋，0.22 μm濾膜濾菌后4 ℃保存?zhèn)溆?；用二甲基亞砜將雙氫青蒿素、青蒿素、黃芩苷、乙胺嘧啶分別配置成母液并過(guò)0.22 μm濾膜，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞及蟲(chóng)體

Vero細(xì)胞、新孢子蟲(chóng)NC-GFP株和弓形蟲(chóng)MIC10-GFP株由延邊大學(xué)預(yù)防實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 細(xì)胞與蟲(chóng)體的培養(yǎng)

37 ℃、5% CO2培養(yǎng)Vero細(xì)胞，將NC-GFP與MIC10-GFP接種Vero細(xì)胞中，當(dāng)速殖子增殖游離于培養(yǎng)液中時(shí)，過(guò)27 G針頭和5 μm濾膜純化速殖子，并計(jì)數(shù)，備用。

1.4 MTT法測(cè)定雙氫青蒿素等藥物對(duì)Vero細(xì)胞毒性

按照謝素珠等[10]方法應(yīng)用MTT法測(cè)定雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶等對(duì)Vero細(xì)胞的毒性。計(jì)算方法：增殖率=(試驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(試驗(yàn)對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.5 MTT法藥物體外抗新孢子蟲(chóng)與弓形蟲(chóng)試驗(yàn)

按照謝素珠等[3]方法，雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶以細(xì)胞毒性試驗(yàn)中得到的安全濃度及用培養(yǎng)液稀釋至80%、50%、25%、5%，每孔150 μL，對(duì)照組加入150 μL 0.1% DMSO的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)60 h后，在熒光倒置顯微鏡下通過(guò)對(duì)GFP熒光信號(hào)的統(tǒng)計(jì)與隨機(jī)視野中速殖子的個(gè)數(shù)及納蟲(chóng)泡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。抑制率=(對(duì)照組個(gè)數(shù)-藥物處理組個(gè)數(shù))/對(duì)照組中個(gè)數(shù)×100%，以此來(lái)計(jì)算蟲(chóng)體抑制率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。同一藥物同一時(shí)間不同濃度的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。P<0.01表示差異極顯著，0.010.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性試驗(yàn)

在24和48 h時(shí)不同藥物不同濃度對(duì)Vero細(xì)胞的毒性結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，2個(gè)時(shí)間細(xì)胞增殖率均在90%以上所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為雙氫青蒿素20 mg/L、青蒿素25 mg/L、樺褐孔菌多糖40 mg/L、黃芩苷20 mg/L及乙胺嘧啶2 mg/L，按照此濃度為試驗(yàn)安全濃度進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 藥物對(duì)Vero細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.2 藥物體外抗新孢子蟲(chóng)與弓形蟲(chóng)速殖子增殖試驗(yàn)

新孢子蟲(chóng)給藥12 h后在熒光顯微鏡下觀察,各藥物高質(zhì)量濃度組下細(xì)胞形態(tài)均保持正常。給藥24 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞形態(tài)正常，納蟲(chóng)泡體積最小，青蒿素細(xì)胞形態(tài)正常，納蟲(chóng)泡體積正常，青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積稍變大，納蟲(chóng)泡形態(tài)較大。36 h后雙氫青蒿素少部分細(xì)胞體積變大，納蟲(chóng)泡未發(fā)生變化；青蒿素部分細(xì)胞體積發(fā)生變化，納蟲(chóng)泡無(wú)明顯變化；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積增大，納蟲(chóng)泡體積增大。48 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積略有變大，納蟲(chóng)泡體積未發(fā)生變化；青蒿素細(xì)胞體積略有變大，納蟲(chóng)泡未發(fā)生明顯變化；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積增大，少部分細(xì)胞裂解且納蟲(chóng)泡體積增大，胞外見(jiàn)少量速殖子。60 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組觀察，大部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞間聚集生長(zhǎng)，可見(jiàn)零星納蟲(chóng)空泡；青蒿素高質(zhì)量濃度組觀察，個(gè)別細(xì)胞裂解，大部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化，可見(jiàn)量納蟲(chóng)空泡；樺褐孔菌多糖高質(zhì)量濃度觀察細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，納蟲(chóng)泡變大，部分細(xì)胞發(fā)生崩解。觀察黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組，部分細(xì)胞邊緣裂解，胞外可見(jiàn)少量速殖子；對(duì)照組細(xì)胞全部邊緣裂解，形態(tài)模糊，大部分細(xì)胞完全破裂，可見(jiàn)大量速殖子。60 h后高質(zhì)量濃度藥物組體外抑制新孢子蟲(chóng)結(jié)果見(jiàn)圖1。

弓形蟲(chóng)給藥12 h后熒光顯微鏡下觀察，各藥物高質(zhì)量濃度組細(xì)胞形態(tài)均保持正常。給藥24 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組中大部分細(xì)胞形態(tài)正常；青蒿素大部分細(xì)胞形態(tài)基本正常，納蟲(chóng)泡體積正常；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積略微變大，納蟲(chóng)泡形態(tài)較大。36 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度中細(xì)胞體積略微變大，納蟲(chóng)泡形態(tài)無(wú)明顯變化；青蒿素高質(zhì)量濃度組細(xì)胞體積略變大，納蟲(chóng)泡體積略微變大；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積增大，部分納蟲(chóng)泡體積明顯增大。48 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積略變大，納蟲(chóng)泡體積略微變大；青蒿素細(xì)胞體積略有變大，納蟲(chóng)泡略微變大；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞裂解且納蟲(chóng)泡體積增大，胞外見(jiàn)少量速殖子。60 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組觀察，胞外可見(jiàn)零星的速殖子和納蟲(chóng)泡；青蒿素、樺褐孔菌多糖及黃芩苷高質(zhì)量濃度組觀察，胞外見(jiàn)少量成片狀速殖子；乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組觀察，可見(jiàn)少量速殖子和單個(gè)納蟲(chóng)泡。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)模糊，胞外可見(jiàn)大量速殖子和充滿速殖子的納蟲(chóng)泡。60 h后高質(zhì)量濃度藥物組體外抑制弓形蟲(chóng)結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 藥物體外對(duì)新孢子蟲(chóng)與弓形蟲(chóng)速殖子的抑制效果

給藥60 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，不同藥物的抑新孢子蟲(chóng)效果不同，同一藥物不同濃度的抑蟲(chóng)效果也不同。雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度(20 mg/L)抑制率為97.69%，高質(zhì)量濃度組中抑蟲(chóng)率相近(表2)；青蒿素高質(zhì)量濃度(25 mg/L)抑制率為95.36%(表3)，與雙氫青蒿素抑蟲(chóng)率相近；樺褐孔菌多糖高質(zhì)量濃度(40 mg/L)的抑制率為70.44%(表4)，黃芩苷高質(zhì)量濃度(20 mg/L)的抑制率為66.53%(表5)，乙胺嘧啶高質(zhì)量濃度(2 mg/L)的抑制率為67.29%(表6)。

表2 60 h雙氫青蒿素不同質(zhì)量濃度中抑蟲(chóng)率的比較Table 2 Comparison of inhibition rate in different concentrations of dihydroartemisinin at 60 h

表3 60 h青蒿素不同質(zhì)量濃度中抑蟲(chóng)率的比較

表4 60 h樺褐多糖孔菌不同質(zhì)量濃度中抑蟲(chóng)率的比較

表5 60 h黃芩苷不同質(zhì)量濃度中抑蟲(chóng)率的比較

表6 60 h乙胺嘧啶不同質(zhì)量濃度中抑蟲(chóng)率的比較

給藥60 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，不同藥物的抑弓形蟲(chóng)效果不同，同一藥物不同濃度的抑蟲(chóng)效果也不同。雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度(20 mg/L)抑制率為86.56%(表2)；青蒿素高質(zhì)量濃度(25 mg/L)抑制率為82.81%(表3)；樺褐孔菌多糖高質(zhì)量濃度(40 mg/L)的抑制率為63.48%(表4)；黃芩苷高質(zhì)量濃度(20 mg/L)的抑制率為72.21%(表5)；乙胺嘧啶高質(zhì)量濃度濃度(2 mg/L)的抑制率為81.84%(表6)。

由表2可知，在雙氫青蒿素藥物組中，同一時(shí)間高質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲(chóng)的效果無(wú)顯著差異(P>0.05),低質(zhì)量濃度組間差異顯著(0.010.05)，低質(zhì)量濃度組間差異極顯著(P<0.01)。由表4可見(jiàn)，在樺褐孔菌多糖藥物組中，同一時(shí)間高質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲(chóng)效果無(wú)顯著差異(P>0.05)，高濃度和低質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)。由表5可見(jiàn)，在黃芩苷藥物組中，同一時(shí)間高質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲(chóng)效果均無(wú)顯著差異(P>0.05)，在低濃度間差異極顯著(P<0.01)。由表6可見(jiàn)，在乙胺嘧啶藥物組中，同一時(shí)間各質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲(chóng)效果均差異極顯著(P<0.01)。

由表2可知，在雙氫青蒿素藥物組中，同一時(shí)間各質(zhì)量濃度組間抑制弓形蟲(chóng)的效果均差異極顯著(P<0.01)。由表3可知，在青蒿素藥物組中，同一時(shí)間各質(zhì)量濃度組間抑蟲(chóng)效果差異極顯著(P<0.01)。由表4可見(jiàn)，在樺褐孔菌多糖藥物組中，同一時(shí)間各質(zhì)量濃度組間抑制弓形蟲(chóng)效果均差異極顯著(P<0.01)。由表5可見(jiàn),在黃芩苷藥物組中，同一時(shí)間高濃度質(zhì)量濃度組間抑制弓形蟲(chóng)效果差異顯著(P>0.05)，低質(zhì)量濃度組間差異極顯著(P<0.01)。由表6可見(jiàn),在乙胺嘧啶藥物組中，同一時(shí)間高質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲(chóng)效果無(wú)顯著差異(P>0.05)，低質(zhì)量濃度組間差異極顯著(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

目前，針對(duì)新孢子蟲(chóng)病和弓形蟲(chóng)病已經(jīng)進(jìn)行了一定的研究。但在新孢子蟲(chóng)病和弓形蟲(chóng)病防治方面仍無(wú)有效方法，因此體外篩選出安全有效的抗新孢子蟲(chóng)與弓形蟲(chóng)藥物至關(guān)重要。青蒿素及其衍生物雙氫青蒿素具有抗瘧疾、抗腫瘤作用[11]；樺褐孔菌多糖具有降血糖、抗菌、抗病毒的作用；黃芩苷作為一種黃酮類化合物具有抑菌、抗癌抗、病毒的作用；乙胺嘧啶可抑制二氫葉酸還原酶，因而干擾瘧原蟲(chóng)的葉酸正常代射，對(duì)瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞有一定效果，可作為預(yù)防用藥[12]。由此，該試驗(yàn)應(yīng)用雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶等進(jìn)行了體外抑制新孢子蟲(chóng)與弓形蟲(chóng)研究，以此確定各種藥物的體外抗蟲(chóng)作用。

該試驗(yàn)基于謝素珠[10]等抗新孢子蟲(chóng)試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，藥物的試驗(yàn)濃度進(jìn)行了小幅度變化，并且在體外的抑蟲(chóng)試驗(yàn)觀察間隔縮短為12 h，而且為配合總體試驗(yàn)時(shí)間將總時(shí)間縮短12 h。觀察時(shí)間間隔的縮短可以使對(duì)于各藥物不同時(shí)間段對(duì)于蟲(chóng)體的作用情況清晰明確，便于對(duì)于各時(shí)間段蟲(chóng)體的觀察與比對(duì)。但與之對(duì)應(yīng)的缺點(diǎn)是過(guò)于頻繁的將蟲(chóng)體從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出至室外觀察且每次觀察時(shí)間較長(zhǎng)，雖在總時(shí)間上進(jìn)行了微調(diào)整，但對(duì)于細(xì)胞及蟲(chóng)體生長(zhǎng)狀況可能有一定影響，引起部分試驗(yàn)結(jié)果偏差。

謝素珠[10]等應(yīng)用青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶等藥物對(duì)體外培養(yǎng)的新孢子蟲(chóng)進(jìn)行了抑制作用研究，該試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上應(yīng)用雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶等進(jìn)行了體外抑制新孢子蟲(chóng)與弓形蟲(chóng)研究，目的是確定雙氫青蒿素在抗新孢子蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)方面的作用。5種藥物作用效果均與藥物濃度顯現(xiàn)正相關(guān)，即在安全范圍內(nèi)濃度越高，抑蟲(chóng)效果越好。表明雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶均可作為抗新孢子蟲(chóng)與弓形蟲(chóng)潛在藥物，該試驗(yàn)證實(shí)，雙氫青蒿素在質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)抑制新孢子蟲(chóng)效率最高為97.69%，抑制弓形蟲(chóng)效果最好為86.56%。為體內(nèi)藥物試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。