劉 奕，楊葉欣，劉 超，宋紅梅，2，汪學(xué)杰，牟希東*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省現(xiàn)代休閑漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510380；2.廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380）

【研究意義】美麗硬仆骨舌魚(yú)（Scleropages formosus），俗稱金龍魚(yú)，隸屬于骨舌魚(yú)目（Osteoglossiformes），骨舌魚(yú)科（Osteoglossidae），是世界上昂貴的淡水觀賞魚(yú)品種，被譽(yù)為“觀賞魚(yú)之王”[1]。其古老而珍稀，從化石依據(jù)的推斷，起源可以追溯到中生代[2]，由于過(guò)渡捕撈導(dǎo)致瀕臨絕種，被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES，簡(jiǎn)稱華盛頓公約）附錄I。美麗硬仆骨舌魚(yú)具有進(jìn)化地位古老、瀕危、繁殖力不高，繁殖習(xí)性及生理結(jié)構(gòu)特殊、性成熟周期較長(zhǎng)的特征[3]。國(guó)內(nèi)外涉及美麗硬仆骨舌魚(yú)研究報(bào)道則多數(shù)集中在其資源分布[4]、遺傳結(jié)構(gòu)[5]和基因組學(xué)研究[6-7]等方面，對(duì)其基因表達(dá)和調(diào)控通路方面的研究則極為有限。raf是調(diào)控細(xì)胞增殖、分泌等生命活動(dòng)的重要基因，但在骨舌魚(yú)類(lèi)中該基因的結(jié)構(gòu)特征及功能研究則尚未有報(bào)道?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Raf 激酶是一個(gè)高度保守的酶，可激活絲裂原活化蛋白信號(hào)通路（mitogen-activated protein kinase，MAPK），也是該通路的重要組成部分[8]。MAPK 信號(hào)通路將細(xì)胞外受到的刺激傳遞至細(xì)胞內(nèi)以及細(xì)胞核內(nèi)，是生命體內(nèi)傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的重要系統(tǒng)之一。該通路以Raf 激酶、MAP 細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（mitrogen-activated protein extracellular regulated kinase，MEK）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）為主干，在真核生物體內(nèi)較為廣泛的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生命活動(dòng)[9]。Raf 激酶則調(diào)控細(xì)胞增殖、分泌和運(yùn)動(dòng)等，在調(diào)節(jié)該信號(hào)通路方面起著重要的作用[10]。在對(duì)稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）的研究中發(fā)現(xiàn)raf基因在性腺和肝中表達(dá)量最高[11]。在雜交鱧（Channa maculata♀×Channa argus ♂）的免疫相關(guān)組織脾臟、胸腺和頭腎中，raf有較高的表達(dá)量，證實(shí)其在自身免疫系統(tǒng)發(fā)育中起到重要作用[12]。【本研究切入點(diǎn)】2015 年Austin 等[13]最先完成美麗硬仆骨舌魚(yú)全基因組測(cè)序。2016 年，Bian 等[6]也完成了美麗硬仆骨舌魚(yú)的基因組測(cè)序，并且組裝質(zhì)量得到了改善。Shen 等[14]構(gòu)建了美麗硬仆骨舌魚(yú)第一張遺傳連鎖圖譜，并完成了性腺和腦的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。以上研究為美麗硬仆骨舌魚(yú)功能基因的研究提供了條件?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究從raf的克隆和表達(dá)分析入手，探討美麗硬仆骨舌魚(yú)raf基因的結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)特征，構(gòu)建原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中誘導(dǎo)出融合蛋白，為進(jìn)一步研究raf在美麗硬仆骨舌魚(yú)體內(nèi)的生物功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用美麗硬仆骨舌魚(yú)采自國(guó)家淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源庫(kù)珠江分庫(kù)，是以2009 年珠江水產(chǎn)研究所從馬來(lái)西亞引進(jìn)個(gè)體為原代親本，于2017 年自繁所得的F2 代。根據(jù)組織切片方法鑒定性別，選取性腺發(fā)育Ⅲ期的美麗硬仆骨舌魚(yú)6 尾（3 雌3 雄）。雌性體質(zhì)量（807.78±4.57）g，全長(zhǎng)（38.07±1.73）cm；雄性體質(zhì)量（900.83±5.92）g，全長(zhǎng)（42.25±1.91）cm。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成 用Total RNA KitⅡ（OMEGA）RNA 提取試劑盒分別提取美麗硬仆骨舌魚(yú)性腺、肝、脾、腎、鰓、心、頭腎、腦等8 種組織總RNA，用BioTek Cytation?5 多功能酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA 濃度和純度，以及10 g/L 瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA 完整性。各取1 ng RNA 運(yùn)用Prime-ScriptTMⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA 第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因克隆 取美麗硬仆骨舌魚(yú)精巢組織提取的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。參考美麗硬仆骨舌魚(yú)基因組序列設(shè)計(jì)raf基因中間序列擴(kuò)增序列引物raf-F1/R1（表1）。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：ddH2O 18.9 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA模板0.6 μL，TaqE 0.2 μL。PCR 條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)TIANgel Midi Purification Kit 瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收，連接pMD19-T Vector 載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)5'RACE 和3'RACE 巢式PCR 引物raf-5'-1、raf-5'-2 與raf-3'-1、raf-3'-2（表1），用SMARTerT M RACE cDNA Amplification Kit 擴(kuò)增raf的5'端和3'端序列，并測(cè)序。將中間擴(kuò)增序列、5'端和3'端序列經(jīng)Vector NTI軟件拼接，獲得完整的美麗硬仆骨舌魚(yú)rafcDNA全序列（圖1）。

圖1 美麗硬仆骨舌魚(yú)raf基因cDNA序列及其推導(dǎo)蛋白序列Fig.1 The cDNA sequence of raf gene and deduced protein sequence

表1 研究中所用的引物序列Tab.1 Primers used in experiments

1.2.3 基因序列分析 運(yùn)用Vector NTI 查找raf基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），并推導(dǎo)出氨基酸序列。用Prot Param（http://web.expasy.org/protparam/）軟件在線分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)；用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）軟件分析親疏水性；用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）軟件分析信號(hào)肽；運(yùn)用TMpred（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；用NetPhos 2.0 Server軟件進(jìn)行磷酸化分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/）；運(yùn)用SMART 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析（http://smart.emblheidelberg.de/）；用ClustalX1.83 軟件進(jìn)行氨基酸序列多序列比對(duì)，并用MAGE 5.2 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（表2）。

表2 用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的物種Tab.2 Species used to construct phylogenetic trees

1.2.4 組織表達(dá) 選用美麗硬仆骨舌魚(yú)GAPDH 作為內(nèi)參基因，參考Pan等[15]發(fā)表的引物序列合成引物。根據(jù)克隆所得的rafcDNA 全序列設(shè)計(jì)一對(duì)熒光定量PCR（qRT-PCR）引物raf-F2 和raf-R2（表1）。分別將以上2 對(duì)引物的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD19-T Vector 并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α 感受細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)培，然后用TIANprep Mini Plasmid Kit提取質(zhì)粒。

用BioTek Cytation?5 多功能酶標(biāo)儀測(cè)定質(zhì)粒濃度，然后對(duì)其以10 倍梯度稀釋?zhuān)苍O(shè)12 個(gè)梯度。用QuantStudio6 Flex 儀器制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，若R2＞0.99，斜率在-3.0～-3.6，則說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線制作合格。qRTPCR 體系共20 μL，包括10 μL SYBR Green Master Mix，1 μL cDNA，8 μL ddH2O，各0.5 μL 上下游引物（10 μmol/L）。反應(yīng)條件：50 ℃2 min；95 ℃5 min；95 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；溶酶曲線：95 ℃，15 s；60 ℃，2 min；95 ℃，15 s；每個(gè)樣品重復(fù)3 次。用QuantStudioTM Real-Time PCR Solftware v1.2軟件計(jì)算每個(gè)樣品的目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增后的拷貝數(shù)（Qty），各樣品的目的基因和內(nèi)參基因Qty 值之比即為目的基因相對(duì)定量值。用Excel 作圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 20 軟件進(jìn)行單因素方差分析法（One-Way ANOVA）和Duncan多重比較分析顯著性差異。

1.2.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 選取同源區(qū)域相對(duì)較少的前297 個(gè)氨基酸區(qū)段制備抗原（預(yù)測(cè)分子量為33.2 ku），上游引物raf-F：5'-CGGACCG-ATGTCCCCGACCGTTGGCC-3'，下游引物raf-R：5'-GCGGCCGCCTTGTCCCTCGGTCTA-ATT-3'。其中在該對(duì)引物的5'端分別加入RsrII和NotI酶切位點(diǎn)（下劃線標(biāo)注）。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與pET-B2m載體分別經(jīng)過(guò)RsrII和NotI雙酶切（37 ℃，2 h），然后放置恒溫金屬浴儀器中16 ℃連接過(guò)夜。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序（廣州艾基），經(jīng)序列比對(duì)后確定插入片段為正確序列，將陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根）抽提重組質(zhì)粒（pET-B2m-raf）。

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有Amp+（100 μg/mL）的LB 固體培養(yǎng)基上，挑取單個(gè)菌落，接種至含有Amp+（100 μg/mL）的液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，次日按1∶50擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6，加0.1 mmol/L IPTG，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。菌液經(jīng)8 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集菌體。添加100 mL 破碎液在冰浴條件下進(jìn)行超聲波裂解。裂解條件：功率60%、超聲2 s、間隔2 s、時(shí)間15 min。12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 分析，經(jīng)考馬斯亮R-250染色，脫色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 美麗硬仆骨舌魚(yú)raf基因的克隆及序列分析

用VectorNTI 軟件拼接得到rafcDNA 全序列為3 734 bp，ORF 為1 827 bp，共編碼609 個(gè)氨基酸。序列兩端分別存在1 110 bp 的5'非編碼區(qū)（untraslated region，UTR）和797 bp 的3'UTR，且3'端含有典型的poly（A）尾（圖1）。經(jīng)ProtParam 和ProtScale 軟件預(yù)測(cè)該基因的蛋白分子量為68.8 ku，等電點(diǎn)PI 為9.45，分子式為C3046H4822N870O881S34，親水性平均系數(shù)為-0.409，說(shuō)明其親水性較強(qiáng)。

2.2 raf編碼氨基酸序列生物信息學(xué)分析

2.2.1 信號(hào)肽與跨膜區(qū)域分析 用SignalP 4.1 軟件分析結(jié)果顯示，該序列信號(hào)肽區(qū)域分值（S）為0.117，信號(hào)肽剪切位點(diǎn)分值（C）為0.141，剪切位點(diǎn)分值（Y）為0.120，meanS和D分別為0.097、0.108，低于臨界值0.450，表明該蛋白不存在信號(hào)肽。經(jīng)TMHMM 軟件分析表明，該序列含有1 個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，是由膜外向膜內(nèi)的跨膜螺旋，位于第312至332位氨基酸之間，說(shuō)明該蛋白為跨膜蛋白。

2.2.2 磷酸化位點(diǎn)分析 用NetNGlyc 1.0 軟件分析發(fā)現(xiàn)該序列不存在潛在的糖基化位點(diǎn)。用NetPhos 2.0 軟件分析表明該序列共含有47 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中32 個(gè)絲氨酸（Ser），13 個(gè)蘇氨酸（Thr）和2 個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)。

2.2.3 結(jié)構(gòu)域分析 用Smart 軟件分析顯示該基因編碼蛋白序列含有：1 個(gè)Ras 結(jié)合域（Ras-binding domain，RBD），該結(jié)合域包含76 個(gè)氨基酸；1 個(gè)蛋白激酶C 保守區(qū)（C1）結(jié)構(gòu)域（Protein kinase C conserved region 1（C1）domains），共46個(gè)氨基酸；1個(gè)低合成復(fù)雜度區(qū)域，共12個(gè)氨基酸；1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（Serine/Threonine protein kinases，catalytic domain），該結(jié)構(gòu)域共258個(gè)氨基酸（圖2）。

圖2 美麗硬仆骨舌魚(yú)raf基因編碼蛋白質(zhì)序列保守域Fig.2 The raf gene of S.formosus encodes conserved domains of protein sequences

2.2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)Phyre2軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，raf編碼蛋白由α-螺旋，β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲和跨膜螺旋構(gòu)成，分別占26%、15%、43%和3%。預(yù)測(cè)所得蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示該蛋白符合絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶b-raf 的結(jié)構(gòu)特征，預(yù)測(cè)的可信度為100%。結(jié)合口袋是指蛋白質(zhì)與其它分子作用的區(qū)域，位于第545位到第567位氨基酸之間（圖3）。

圖3 美麗硬仆骨舌魚(yú)raf編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 S.formosus raf encoded amino acid sequence secondary structure and tertiary structure

2.3 raf基因編碼氨基酸序列的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

用ClustalX1.83 軟件將美麗硬仆骨舌魚(yú)raf基因編碼氨基酸序列與GenBank 中收錄的其他一物種同源蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)美麗硬仆骨舌魚(yú)raf氨基酸序列保守性較高，在所比對(duì)的序列中，除斑馬魚(yú)（78.36%）外，與其他魚(yú)類(lèi)序列的相似性都高于80%。美麗硬仆骨舌魚(yú)raf氨基酸序列與雀鱔相似度最高，達(dá)到84.28%；而與北美綠蜥蜴、智人和小家鼠的相似度分別是77.59%、77.01%和76.08%，而與果蠅的相似度最低，為37.90%（圖4）。

圖4 基于raf編碼氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on raf gene coding amino acid sequence

2.4 raf在不同性別、不同組織內(nèi)的表達(dá)水平分析

運(yùn)用熒光定量PCR 方法檢測(cè)美麗硬仆骨舌魚(yú)raf在8 個(gè)不同組織表達(dá)水平分析見(jiàn)圖5。raf在8個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在肝中表達(dá)水平最高，其次是性腺、頭腎和脾，腦中的表達(dá)量最低。在雄性個(gè)體中精巢、肝、頭腎和脾組織的raf表達(dá)量顯著高于鰓、腎、心和腦組織（P＜0.05）。在雌性個(gè)體中，肝raf表達(dá)量最高，其次是頭腎和脾，肝中raf表達(dá)量顯著高于卵巢、鰓、腎、心、和腦組織（P＜0.05）。將雌雄魚(yú)相同組織raf表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，雄魚(yú)的精巢顯著高于雌魚(yú)的卵巢（P＜0.05），而其他7個(gè)組織則均無(wú)性別顯著差異（P＞0.05）。

圖5 美麗硬仆骨舌魚(yú)不同組織raf相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of raf in different tissues of S.formosus

2.5 美麗硬仆骨舌魚(yú)raf基因的原核表達(dá)分析

重組的pET-B2m-raf 原核表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序和序列比對(duì)確認(rèn)未出現(xiàn)移碼現(xiàn)象和堿基突變，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）、表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，在經(jīng)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，得到分子量約為49 ku的重組蛋白。預(yù)測(cè)目的蛋白分子量33.2 ku，表達(dá)載體約14.6 ku，重組蛋白分子量為目的蛋白（33.2 ku）與表達(dá)載體（14.6 ku）分子量相加，所得結(jié)果與預(yù)期相符。經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果顯示，上清液中無(wú)相應(yīng)條帶出現(xiàn)，表明在該載體的表達(dá)體系中重組蛋白的表達(dá)形式為包涵體形式存在（圖6）。

圖6 美麗硬仆骨舌魚(yú)raf氨基酸在大腸桿菌中的重組表達(dá)Fig.6 Expression of S.formosus raf in E.coli

3 討論

Raf 激酶是高度保守的酶，活化的Raf 通過(guò)將MEK 和ERK 級(jí)聯(lián)激活，進(jìn)而磷酸化相應(yīng)的底物，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖和分化、適應(yīng)環(huán)境應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡[16]。Raf 激酶的激活機(jī)制與磷酸化關(guān)系密切，哺乳動(dòng)物Raf 是通過(guò)絲/蘇氨酸在胞膜上被磷酸化從而被激活[17]，本研究發(fā)現(xiàn)美麗硬仆骨舌魚(yú)raf基因含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，并且預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物一致，推測(cè)美麗硬仆骨舌魚(yú)raf與哺乳動(dòng)物的功能類(lèi)似。

物種的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，除斑馬魚(yú)（78.36%）外，美麗硬仆骨舌魚(yú)與文中所用其他魚(yú)類(lèi)序列的相似性都高于80%，說(shuō)明美麗硬仆骨舌魚(yú)raf蛋白序列保守性較高。雀鱔與美麗硬仆骨舌魚(yú)，都是輻鰭魚(yú)類(lèi)中較早分化出來(lái)的物種，屬于進(jìn)化地位古老的物種[13]，本研究中美麗硬仆骨舌魚(yú)raf氨基酸序列與雀鱔的相似度最高，為84.28%，這也與兩種魚(yú)類(lèi)的進(jìn)化關(guān)系相符。

王妙等[11]在對(duì)稀有鮈鯽的研究中發(fā)現(xiàn)，raf基因在雌性肝臟和卵巢中的表達(dá)量最高，在鰓、腎臟和腦中表達(dá)量較低，而在雄魚(yú)中，raf基因在精巢中表達(dá)量最高，且精巢表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢。這與本研究中raf在美麗硬仆骨舌魚(yú)中表達(dá)量結(jié)果相似，推測(cè)raf基因在魚(yú)類(lèi)中的功能比較保守。有研究表明，精巢中精子的產(chǎn)生是由卵泡刺激素和睪酮調(diào)節(jié)的，從而向體細(xì)胞支持細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，以產(chǎn)生維持發(fā)育中的精子生存和成熟所需的因子[18]。睪酮通過(guò)激活Src 激酶和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），啟動(dòng)MAPK 級(jí)聯(lián)激酶（RAF，MAPK，ERK）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而發(fā)揮作用[19-20]。Raf 激酶同時(shí)也是支持細(xì)胞中卵泡刺激素的靶點(diǎn)[21]。raf在美麗硬仆骨舌魚(yú)精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢，推測(cè)其可能參與精巢的發(fā)育和精子的發(fā)生，并且在精巢中支持細(xì)胞固定及精子釋放的調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮作用。

有研究表明，Raf 激酶及其下游轉(zhuǎn)錄因子被激活后可促進(jìn)細(xì)胞DNA 合成和細(xì)胞增殖，進(jìn)而參與調(diào)控肝臟再生[22]。而抑制Raf 激酶則會(huì)抑制肝星狀細(xì)胞的遷移[23]，從而調(diào)控肝臟的形態(tài)發(fā)育和免疫機(jī)能[24]，所以推測(cè)raf在美麗硬仆骨舌魚(yú)肝中表達(dá)量較高可能與肝細(xì)胞發(fā)育及免疫功能有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在美麗硬仆骨舌魚(yú)脾和頭腎組織也有較高的raf表達(dá)。脾臟和頭腎是魚(yú)類(lèi)重要的造血器官和免疫器官[25]。Riegel 等[8]發(fā)現(xiàn)Raf 激酶在具有免疫功能的樹(shù)突細(xì)胞分化時(shí)一直保持活化狀態(tài)，而抑制Raf 激酶則會(huì)削弱樹(shù)突細(xì)胞的激活從而無(wú)法激活T 細(xì)胞，且T 細(xì)胞激活和增殖也需要Raf 激酶的直接參與。本實(shí)驗(yàn)中，肝、脾和頭腎中raf的表達(dá)說(shuō)明其在美麗硬仆骨舌魚(yú)機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中可能也起到一定的作用。

原核表達(dá)所選用的pET-B2m 表達(dá)載體是目前應(yīng)用的成熟載體pET 系列表達(dá)系統(tǒng)之一。pET-B2m是在pET-28a（+）中插入了一個(gè)β2-微球蛋白基因，可促進(jìn)外源基因的表達(dá)[26]。本研究中獲得的融合蛋白是以包涵體形式存在，有研究表明包涵體中的大部分蛋白質(zhì)是有功能的，不需要溶解和重新折疊[27]，但后續(xù)研究還將嘗試通過(guò)優(yōu)化條件或在載體上添加助溶標(biāo)簽來(lái)誘導(dǎo)可溶性蛋白。

本研究克隆得到美麗硬仆骨舌魚(yú)raf基因的cDNA 全序列，了解了raf基因的組織表達(dá)特征，構(gòu)建原核表達(dá)載體并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了重組蛋白，為下一步制備抗體，篩選所調(diào)控的下游基因，探究美麗硬仆骨舌魚(yú)raf基因的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。