章 寒，吳宜靜，張一鳴，續(xù) 言，陸泓錦，趙天祎，蔡 明*，張 曼，蔡軍火，潘會堂，張啟翔

（1.北京林業(yè)大學(xué) 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室/國家花卉工程技術(shù)研究中心/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室/園林環(huán)境教育部工程研究中心/林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室/園林學(xué)院，北京 100083；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】尾葉紫薇（Lagerstroemia caudata）原產(chǎn)中國，屬千屈菜科（Lythraceae）紫薇屬（Lagerstroemia），是該屬唯一被證明具有花香的物種，也是培育香花紫薇新品種的重要育種親本[1-2]。廣泛了解尾葉紫薇花香物質(zhì)合成相關(guān)基因并開發(fā)大量分子標(biāo)記，將為紫薇花香遺傳改良奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，關(guān)于尾葉紫薇的研究已在雜交育種、遺傳多樣性、花香成分及釋香規(guī)律、香氣物質(zhì)生物合成與代謝等方面開展，但在分子生物學(xué)層面上的研究依舊不夠深入，缺乏對功能基因的系統(tǒng)了解[1-5]。而尾葉紫薇已有的二代轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，受限于讀長短的技術(shù)問題，部分轉(zhuǎn)錄本不能代表全長cDNA，序列信息不夠全面。微衛(wèi)星序列又名簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR），是研究植物遺傳多樣性的重要分子標(biāo)記之一[6]。在尾葉紫薇微衛(wèi)星標(biāo)記相關(guān)報道里，研究者以尾葉紫薇為材料通過磁珠富集法開發(fā)了60 個尾葉紫薇SSR 分子標(biāo)記并獲得18 對多態(tài)性引物[7]，以紫薇為材料得到在尾葉紫薇中通用的65 對多態(tài)性引物，并獲得6 個與葉片大小、地徑、株高性狀連鎖的SSR 位點[8-10]。目前與尾葉紫薇花香性狀連鎖的SSR 標(biāo)記尚未見報道，且數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足分子育種研究的需要?！颈狙芯壳腥朦c】以單分子實時（single-molecule real-time，SMRT）測序技術(shù)為代表的第三代測序技術(shù)，具有讀長超長、測序周期短、無需測序后組裝等特點，在轉(zhuǎn)錄組de novo 方面有較大的應(yīng)用前景，如可快速獲得更為全面的基因序列信息等[11-12]。因此，本研究基于SMRT 測序技術(shù)獲得尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄本，通過功能注釋，獲得花香物質(zhì)合成相關(guān)基因；搜索SSR 位點并分析其組成特點，初步驗證了SSR 標(biāo)記的有效性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】針對尾葉紫薇花香物質(zhì)合成相關(guān)基因，了解不全面及SSR 分子標(biāo)記數(shù)量有限的問題，為進(jìn)一步研究尾葉紫薇花香性狀、開展分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為國家花卉工程技術(shù)研究中心紫薇種質(zhì)資源圃（北京，小湯山）生長狀態(tài)良好的尾葉紫薇，于2019 年6 月采集現(xiàn)蕾期（花苞萼片開裂），盛開期（花瓣完全打開，肉眼可見花粉，柱頭分泌粘液），衰敗期（花藥脫落，花絲卷曲，花瓣收縮且萎蔫）的花朵（圖1），單獨標(biāo)記后，迅速放入液氮中，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

圖1 尾葉紫薇三個時期花朵Fig.1 Three period flowers of L.caudata

1.2 文庫構(gòu)建與測序

使用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒（北京天根，DP441）提取3 個時期花朵RNA，10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop2000 分光光度計檢測總RNA的完整性、純度及質(zhì)量，選取條帶清晰，無降解，純度高的3 個不同時期的RNA 樣品，等物質(zhì)的量混合。全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫及隨后的測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，測序平臺是PacBio sequel，采用IsoSeq3（v3.2.2）軟件進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄本分析，獲得去冗余的基因序列。

1.3 基因功能注釋

利用NCBI Blast（v2.2.28+）、HMMER（v3.0）、KAAS和Blast2GO（v2.5）軟件，對獲得的尾葉紫薇去冗余序列進(jìn)行7大數(shù)據(jù)庫的基因功能注釋，包括Nr（NCBI non-redundant protein sequences，e-value=1e-5）、Nt（NCBI nucleotide sequences，e-value=1e-5）、Pfam（protein family，e-value=0.01）、KOG/COG（clusters of orthologous groups of protein/eukaryotic ortholog groups，e-value=1e-3）、Swiss-Prot（a manually annotated and reviewed protein sequence database，e-value=1e-5）、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes，e-value=1e-10）、GO（gene ontology，e-value=1e-6）[13-17]。

1.4 微衛(wèi)星序列（SSR）的搜索

利用MISA 軟件（MIcroSAtellite identification tool）[18]對基因序列中的SSR 位點進(jìn)行搜索，參數(shù)設(shè)置如下：1-6 核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5，復(fù)合SSR 的最大間隔堿基數(shù)為100 bp，統(tǒng)計并分析SSR分布頻率及特征。

1.5 SSR分子標(biāo)記引物開發(fā)與檢測

用Primer3[19]設(shè)計引物，引物條件如下：預(yù)期產(chǎn)物大小在100～300 bp，引物長度18～24 bp，GC 含量在40%～60%，退火溫度在57～63 ℃，上下游引物的退火溫度差不大于2 ℃；避免引物出現(xiàn)二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等。

隨機(jī)選取設(shè)計好的52 對引物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。用天根DNA 提取試劑盒（DP305）提取尾葉紫薇DNA，PCR 體系如下：10 μL 2×TaqPCR mix，8 μL 無菌水，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL。94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸18 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組序列長度分布

對尾葉紫薇3 個時期的花朵混樣cDNA 文庫測序，獲得39 087 條非冗余、高質(zhì)量全長轉(zhuǎn)錄本即unigene。全長轉(zhuǎn)錄本總長度為82 416.42 kb，其中最短unigene有52 bp，最長unigene有12 199 bp，平均長度為2 109 bp，長度中位數(shù)為1 982 bp，N50 長度為2 427 bp，N90 長度為1 363 bp，長度主要分布在500～4 000 bp（圖2）。

圖2 尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組序列長度分布Fig.2 Length distribution of the full-length transcriptome of L.caudata

2.2 全長轉(zhuǎn)錄組序列的功能注釋

為了全面了解尾葉紫薇Unigene 的功能信息，利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源檢索比對，并基于匹配結(jié)果進(jìn)行功能注釋，結(jié)果表明，共有38 559 條序列獲得注釋，占總序列數(shù)量的98.64%，有8 387 條序列在所有數(shù)據(jù)庫中都得到了注釋。其中，在Nr 庫注釋成功的序列數(shù)最多，有36 857 條，占總序列數(shù)的94.29%，在KOG 數(shù)據(jù)庫獲得注釋的序列數(shù)最少，有14 312 條，占比36.61%（表1）。

表1 尾葉紫薇Unigenes在公共數(shù)據(jù)庫中的注釋統(tǒng)計Tab.1 Annotation statistics of L.caudata unigenes in public databases

2.2.1 Nr 功能注釋 從Nr數(shù)據(jù)庫獲得注釋的結(jié)果看，尾葉紫薇在236個物種中得到了注釋，其中，注釋到的物種主要有同為桃金娘目的石榴（Punica granatum）（28 895，78.4%）、大桉（Eucalyptus grandis）（2 499，6.78%）、歐洲栓皮櫟（Quercus suber）（345，0.94%）、葡萄（Vitis vinifera）（301，0.82%）、可可（Theobroma cacao）（277，0.75%）、木薯（Manihot esculenta）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）（262，0.71%）、胡桃（Juglans regia）（255，0.69%）等。在獲得注釋的Unigene中，8.8%的序列相似度在95%～100%，64.4%的序列相似度在80%～95%，25.8%的序列相似度在60%～80%?？梢娢踩~紫薇主要從親緣關(guān)系相對較近的同為桃金娘目的石榴和大桉中獲得注釋，超過70%的Unigene匹配到了相似性較高（＞80%）的序列。

2.2.2 GO 功能注釋 共有31 577 條unigene 序列在GO 數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，可被分為3 大類，包括細(xì)胞組分、分子功能及生物學(xué)過程共53 個功能組。細(xì)胞組分中有17 個功能組52 731 條序列，分子功能的有13 個功能組42 731 條序列，生物學(xué)過程的有23 個功能組86 353 條序列。在細(xì)胞組分中，被注釋到細(xì)胞部分和細(xì)胞的最多，各有9 624 條序列，僅1 條序列被注釋到突觸或突觸部分。在分子功能中，以結(jié)合能力（19 265）和催化活性（16 979）相關(guān)基因為主，受體調(diào)節(jié)活性（15）和金屬伴侶活性（3）相關(guān)基因很少。生物學(xué)過程組分中，較多基因參與到了細(xì)胞進(jìn)程（19 682）和代謝進(jìn)程（18 458），而參與細(xì)胞殺傷（24）或節(jié)律進(jìn)程（15）相關(guān)的基因較少，其他功能組情況見圖3。

圖3 尾葉紫薇GO分類Fig.3 GO functional categories of L.caudata

2.2.3 KOG 注釋分類 在KOG 數(shù)據(jù)庫中，共有14 312 個基因經(jīng)同源基因匹配獲得功能注釋，可被歸至25 個功能大類（圖4）。其中，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和分子伴侶相關(guān)基因（2 000）最多，其次是一般功能預(yù)測（1 873），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生（1 302），細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸（1 174），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（1 170），涉及核結(jié)構(gòu)（77），防御機(jī)制（45），細(xì)胞運(yùn)動（10）和胞外結(jié)構(gòu)（8）的基因則較少。

圖4 尾葉紫薇的KOG分類Fig.4 KOG functional categories of L.caudata

2.2.4 代謝通路分析 根據(jù)KEGG注釋結(jié)果（表2），18 538條序列注釋成功，可歸類至5大代謝通路19條代謝途徑。5大代謝通路中以代謝相關(guān)的途徑（10 011）最多，共有11條與代謝相關(guān)的途徑，其中碳水化合物代謝途徑相關(guān)的最多，達(dá)2 492 個基因，在所有代謝通路中也是最多的。與遺傳信息處理通路相關(guān)的有4條代謝途徑，以轉(zhuǎn)運(yùn)（1 531）和折疊、分類和降解（1 301）途徑為主。環(huán)境信息處理通路上僅有2條代謝通路，膜運(yùn)輸代謝途徑相關(guān)基因（50）最少。涉及尾葉紫薇花香物質(zhì)合成的相關(guān)代謝通路中，有344個基因注釋到類異戊二烯生物合成相關(guān)途徑，其中注釋到萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵的萜烯合酶基因有56個，萜類化合物骨架生物合成相關(guān)基因148 個；有520 個注釋到苯類/苯丙烷類物質(zhì)合成代謝途徑，其中苯丙烷生物合成基因有283 個；有922 個基因注釋到脂肪酸衍生物合成代謝途徑，涉及脂肪酸和不飽和脂肪酸生物合成的基因有235個（表3）。

表2 尾葉紫薇Unigene的KEGG分類Tab.2 KEGG functional categories of L.caudata unigene

表3 尾葉紫薇花香物質(zhì)合成相關(guān)基因Tab.3 Biosynthesis of floral scent in L.caudata

2.3 尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組中SSR位點分布特征分析

在全長轉(zhuǎn)錄組39 087個去冗余的Unigene中，搜索發(fā)現(xiàn)有16 425個SSR位點，這些位點分布在12 060條序列中，出現(xiàn)頻率為42.02%，即30.85%的序列含有SSR 位點，平均每5.02 kb 出現(xiàn)1 個SSR 序列，復(fù)合型SSR數(shù)量1 766個，有3 141條序列含有1個以上的SSR位點。

2.3.1 尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組中SSR 重復(fù)類型 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)所得的16 425 個SSR 位點中，單核苷酸重復(fù)到六核苷酸重復(fù)的基元類型均有出現(xiàn)（表4）。其中分布最多的為二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)，分別占所有SSR 位點的41.95%和31.58%，出現(xiàn)頻率分別為17.63%和13.27%；其次為單核苷酸重復(fù)類型，所占比例為23.33%，出現(xiàn)頻率為9.80%；重復(fù)類型最少的是五核苷酸，僅占0.48%，出現(xiàn)頻率為0.20%。從平均分布距離看，尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組中，二核苷酸的SSR位點平均分布距離最近，平均每11.96 kb出現(xiàn)一個二核苷酸重復(fù)類型的SSR 位點，五核苷酸的SSR 位點平均分布距離最遠(yuǎn)，平均每1 043.25 kb出現(xiàn)一個五核苷酸重復(fù)類型的SSR位點。

表4 尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型的分布特征Tab.4 Distribution characteristics of SSR repeat type in full-length transcriptome of L.caudata

2.3.2 尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)基序類型 尾葉紫薇SSR 位點共包含93 種重復(fù)基元，單核苷酸到六核苷酸重復(fù)的基序類型分別為2種、4種、10種、25種、20種和32種。各個核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)頻率最高的分別是：（A/T）n、（AG/CT）n、（AGG/CCT）n、（AAGG/CCTT）n、（ACAGT/ACTGT）n、（AGAGGG/CCCTCT）n，在各自重復(fù)基元類型中所占比例分別為96.03%、83.63%、27.51%、15.34%、18.99%、16.33%。在93 種重復(fù)基元中，（AG/CT）n的出現(xiàn)頻率最高，占總SSR 總數(shù)的35.08%，其次是（A/T）n占比22.40%、（AGG/CCT）n占比8.69%、（AAG/CTT）n占比7.70%、（AGC/CTG）n占比6.32%。

2.3.3 尾葉紫薇SSR 位點重復(fù)次數(shù)及長度分布 SSR 多態(tài)性與SSR 序列長度緊密相關(guān)，而長度變化范圍又由SSR 的重復(fù)次數(shù)決定。尾葉紫薇各重復(fù)基序類型在不同重復(fù)次數(shù)存在明顯差異，重復(fù)次數(shù)主要分布在5～15 次（表5）。整體來看，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，各類型SSR 位點數(shù)均隨之減少。重復(fù)次數(shù)頻率最高的是重復(fù)6 次，共有3 173 個SSR 位點（19.32%），其次是重復(fù)5 次（2 874，17.50%）、重復(fù)10 次（2 108，12.83%）、重復(fù)7 次（2 012，12.25%），重復(fù)15 次以上的總計有747 個SSR 位點，占總SSR 數(shù)量的4.55%。

表5 尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)分布Tab.5 Distribution of SSR repeat frequency in full-length transcriptome of L.caudata

尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組中SSR 長度分布在10～86 bp，平均長度為16.84 bp。不同重復(fù)類型的尾葉紫薇SSR 位點平均分布距離差異較大，平均長度差異也較大，單核苷酸重復(fù)類型最短，平均長度僅12.08 bp，六核苷酸重復(fù)類型最長，平均長度可達(dá)31.65 bp，二核苷酸到五核苷酸重復(fù)類型的SSR 平均長度分別為17.97，18.07，22.10，27.47 bp。SSR長度大于或等于20 bp的有4 247個，占比25.86%，12～19 bp的有9 967個，占比60.68%，小于12 bp的有2 211個，占比13.46%。

2.4 尾葉紫薇SSR引物設(shè)計與檢測

利用Primer 3對含有SSR 位點的Unigene進(jìn)行引物設(shè)計，為11 581個SSR位點成功設(shè)計引物，預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物以二核苷酸（32.54%）和三核苷酸（32.61%）為主隨機(jī)選取52 對引物并以尾葉紫薇DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，有40 對引物（表6）能產(chǎn)生與目的片段大小相同、單一、清晰的條帶，有效擴(kuò)增率為76.92%（圖5），其中成功擴(kuò)增出目的條帶的PB.19288.1是尾葉紫薇中涉及花香物質(zhì)合成的萜烯合酶基因。

表6 尾葉紫薇SSR引物序列Tab.6 SSR primer sequences of L.caudata

圖5 尾葉紫薇SSR引物PCR擴(kuò)增電泳Fig.5 PCR amplification electropherogram of L.caudata SSR primer

3 結(jié)論與討論

隨著測序技術(shù)的進(jìn)步及成本的降低，三代測序技術(shù)的測序讀長較二代測序技術(shù)更長，使遺傳背景復(fù)雜并缺乏基因組信息的園林植物快速開展分子生物學(xué)相關(guān)研究成為可能。本研究基于SMRT 技術(shù)對尾葉紫薇花朵測序獲得39 087 條非冗余、高質(zhì)量全長轉(zhuǎn)錄本，平均長度（2 109 bp）、N50（2 427 bp）、N90（1 363 bp）均優(yōu)于尾葉紫薇二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（1 634 bp，2 249 bp，827 bp）[2]，對尾葉紫薇基因全長克隆，功能基因的研究及分子標(biāo)記開發(fā)提供更為全面的數(shù)據(jù)。

在無參考基因組的情況下，尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組Unigene 共有38 559 條序列在7 大數(shù)據(jù)庫獲得功能注釋，占總序列數(shù)量的98.64%，功能主要注釋在細(xì)胞進(jìn)程及代謝進(jìn)程。植物揮發(fā)性成分主要可分為萜類、苯/苯丙素類和脂肪酸衍生物3 大類，已有研究發(fā)現(xiàn)尾葉紫薇花揮發(fā)性成分主要為脂肪醇類及萜類[2]。在尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組中，揮發(fā)性物質(zhì)合成代謝通路相關(guān)基因達(dá)1 876 個，注釋獲得參與萜類骨架生物合成基因、萜烯合酶基因及脂肪酸衍生物代謝通路基因等，可為進(jìn)一步探究尾葉紫薇香氣釋放分子機(jī)制提供參考。

檢索尾葉紫薇全長轉(zhuǎn)錄組Unigene 發(fā)現(xiàn)了16 425 個SSR 位點，SSR 的出現(xiàn)頻率為42.02%，發(fā)生頻率為30.85%。發(fā)生頻率高于紫薇的17.32%[20]、紫薇‘金幌’的20.03%[21]、蠟梅的12.35%[22]、山茶的19.52%[23]。搜索序列總長度為82 416.42 bp，平均每5.02 kb 出現(xiàn)1 個SSR 序列，即分布密度為1/5.02 kb，與木本植物分布距離相比，高于紫薇的1/5.11 kb[20]、牡丹的1/9.24 kb[24]、三角梅‘小葉紫’的1/11.99 kb[25]，低于大花四照花1/2.88 kb[26]、枇杷花1/4.87 kb[27]，可見尾葉紫薇SSR位點數(shù)量較多，分布較為密集。

核苷酸重復(fù)類型是SSR 位點的重要特征之一，在對尾葉紫薇各類型SSR 重復(fù)類型統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，尾葉紫薇以二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)類型為主，二者之和占SSR總數(shù)量的73.53%，其中二核苷酸重復(fù)類型最具優(yōu)勢，這與紫薇[20-21]、短絲木犀[28]、長梗杜鵑[29]、油梨[30]、灰氈毛忍冬[31]的研究結(jié)果一致。在大多數(shù)的植物中，二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)是SSR 主要重復(fù)基序類型的現(xiàn)象較為常見，除了上述植物以二核苷酸重復(fù)為主外，桉樹[32]、棉花[33]、五蓮楊[34]等三核苷酸重復(fù)類型最多。這種物種不同出現(xiàn)重復(fù)基序數(shù)量不同的現(xiàn)象，與基因的差異表達(dá)、進(jìn)化程度或突變頻率有關(guān)[32,35]。

SSR 的多態(tài)性與其長度有緊密聯(lián)系，一般認(rèn)為12 bp 以下多態(tài)性低，12～19 bp 多態(tài)性中等，SSR 長度大于或等于20 bp時多態(tài)性較高[31]。尾葉紫薇高多態(tài)性的SSR 有4 247個，占比25.86%，中等多態(tài)性的有9 967個，占比60.68%，即尾葉紫薇SSR位點有86.54%，具中等及以上的多態(tài)性，具有良好的多態(tài)性潛能，在尾葉紫薇甚至紫薇屬植物分子標(biāo)記研究中應(yīng)用價值高。

成功為11 581個位點設(shè)計SSR引物，占比70.51%，隨機(jī)抽取合成的52對引物中，有40對引物能在尾葉紫薇中獲得目的條帶，有效擴(kuò)增率為76.92%，擴(kuò)增效率較高，初步驗證了1 對涉及尾葉紫薇花香物質(zhì)合成基因的SSR引物有效性，但開發(fā)出的SSR標(biāo)記在紫薇屬植物的通用性仍需進(jìn)一步研究。

研究結(jié)果為尾葉紫薇功能基因研究，SSR 標(biāo)記和尾葉紫薇遺傳背景提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，豐富了紫薇屬植物的分子標(biāo)記類型，為紫薇屬植物的分子研究，如紫薇屬植物的種質(zhì)資源開發(fā)與保護(hù)、遺傳多樣性分析、基因定位、分子標(biāo)記輔助香花育種、遺傳圖譜構(gòu)建等提供科學(xué)依據(jù)。