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        尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)

        2021-09-29 03:02:46吳宜靜張一鳴陸泓錦趙天祎蔡軍火潘會(huì)堂張啟翔
        關(guān)鍵詞:尾葉紫薇核苷酸

        章 寒,吳宜靜,張一鳴,續(xù) 言,陸泓錦,趙天祎,蔡 明*,張 曼,蔡軍火,潘會(huì)堂,張啟翔

        (1.北京林業(yè)大學(xué) 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室/園林環(huán)境教育部工程研究中心/林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/園林學(xué)院,北京 100083;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院,江西 南昌 330045)

        【研究意義】尾葉紫薇(Lagerstroemia caudata)原產(chǎn)中國(guó),屬千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬(Lagerstroemia),是該屬唯一被證明具有花香的物種,也是培育香花紫薇新品種的重要育種親本[1-2]。廣泛了解尾葉紫薇花香物質(zhì)合成相關(guān)基因并開發(fā)大量分子標(biāo)記,將為紫薇花香遺傳改良奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái),關(guān)于尾葉紫薇的研究已在雜交育種、遺傳多樣性、花香成分及釋香規(guī)律、香氣物質(zhì)生物合成與代謝等方面開展,但在分子生物學(xué)層面上的研究依舊不夠深入,缺乏對(duì)功能基因的系統(tǒng)了解[1-5]。而尾葉紫薇已有的二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),受限于讀長(zhǎng)短的技術(shù)問(wèn)題,部分轉(zhuǎn)錄本不能代表全長(zhǎng)cDNA,序列信息不夠全面。微衛(wèi)星序列又名簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR),是研究植物遺傳多樣性的重要分子標(biāo)記之一[6]。在尾葉紫薇微衛(wèi)星標(biāo)記相關(guān)報(bào)道里,研究者以尾葉紫薇為材料通過(guò)磁珠富集法開發(fā)了60 個(gè)尾葉紫薇SSR 分子標(biāo)記并獲得18 對(duì)多態(tài)性引物[7],以紫薇為材料得到在尾葉紫薇中通用的65 對(duì)多態(tài)性引物,并獲得6 個(gè)與葉片大小、地徑、株高性狀連鎖的SSR 位點(diǎn)[8-10]。目前與尾葉紫薇花香性狀連鎖的SSR 標(biāo)記尚未見(jiàn)報(bào)道,且數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足分子育種研究的需要。【本研究切入點(diǎn)】以單分子實(shí)時(shí)(single-molecule real-time,SMRT)測(cè)序技術(shù)為代表的第三代測(cè)序技術(shù),具有讀長(zhǎng)超長(zhǎng)、測(cè)序周期短、無(wú)需測(cè)序后組裝等特點(diǎn),在轉(zhuǎn)錄組de novo 方面有較大的應(yīng)用前景,如可快速獲得更為全面的基因序列信息等[11-12]。因此,本研究基于SMRT 測(cè)序技術(shù)獲得尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本,通過(guò)功能注釋,獲得花香物質(zhì)合成相關(guān)基因;搜索SSR 位點(diǎn)并分析其組成特點(diǎn),初步驗(yàn)證了SSR 標(biāo)記的有效性。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】針對(duì)尾葉紫薇花香物質(zhì)合成相關(guān)基因,了解不全面及SSR 分子標(biāo)記數(shù)量有限的問(wèn)題,為進(jìn)一步研究尾葉紫薇花香性狀、開展分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        試驗(yàn)材料為國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心紫薇種質(zhì)資源圃(北京,小湯山)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的尾葉紫薇,于2019 年6 月采集現(xiàn)蕾期(花苞萼片開裂),盛開期(花瓣完全打開,肉眼可見(jiàn)花粉,柱頭分泌粘液),衰敗期(花藥脫落,花絲卷曲,花瓣收縮且萎蔫)的花朵(圖1),單獨(dú)標(biāo)記后,迅速放入液氮中,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

        圖1 尾葉紫薇三個(gè)時(shí)期花朵Fig.1 Three period flowers of L.caudata

        1.2 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

        使用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒(北京天根,DP441)提取3 個(gè)時(shí)期花朵RNA,10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop2000 分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的完整性、純度及質(zhì)量,選取條帶清晰,無(wú)降解,純度高的3 個(gè)不同時(shí)期的RNA 樣品,等物質(zhì)的量混合。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)及隨后的測(cè)序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成,測(cè)序平臺(tái)是PacBio sequel,采用IsoSeq3(v3.2.2)軟件進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本分析,獲得去冗余的基因序列。

        1.3 基因功能注釋

        利用NCBI Blast(v2.2.28+)、HMMER(v3.0)、KAAS和Blast2GO(v2.5)軟件,對(duì)獲得的尾葉紫薇去冗余序列進(jìn)行7大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋,包括Nr(NCBI non-redundant protein sequences,e-value=1e-5)、Nt(NCBI nucleotide sequences,e-value=1e-5)、Pfam(protein family,e-value=0.01)、KOG/COG(clusters of orthologous groups of protein/eukaryotic ortholog groups,e-value=1e-3)、Swiss-Prot(a manually annotated and reviewed protein sequence database,e-value=1e-5)、KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes,e-value=1e-10)、GO(gene ontology,e-value=1e-6)[13-17]。

        1.4 微衛(wèi)星序列(SSR)的搜索

        利用MISA 軟件(MIcroSAtellite identification tool)[18]對(duì)基因序列中的SSR 位點(diǎn)進(jìn)行搜索,參數(shù)設(shè)置如下:1-6 核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5,復(fù)合SSR 的最大間隔堿基數(shù)為100 bp,統(tǒng)計(jì)并分析SSR分布頻率及特征。

        1.5 SSR分子標(biāo)記引物開發(fā)與檢測(cè)

        用Primer3[19]設(shè)計(jì)引物,引物條件如下:預(yù)期產(chǎn)物大小在100~300 bp,引物長(zhǎng)度18~24 bp,GC 含量在40%~60%,退火溫度在57~63 ℃,上下游引物的退火溫度差不大于2 ℃;避免引物出現(xiàn)二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等。

        隨機(jī)選取設(shè)計(jì)好的52 對(duì)引物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。用天根DNA 提取試劑盒(DP305)提取尾葉紫薇DNA,PCR 體系如下:10 μL 2×TaqPCR mix,8 μL 無(wú)菌水,上下游引物各0.5 μL,DNA模板1 μL。94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸18 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸5 min。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列長(zhǎng)度分布

        對(duì)尾葉紫薇3 個(gè)時(shí)期的花朵混樣cDNA 文庫(kù)測(cè)序,獲得39 087 條非冗余、高質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本即unigene。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本總長(zhǎng)度為82 416.42 kb,其中最短unigene有52 bp,最長(zhǎng)unigene有12 199 bp,平均長(zhǎng)度為2 109 bp,長(zhǎng)度中位數(shù)為1 982 bp,N50 長(zhǎng)度為2 427 bp,N90 長(zhǎng)度為1 363 bp,長(zhǎng)度主要分布在500~4 000 bp(圖2)。

        圖2 尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列長(zhǎng)度分布Fig.2 Length distribution of the full-length transcriptome of L.caudata

        2.2 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列的功能注釋

        為了全面了解尾葉紫薇Unigene 的功能信息,利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源檢索比對(duì),并基于匹配結(jié)果進(jìn)行功能注釋,結(jié)果表明,共有38 559 條序列獲得注釋,占總序列數(shù)量的98.64%,有8 387 條序列在所有數(shù)據(jù)庫(kù)中都得到了注釋。其中,在Nr 庫(kù)注釋成功的序列數(shù)最多,有36 857 條,占總序列數(shù)的94.29%,在KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得注釋的序列數(shù)最少,有14 312 條,占比36.61%(表1)。

        表1 尾葉紫薇Unigenes在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋統(tǒng)計(jì)Tab.1 Annotation statistics of L.caudata unigenes in public databases

        2.2.1 Nr 功能注釋 從Nr數(shù)據(jù)庫(kù)獲得注釋的結(jié)果看,尾葉紫薇在236個(gè)物種中得到了注釋,其中,注釋到的物種主要有同為桃金娘目的石榴(Punica granatum)(28 895,78.4%)、大桉(Eucalyptus grandis)(2 499,6.78%)、歐洲栓皮櫟(Quercus suber)(345,0.94%)、葡萄(Vitis vinifera)(301,0.82%)、可可(Theobroma cacao)(277,0.75%)、木薯(Manihot esculenta)、橡膠樹(Hevea brasiliensis)(262,0.71%)、胡桃(Juglans regia)(255,0.69%)等。在獲得注釋的Unigene中,8.8%的序列相似度在95%~100%,64.4%的序列相似度在80%~95%,25.8%的序列相似度在60%~80%。可見(jiàn)尾葉紫薇主要從親緣關(guān)系相對(duì)較近的同為桃金娘目的石榴和大桉中獲得注釋,超過(guò)70%的Unigene匹配到了相似性較高(>80%)的序列。

        2.2.2 GO 功能注釋 共有31 577 條unigene 序列在GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得注釋,可被分為3 大類,包括細(xì)胞組分、分子功能及生物學(xué)過(guò)程共53 個(gè)功能組。細(xì)胞組分中有17 個(gè)功能組52 731 條序列,分子功能的有13 個(gè)功能組42 731 條序列,生物學(xué)過(guò)程的有23 個(gè)功能組86 353 條序列。在細(xì)胞組分中,被注釋到細(xì)胞部分和細(xì)胞的最多,各有9 624 條序列,僅1 條序列被注釋到突觸或突觸部分。在分子功能中,以結(jié)合能力(19 265)和催化活性(16 979)相關(guān)基因?yàn)橹鳎荏w調(diào)節(jié)活性(15)和金屬伴侶活性(3)相關(guān)基因很少。生物學(xué)過(guò)程組分中,較多基因參與到了細(xì)胞進(jìn)程(19 682)和代謝進(jìn)程(18 458),而參與細(xì)胞殺傷(24)或節(jié)律進(jìn)程(15)相關(guān)的基因較少,其他功能組情況見(jiàn)圖3。

        圖3 尾葉紫薇GO分類Fig.3 GO functional categories of L.caudata

        2.2.3 KOG 注釋分類 在KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)中,共有14 312 個(gè)基因經(jīng)同源基因匹配獲得功能注釋,可被歸至25 個(gè)功能大類(圖4)。其中,翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和分子伴侶相關(guān)基因(2 000)最多,其次是一般功能預(yù)測(cè)(1 873),翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生(1 302),細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸(1 174),信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(1 170),涉及核結(jié)構(gòu)(77),防御機(jī)制(45),細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(10)和胞外結(jié)構(gòu)(8)的基因則較少。

        圖4 尾葉紫薇的KOG分類Fig.4 KOG functional categories of L.caudata

        2.2.4 代謝通路分析 根據(jù)KEGG注釋結(jié)果(表2),18 538條序列注釋成功,可歸類至5大代謝通路19條代謝途徑。5大代謝通路中以代謝相關(guān)的途徑(10 011)最多,共有11條與代謝相關(guān)的途徑,其中碳水化合物代謝途徑相關(guān)的最多,達(dá)2 492 個(gè)基因,在所有代謝通路中也是最多的。與遺傳信息處理通路相關(guān)的有4條代謝途徑,以轉(zhuǎn)運(yùn)(1 531)和折疊、分類和降解(1 301)途徑為主。環(huán)境信息處理通路上僅有2條代謝通路,膜運(yùn)輸代謝途徑相關(guān)基因(50)最少。涉及尾葉紫薇花香物質(zhì)合成的相關(guān)代謝通路中,有344個(gè)基因注釋到類異戊二烯生物合成相關(guān)途徑,其中注釋到萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵的萜烯合酶基因有56個(gè),萜類化合物骨架生物合成相關(guān)基因148 個(gè);有520 個(gè)注釋到苯類/苯丙烷類物質(zhì)合成代謝途徑,其中苯丙烷生物合成基因有283 個(gè);有922 個(gè)基因注釋到脂肪酸衍生物合成代謝途徑,涉及脂肪酸和不飽和脂肪酸生物合成的基因有235個(gè)(表3)。

        表2 尾葉紫薇Unigene的KEGG分類Tab.2 KEGG functional categories of L.caudata unigene

        表3 尾葉紫薇花香物質(zhì)合成相關(guān)基因Tab.3 Biosynthesis of floral scent in L.caudata

        2.3 尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)分布特征分析

        在全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組39 087個(gè)去冗余的Unigene中,搜索發(fā)現(xiàn)有16 425個(gè)SSR位點(diǎn),這些位點(diǎn)分布在12 060條序列中,出現(xiàn)頻率為42.02%,即30.85%的序列含有SSR 位點(diǎn),平均每5.02 kb 出現(xiàn)1 個(gè)SSR 序列,復(fù)合型SSR數(shù)量1 766個(gè),有3 141條序列含有1個(gè)以上的SSR位點(diǎn)。

        2.3.1 尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中SSR 重復(fù)類型 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)所得的16 425 個(gè)SSR 位點(diǎn)中,單核苷酸重復(fù)到六核苷酸重復(fù)的基元類型均有出現(xiàn)(表4)。其中分布最多的為二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù),分別占所有SSR 位點(diǎn)的41.95%和31.58%,出現(xiàn)頻率分別為17.63%和13.27%;其次為單核苷酸重復(fù)類型,所占比例為23.33%,出現(xiàn)頻率為9.80%;重復(fù)類型最少的是五核苷酸,僅占0.48%,出現(xiàn)頻率為0.20%。從平均分布距離看,尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中,二核苷酸的SSR位點(diǎn)平均分布距離最近,平均每11.96 kb出現(xiàn)一個(gè)二核苷酸重復(fù)類型的SSR 位點(diǎn),五核苷酸的SSR 位點(diǎn)平均分布距離最遠(yuǎn),平均每1 043.25 kb出現(xiàn)一個(gè)五核苷酸重復(fù)類型的SSR位點(diǎn)。

        表4 尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型的分布特征Tab.4 Distribution characteristics of SSR repeat type in full-length transcriptome of L.caudata

        2.3.2 尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)基序類型 尾葉紫薇SSR 位點(diǎn)共包含93 種重復(fù)基元,單核苷酸到六核苷酸重復(fù)的基序類型分別為2種、4種、10種、25種、20種和32種。各個(gè)核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)頻率最高的分別是:(A/T)n、(AG/CT)n、(AGG/CCT)n、(AAGG/CCTT)n、(ACAGT/ACTGT)n、(AGAGGG/CCCTCT)n,在各自重復(fù)基元類型中所占比例分別為96.03%、83.63%、27.51%、15.34%、18.99%、16.33%。在93 種重復(fù)基元中,(AG/CT)n的出現(xiàn)頻率最高,占總SSR 總數(shù)的35.08%,其次是(A/T)n占比22.40%、(AGG/CCT)n占比8.69%、(AAG/CTT)n占比7.70%、(AGC/CTG)n占比6.32%。

        2.3.3 尾葉紫薇SSR 位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)及長(zhǎng)度分布 SSR 多態(tài)性與SSR 序列長(zhǎng)度緊密相關(guān),而長(zhǎng)度變化范圍又由SSR 的重復(fù)次數(shù)決定。尾葉紫薇各重復(fù)基序類型在不同重復(fù)次數(shù)存在明顯差異,重復(fù)次數(shù)主要分布在5~15 次(表5)。整體來(lái)看,隨著重復(fù)次數(shù)的增加,各類型SSR 位點(diǎn)數(shù)均隨之減少。重復(fù)次數(shù)頻率最高的是重復(fù)6 次,共有3 173 個(gè)SSR 位點(diǎn)(19.32%),其次是重復(fù)5 次(2 874,17.50%)、重復(fù)10 次(2 108,12.83%)、重復(fù)7 次(2 012,12.25%),重復(fù)15 次以上的總計(jì)有747 個(gè)SSR 位點(diǎn),占總SSR 數(shù)量的4.55%。

        表5 尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)分布Tab.5 Distribution of SSR repeat frequency in full-length transcriptome of L.caudata

        尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中SSR 長(zhǎng)度分布在10~86 bp,平均長(zhǎng)度為16.84 bp。不同重復(fù)類型的尾葉紫薇SSR 位點(diǎn)平均分布距離差異較大,平均長(zhǎng)度差異也較大,單核苷酸重復(fù)類型最短,平均長(zhǎng)度僅12.08 bp,六核苷酸重復(fù)類型最長(zhǎng),平均長(zhǎng)度可達(dá)31.65 bp,二核苷酸到五核苷酸重復(fù)類型的SSR 平均長(zhǎng)度分別為17.97,18.07,22.10,27.47 bp。SSR長(zhǎng)度大于或等于20 bp的有4 247個(gè),占比25.86%,12~19 bp的有9 967個(gè),占比60.68%,小于12 bp的有2 211個(gè),占比13.46%。

        2.4 尾葉紫薇SSR引物設(shè)計(jì)與檢測(cè)

        利用Primer 3對(duì)含有SSR 位點(diǎn)的Unigene進(jìn)行引物設(shè)計(jì),為11 581個(gè)SSR位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)引物,預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物以二核苷酸(32.54%)和三核苷酸(32.61%)為主隨機(jī)選取52 對(duì)引物并以尾葉紫薇DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,檢測(cè)產(chǎn)物發(fā)現(xiàn),有40 對(duì)引物(表6)能產(chǎn)生與目的片段大小相同、單一、清晰的條帶,有效擴(kuò)增率為76.92%(圖5),其中成功擴(kuò)增出目的條帶的PB.19288.1是尾葉紫薇中涉及花香物質(zhì)合成的萜烯合酶基因。

        表6 尾葉紫薇SSR引物序列Tab.6 SSR primer sequences of L.caudata

        圖5 尾葉紫薇SSR引物PCR擴(kuò)增電泳Fig.5 PCR amplification electropherogram of L.caudata SSR primer

        3 結(jié)論與討論

        隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步及成本的降低,三代測(cè)序技術(shù)的測(cè)序讀長(zhǎng)較二代測(cè)序技術(shù)更長(zhǎng),使遺傳背景復(fù)雜并缺乏基因組信息的園林植物快速開展分子生物學(xué)相關(guān)研究成為可能。本研究基于SMRT 技術(shù)對(duì)尾葉紫薇花朵測(cè)序獲得39 087 條非冗余、高質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本,平均長(zhǎng)度(2 109 bp)、N50(2 427 bp)、N90(1 363 bp)均優(yōu)于尾葉紫薇二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(1 634 bp,2 249 bp,827 bp)[2],對(duì)尾葉紫薇基因全長(zhǎng)克隆,功能基因的研究及分子標(biāo)記開發(fā)提供更為全面的數(shù)據(jù)。

        在無(wú)參考基因組的情況下,尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組Unigene 共有38 559 條序列在7 大數(shù)據(jù)庫(kù)獲得功能注釋,占總序列數(shù)量的98.64%,功能主要注釋在細(xì)胞進(jìn)程及代謝進(jìn)程。植物揮發(fā)性成分主要可分為萜類、苯/苯丙素類和脂肪酸衍生物3 大類,已有研究發(fā)現(xiàn)尾葉紫薇花揮發(fā)性成分主要為脂肪醇類及萜類[2]。在尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組中,揮發(fā)性物質(zhì)合成代謝通路相關(guān)基因達(dá)1 876 個(gè),注釋獲得參與萜類骨架生物合成基因、萜烯合酶基因及脂肪酸衍生物代謝通路基因等,可為進(jìn)一步探究尾葉紫薇香氣釋放分子機(jī)制提供參考。

        檢索尾葉紫薇全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組Unigene 發(fā)現(xiàn)了16 425 個(gè)SSR 位點(diǎn),SSR 的出現(xiàn)頻率為42.02%,發(fā)生頻率為30.85%。發(fā)生頻率高于紫薇的17.32%[20]、紫薇‘金幌’的20.03%[21]、蠟梅的12.35%[22]、山茶的19.52%[23]。搜索序列總長(zhǎng)度為82 416.42 bp,平均每5.02 kb 出現(xiàn)1 個(gè)SSR 序列,即分布密度為1/5.02 kb,與木本植物分布距離相比,高于紫薇的1/5.11 kb[20]、牡丹的1/9.24 kb[24]、三角梅‘小葉紫’的1/11.99 kb[25],低于大花四照花1/2.88 kb[26]、枇杷花1/4.87 kb[27],可見(jiàn)尾葉紫薇SSR位點(diǎn)數(shù)量較多,分布較為密集。

        核苷酸重復(fù)類型是SSR 位點(diǎn)的重要特征之一,在對(duì)尾葉紫薇各類型SSR 重復(fù)類型統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),尾葉紫薇以二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)類型為主,二者之和占SSR總數(shù)量的73.53%,其中二核苷酸重復(fù)類型最具優(yōu)勢(shì),這與紫薇[20-21]、短絲木犀[28]、長(zhǎng)梗杜鵑[29]、油梨[30]、灰氈毛忍冬[31]的研究結(jié)果一致。在大多數(shù)的植物中,二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)是SSR 主要重復(fù)基序類型的現(xiàn)象較為常見(jiàn),除了上述植物以二核苷酸重復(fù)為主外,桉樹[32]、棉花[33]、五蓮楊[34]等三核苷酸重復(fù)類型最多。這種物種不同出現(xiàn)重復(fù)基序數(shù)量不同的現(xiàn)象,與基因的差異表達(dá)、進(jìn)化程度或突變頻率有關(guān)[32,35]。

        SSR 的多態(tài)性與其長(zhǎng)度有緊密聯(lián)系,一般認(rèn)為12 bp 以下多態(tài)性低,12~19 bp 多態(tài)性中等,SSR 長(zhǎng)度大于或等于20 bp時(shí)多態(tài)性較高[31]。尾葉紫薇高多態(tài)性的SSR 有4 247個(gè),占比25.86%,中等多態(tài)性的有9 967個(gè),占比60.68%,即尾葉紫薇SSR位點(diǎn)有86.54%,具中等及以上的多態(tài)性,具有良好的多態(tài)性潛能,在尾葉紫薇甚至紫薇屬植物分子標(biāo)記研究中應(yīng)用價(jià)值高。

        成功為11 581個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)SSR引物,占比70.51%,隨機(jī)抽取合成的52對(duì)引物中,有40對(duì)引物能在尾葉紫薇中獲得目的條帶,有效擴(kuò)增率為76.92%,擴(kuò)增效率較高,初步驗(yàn)證了1 對(duì)涉及尾葉紫薇花香物質(zhì)合成基因的SSR引物有效性,但開發(fā)出的SSR標(biāo)記在紫薇屬植物的通用性仍需進(jìn)一步研究。

        研究結(jié)果為尾葉紫薇功能基因研究,SSR 標(biāo)記和尾葉紫薇遺傳背景提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),豐富了紫薇屬植物的分子標(biāo)記類型,為紫薇屬植物的分子研究,如紫薇屬植物的種質(zhì)資源開發(fā)與保護(hù)、遺傳多樣性分析、基因定位、分子標(biāo)記輔助香花育種、遺傳圖譜構(gòu)建等提供科學(xué)依據(jù)。

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