張建紅，李 瑤，石金鳳，溫正軍

（北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 102300）

煤工塵肺是我國最常見的職業(yè)病，隨著病情的發(fā)展，癥狀會越來越嚴(yán)重，部分患者還會出現(xiàn)呼吸減弱、呼吸困難等癥狀。研究認(rèn)為，煤工塵肺并發(fā)肺腺癌的風(fēng)險更高，對患者的身心健康造成嚴(yán)重的影響，且煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者臨床癥狀容易被原發(fā)病掩蓋，導(dǎo)致治療難度增加[1]。目前，化療是治療煤工塵肺合并晚期肺腺癌主要手段之一，而其對患者的身體狀況具有較高的要求，且經(jīng)常伴有不良反應(yīng)。分子靶向藥物是在細(xì)胞分子水平上，針對已經(jīng)明確的致癌位點(diǎn)，來設(shè)計相應(yīng)的治療藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)會特異性地選擇致癌點(diǎn)來結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡。近年來，研究發(fā)現(xiàn)分子靶向藥物特異性高、不良反應(yīng)小，對多種惡性腫瘤具有顯著療效[2]。本研究旨在探討煤工塵肺合并晚期肺腺癌驅(qū)動基因突變，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，為患者靶向治療方案提供參照，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院2014年1月至2020年1月救治的70例煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者，并開展前瞻性研究?；颊呔鶠槟行?，年齡44～91歲，平均（71.43±10.89）歲；接塵時間4～35年，平均（20.87±7.40）年；無吸煙史9例，吸煙史61例；塵肺期別[3]：Ⅰ期15例，Ⅱ期50例，Ⅲ期5例；分化程度：低分化24例，中分化28例，高分化18例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥ 18歲者；既往經(jīng)職業(yè)病鑒定機(jī)構(gòu)診斷為煤工塵肺者；經(jīng)病理確診為原發(fā)性肺腺癌者；配合完善基因檢測者。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不全者；合并心、腎等重要器官損傷者；中途退出者。本研究已經(jīng)院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 組織DNA和RNA的提取 用刀片切取3張5 μm厚患者的石蠟包埋肺組織樣本，放置1.5 mL EP管內(nèi)，二甲苯脫蠟后，用甲醇固定包埋組織樣本，并提取DNA與細(xì)胞總RNA，DNA和RNA分離后，用Nanodrop 2 000測定DNA和RNA的濃度。

1.2.2 蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）熒光定量PCR法 應(yīng)用廈門艾德生物公司生產(chǎn)的測試試劑盒，依照試劑盒說明書操作。PCR反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，1個循環(huán)為第一階段；95 ℃ 25 s，64 ℃ 、72 ℃各 20 s，10 個循環(huán)為第二階段；93 ℃ 25 s，60 ℃、72 ℃各 20 s，36 個循環(huán)為第三階段。均于第三階段60 ℃時提取FAM與HEX信號，執(zhí)行PCR。

1.2.3 二代測序技術(shù)（NGS） 應(yīng)用艾德生物公司的人類癌癥多基因突變與檢測試劑盒聯(lián)合，依照試劑盒說明書操作。陽性判定值[4]：平均原始深度＞10 000×，平均有效深度＞ 500×，突變比例不低于0.4%，突變絕對拷貝數(shù)不低于2，鏈平衡性介于0.1～10之間，同時滿足以上條件時為陽性（基因突變）；沒有發(fā)生基因突變的為陰性。

1.3 觀察指標(biāo) 整理全部患者的病例資料，包括平均年齡、吸煙史、平均接塵時間、塵肺期別、分化程度等。①分析EGFR基因突變與臨床、病理特征的關(guān)系。②分析KRAS基因突變與臨床、病理特征的關(guān)系。③分析TP53基因突變與臨床、病理特征的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以[ 例(%)]表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變與臨床、病理特征的分析 70例患者中，EGFR基因突變率為11.43%(8/70)。陽性與陰性組患者平均年齡、接塵時間、塵肺級別、分化程度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05)；陽性組無吸煙的患者占比顯著高于陰性組，吸煙的患者占比顯著低于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 KRAS基因突變與臨床、病理特征的分析 KRAS基因突變率為21.43%（15/70）。陽性與陰性組患者平均年齡、吸煙、接塵時間、塵肺級別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05)；陽性組低分化程度的患者占比顯著高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 KRAS基因突變與臨床、病理特征的關(guān)系

2.3 TP53基因突變與臨床、病理特征的分析 TP53基因突變率為48.57%（34/70）。陽性與陰性組患者平均年齡、吸煙、平均接塵時間、塵肺期別、分化程度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05)，見表3。

表3 TP53基因突變與臨床、病理特征的關(guān)系

3 討論

煤工塵肺是嚴(yán)重危害煤礦工人健康的一種職業(yè)病，容易與多種并發(fā)癥同時發(fā)生，其中合并肺腺癌死亡率較高。近年來有報道，煤工塵肺患者合并肺腺癌的發(fā)生率明顯高于普通人群，嚴(yán)重威脅患者生命健康與生活質(zhì)量，化療為其常用治療方法，但臨床效果欠佳。分子靶向藥物利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間分子生物學(xué)上的差異（包括基因、酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同特性），抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖，最后使其死亡，相比于目前的化療更加有效，不良反應(yīng)少，屬于一種更為安全的腫瘤治療方法[5]。因此，探討煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者肺癌驅(qū)動基因突變與臨床病理特征之間的關(guān)系，對后期臨床治療意義重大。

本研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變的陽性率達(dá)11.43%，且主要集中在21外顯子L858R、19外顯子缺失。針對EGFR基因突變的靶向治療是晚期肺腺癌最重要的治療之一，只有EGFR基因突變的患者才能從靶向治療中獲益，因此，進(jìn)一步證明了煤工塵肺合并晚期肺腺癌靶向治療具有較高的難度[6]。本研究中煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者EGFR 基因突變的陽性率較低，可能與塵肺病一定程度抑制EGFR的突變有關(guān)。本研究對驅(qū)動基因突變與臨床病理特征的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變在平均年齡、塵肺級別、組織學(xué)類型、分化程度上，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，在吸煙上差異有統(tǒng)計學(xué)意義。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變與性別、吸煙情況存在顯著相關(guān)關(guān)系，而與年齡無顯著相關(guān)，且EGFR基因突變后的病理分析主要為腺泡型，其次為貼壁型[7]。還有研究人員進(jìn)一步對EGFR基因突變的病例標(biāo)本進(jìn)行檢測，EGFR不同位點(diǎn)的突變其病理類型也有不同，例如19外顯子突變在乳頭型中較高，其次為貼壁型；而21外顯子突變?yōu)橘N壁型中較高，其次為乳頭型和實體型[8]。對于肺腺癌亞型與EGFR基因突變之間的關(guān)系在不同研究結(jié)果中并不一致，但是能肯定是EGFR基因的突變與病理類型之間仍存在一定聯(lián)系。

KRAS基因突變多見于肺腺癌，鱗癌較少見，本研究中，KRAS基因突變率為21.43%,高于既往研究[9]報道。而KRAS基因突變在患者的分化程度上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明KRAS基因突變與低級別腺瘤向高級別腺瘤、癌變的多步驟演變過程相關(guān)。有研究報道，KRAS基因突變在男性患者中的突變率顯著高于女性，在腺癌中的突變率顯著高于非腺癌,在吸煙患者中的突變率顯著高于不吸煙者，EGFR、KRAS突變與患者年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性[10]。這與本研究具有一定的差異，分析原因可能是基因的檢測方法不同導(dǎo)致陽性率有偏差，而且陽性樣本量普遍偏少致使結(jié)論不一。

TP53是一種抑癌基因，發(fā)生突變后，逐漸喪失對細(xì)胞生長、凋亡及 DNA 的修復(fù)能力，可由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榇侔┗颍绊懟颊叩纳嫫?，為常見突變，存在于近乎或者超過一半的非小細(xì)胞肺癌患者中，本研究結(jié)果顯示，TP53基因突變率為48.57%，研究顯示，TP53是目前已知人類腫瘤中突變率最高的基因，當(dāng)TP53基因發(fā)生突變時，所表達(dá)的突變的P53蛋白喪失了正常功能[11]。喪失功能的P53蛋白會加速腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，同時為腫瘤的侵襲及其轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。分析TP53患者基因突變情況與其臨床病理特征結(jié)果對比，TP53突變在年齡、吸煙、接塵時間、塵肺級別、分化程度上，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究報道，TP53突變與年齡具有顯著性差異，而與性別、TNM分期、吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、取材部位及腫瘤分化程度無顯著相關(guān)性[12]。這與本研究結(jié)果類似，年齡具有一定差異的原因可能是該研究納入樣本量較少，與研究報道中的年齡選取存在一定差異性。

綜上，煤工塵肺合并晚期肺腺癌患者肺癌驅(qū)動基因突變與臨床病理特征之間的關(guān)系密切，吸煙和癌細(xì)胞分化程度與驅(qū)動基因陽性突變率有著密切聯(lián)系。然而本研究的不足之處在于患者入組病例數(shù)量少，可能導(dǎo)致結(jié)論存在偏倚。