遲鵬 郝慶 姚艷春 孫玉蘭 許德穎 王嘉怡

摘要 目的：研究胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼通過miR-4319對結直腸癌細胞HT-29凋亡和上皮細胞間質轉化（EMT）的影響。方法：將結直腸癌細胞HT-29分成6組，分別為對照組、曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組、聯合組、miR-NC抑制組、miR-4319抑制組，n=9。采用CCK-8實驗檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western Blotting法檢測Vimentin、E-cadherin、Bax、C-Caspase-3蛋白表達，qRT-PCR檢測miR-4319表達。比較6個組的檢測結果。結果：與對照組比較，曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組、聯合組的細胞成活率和Vimentin的表達均減少（均P<0.05），而凋亡率和Bax、C-Caspase-3、E-cadherin的表達均增加（均P<0.05）;與miR-NC抑制組比較，miR-4319抑制組的細胞成活率、Vimentin的表達均顯著增加（均P<0.05），細胞凋亡率和Bax、C-Caspase-3、E-cadherin蛋白表達卻顯著減少（均P<0.05）;qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組細胞中miR-4319的表達增多（均P<0.05）。結論：胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼通過上調miR-4319誘導結直腸癌細胞HT-29凋亡，并抑制細胞EMT。

關鍵詞 胡黃連苷Ⅱ;曲美替尼;結直腸癌;miR-4319;增殖;凋亡;上皮間質轉化;HT-29細胞

Effects of Coprininoside Ⅱ Combined with Trametinib in HT-29 Cells Apoptosis and EMT

CHI Peng1，HAO Qing2，YAO Yanchun1，SUN Yulan1，XU Deying3，WANG Jiayi4

（1 Department of Gastroenterology，Anshan Central Hospital Liaoning Province，Anshan 114001，China; 2 Department of Digestive Medicine，Shengjing Hospita Affiliated to China Medical University，Shenyang 110000，China; 3 Radiotherapy Department of Panjin Central Hospital of Liaoning Province，Panjin 124010，China; 4 Xiangnan University，Chenzhou 423000，China）

Abstract Objective：To study the effects of cucurbitacin Ⅱ combined with trametinib on the colorectal cancer cells HT-29 apoptosis and epithelial-mesenchymal transition（EMT） through miR-4319.Methods：Colorectal cancer cells HT-29 were divided into 6 groups，namely the a control group，a trametinib group，a coprininoside II group，a combination group，an miR-NC inhibition group，and an miR-4319 inhibition group（n=9）.In 6 groups，CCK-8 experiment was used to detect cell proliferation，flow cytometry was used to detect cell apoptosis，Western blot was used to detect the protein expression of Vimentin，E-cadherin，Bax，and C-Caspase-3，and the expression of miR-4319 was detected by qRT-PCR.Compare the experimental results of the 6 groups.Results：Compared with the control group，the cell survival rate，and the expression of Vimentin in the trametinib group，the berberine Ⅱ group and the combination group were reduced（P<0.05），while the apoptosis rate and the expression of Bax，C-Caspase-3，E-cadherin both increased（P<0.05）; compared with the miR-NC inhibition group，the cell survival rate and Vimentin expression in the miR-4319 inhibition group were significantly increased（P<0.05）.However，the apoptosis rate，the expression of Bax，C-Caspase-3 and E-cadherin were significantly reduced（P<0.05）; qRT-PCR results showed that compared with the control group，the expression of miR-4319 in the cells of the trametinib group and berberineⅡgroup increased（P<0.05）.Conclusion：The combination of cucurbitacin Ⅱ and trametinib induces the apoptosis and inhibits cell EMT of colorectal cancer cells HT-29 by up-regulating miR-4319.

Keywords Cuberitin II; Trametinib; Colorectal cancer; miR-4319; Proliferation; Apoptosis; EMT; HT-29 cells

中圖分類號：R271.8文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.012

結直腸癌發(fā)病率和致死率極高，是世界范圍的公共衛(wèi)生問題[1-2]。曲美替尼是口服MEK1/2抑制劑，具有抑制腫瘤細胞增殖的作用。曲美替尼可體外誘導結直腸癌細胞凋亡并抑制細胞增殖[3]。胡黃連苷Ⅱ提取自玄參植物胡黃連根莖，具有抗氧化、預防肝損傷、改善腦損傷等功效[4]。有研究發(fā)現，胡黃連苷Ⅱ可誘導腎癌細胞凋亡，抑制乳腺癌細胞轉移，胡黃連苷Ⅱ可能是抗腫瘤藥物[5]。目前胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼對結直腸癌細胞的作用鮮有研究。miRNA在人體內普遍表達，參與腫瘤等疾病進展[6]?？鼓[瘤藥物抑制腫瘤惡性生長的機制與miRNA表達改變有關。我們前期的預實驗發(fā)現，胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼可提高結直腸癌細胞中miR-4319表達水平，胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼作用機制可能與miR-4319有關。既往文獻[7]顯示，miR-4319在結直腸癌中發(fā)揮類似抑癌基因的作用。本研究探討胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼調控miR-4319對結直腸癌細胞增殖、凋亡和上皮細胞間質轉化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）的影響，以期為胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼治療結直腸癌的臨床使用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人結直腸癌細胞HT-29購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

1.1.2 藥物 胡黃連苷Ⅱ（純度>98%，上海博湖生物科技有限公司，CAS No：39012-20-9）;曲美替尼（上海瀚香生物科技有限公司，CAS No：871700-17-3）。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清（Gibco公司，美國，貨號：16140063）;RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國，貨號：12633012）;0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，美國，貨號：SH30042.01）;兔抗Bax抗體（BioVision公司，美國，貨號：3032-100）;兔抗C-Caspase-3抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab2302）;兔抗Vimentin抗體（Thermo公司，美國，貨號：PA5-116538）;兔抗E-cadherin抗體（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：14472）;兔抗磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab245355）;miR-4319 inhibitor、inhibitor control，上海吉瑪制藥技術有限公司構建。CCK-8試劑盒（MedChemExpress公司，美國，貨號：HY-K0301）;流式細胞儀（BD公司，美國，LSRFortessa X-20型）;實時熒光定量PCR分析儀（博日科技股份有限公司，中國，LineGene Mini型）;酶標儀（Thermo公司，美國，MK3型）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8實驗[8]分析胡黃連苷Ⅱ對結直腸癌細胞增殖的影響

把結直腸癌細胞接種到96孔板中，細胞完全貼壁以后，更換成含有胡黃連苷Ⅱ為0、1、10、100 μg/mL的細胞培養(yǎng)液，每個濃度梯度3個復孔，常規(guī)方法培養(yǎng)48 h以后，在每個孔內添加10 μL的CCK-8，繼續(xù)孵育2 h。用酶標儀測定OD值，計算細胞成活率。細胞成活率=（對照組OD值/觀察組OD值）×100%。

1.2.2 分組與干預

將結直腸癌細胞分成對照組、曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組、聯合組、miR-NC抑制組、miR-4319抑制組6組。曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組細胞分別在實驗0 h時給予1 nmol/L的曲美替尼、1 μg/mL的胡黃連苷Ⅱ處理;聯合組、miR-NC抑制組、miR-4319抑制組均在實驗0 h時，給予1 nmol/L的曲美替尼和1 μg/mL的胡黃連苷Ⅱ聯合處理，同時miR-NC抑制組細胞在實驗開始前12 h，細胞轉染inhibitor control;miR-4319抑制組細胞在實驗開始前12 h，細胞轉染miR-4319 inhibitor;對照組常規(guī)培養(yǎng)，不做處理。細胞轉染根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行。對照組、曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組、聯合組、miR-NC抑制組、miR-4319抑制組細胞培養(yǎng)48 h后，CCK-8法檢測增殖（步驟同1.2.1），流式細胞術檢測凋亡，Western Blotting方法檢測蛋白表達，qRT-PCR方法檢測miR-4319表達。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術[9]檢測細胞凋亡 用PBS溶液懸浮細胞，1 000×g離心10 min。棄掉上清液，繼續(xù)添加Binding Buffer，吸取Annexin V-FITC和PI添加至細胞內，在室溫孵育15 min，立即用流式細胞儀測定。

1.2.4 Western Blotting方法[10]檢測蛋白表達 在細胞中加入RIPA，在冰上裂解30 min。11 000×g離心10 min，取上清液，經BCA方法測定蛋白濃度以后，與5×Loading Buffer混合煮沸5 min。分別在SDS-PAGE上樣孔內添加30 μg蛋白樣品，設置90 V的電壓電泳30 min，110 V電壓電泳2 h。在冰上，100 V電壓條件下轉膜2 h。經過5%脫脂奶粉封閉以后，放在一抗、二抗溶液中，室溫結合2 h。C-Caspase-3一抗按照1：800稀釋，Vimentin、E-cadherin、Bax一抗按照1∶1 000稀釋。二抗按照1∶2 000稀釋。ECL方法顯色，掃描條帶灰度值，以GAPDH作為參照，分析目的蛋白表達變化。目的蛋白表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶GAPDH灰度值。

1.2.5 qRT-PCR方法[11]檢測miR-4319表達 在細胞中添加Trizol，提取細胞總RNA，經過紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度以后，用cDNA合成試劑盒反轉錄。以SYBR Green熒光定量PCR試劑盒檢測miR-4319表達，內參為U6，根據2-△△Ct法計算miR-4319表達變化。miR-4319上游引物：5′-CACCCAGAGCAAAGCCAC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物5′-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件分析實驗數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組數據間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度胡黃連苷Ⅱ對結直腸癌細胞增殖的影響

1、10、100 μg/mL的胡黃連苷Ⅱ處理后的結直腸癌細胞成活率降低，與0 μg/mL比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼對結直腸癌細胞增殖和凋亡的影響

與對照組比較，曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組、聯合組結直腸癌細胞成活率降低，細胞凋亡率升高，細胞中Bax、C-Caspase-3蛋白表達增多（均P<0.05）。與聯合組比較，曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組結直腸癌細胞成活率偏高，細胞凋亡率偏低，細胞中Bax、C-Caspase-3蛋白表達較少（均P<0.05）。見圖1，表2。

2.3 胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼對結直腸癌細胞EMT的影響

與對照組比較，曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組、聯合組結直腸癌細胞中Vimentin蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高（均P<0.05）。與聯合組比較，曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組結直腸癌細胞中Vimentin蛋白表達水平升高，E-cadherin蛋白表達水平降低（均P<0.05）。見圖2，表3。

2.4 胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼對結直腸癌細胞中miR-4319表達的影響

與對照組比較，曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組、聯合組結直腸癌細胞中miR-4319表達水平升高（均P<0.05）。與聯合組比較，曲美替尼組、胡黃連苷Ⅱ組結直腸癌細胞miR-4319表達水平降低（均P<0.05）。見表4。

2.5 下調miR-4319對胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼作用下結直腸癌細胞凋亡和EMT的影響

與miR-NC抑制組比較，miR-4319抑制組結直腸癌細胞中miR-4319表達水平降低，細胞凋亡率降低，細胞成活率升高，細胞中Bax、C-Caspase-3、E-cadherin蛋白表達水平降低，Vimentin蛋白表達水平升高（均P<0.05）。見圖3，表5。

3 討論

直腸癌的發(fā)病是一個極為復雜的過程，基因、信號通路相互作用，共同影響腫瘤進展[12]。曲美替尼作為MEK1/2的抑制劑，其可降低結直腸癌細胞增殖能力，誘導細胞凋亡[3]。胡黃連是傳統中草藥，主要用于黃疸、痔瘡腫毒、陰虛骨蒸、吐血等的治療，胡黃連苷Ⅱ是胡黃連的主要活性成分之一，對腎缺血再灌注等有改善功效[13]。胡黃連苷Ⅱ還具有抗腫瘤作用，并且胡黃連苷Ⅱ還可誘導腎癌細胞凋亡[5-6]。本研究發(fā)現，胡黃連苷Ⅱ或曲美替尼抑制結直腸癌細胞增殖并促進細胞凋亡，并且二者聯合效果明顯優(yōu)于單純使用胡黃連苷Ⅱ或曲美替尼，胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼可能對結直腸癌的治療提供新的途徑。

細胞凋亡與細胞內多種基因的表達有關，這些基因之間相互作用共同影響細胞凋亡過程[14]。Bcl-2是與細胞凋亡有關的蛋白家族，其蛋白成員Bax促進細胞凋亡。C-Caspase-3是Caspase凋亡級聯反應中下游執(zhí)行因子Caspase-3的活化形式，其水平越高，細胞凋亡程度越高[15-16]。本研究發(fā)現，胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼可提高結直腸癌細胞中Bax、C-Caspase-3蛋白表達水平，說明胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼可能通過Bax/Caspase-3信號通路誘導結直腸癌細胞的凋亡。EMT是腫瘤細胞遷移和侵襲的早期標志，Vimentin、E-cadherin分別為間質細胞、上皮圖3 miR-4319 inhibitor對胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼影響結直腸癌細胞凋亡和細胞中Bax、C-Caspase-3、Vimentin、E-cadherin蛋白表達的作用? 注：A.以流式細胞術測定結直腸癌細胞凋亡;B.以Western Blotting方法檢測結直腸癌細胞中Bax、C-Caspase-3、Vimentin、E-cadherin蛋白表達細胞標志蛋白，二者表達改變與EMT水平有關[17-18]。本實驗發(fā)現，胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼降低結直腸癌細胞中Vimentin蛋白表達水平，提高E-cadherin蛋白表達水平，說明胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼可抑制結直腸癌細胞的EMT過程。

miRNA在人體內的作用廣泛，是指長度為20個核苷酸（nt）左右的小分子非編碼RNA，其可通過影響下游基因的表達調控細胞增殖、凋亡[19-20]。本實驗顯示，胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼提高了結直腸癌細胞中miR-4319表達量，胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼作用機制可能與miR-4319有關。miR-4319在結直腸癌中表達下調，并且miR-4319低表達與腫瘤患者預后不良有關，過表達miR-4319則明顯降低腫瘤細胞惡性程度[7]。有實驗發(fā)現，miR-4319可抑制甲狀腺癌EMT，miR-4319促進細胞中E-cadherin表達，miR-4319在體外能誘導非小細胞肺癌細胞凋亡[21-22]。我們以逆轉實驗進一步驗證了下調miR-4319可削弱胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼對結直腸癌細胞增殖、凋亡和EMT的作用，胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼可能通過調控miR-4319進而影響結直腸癌細胞凋亡和EMT。

總之，胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼可在體外抑制結直腸癌細胞EMT，促進細胞凋亡，機制與上調miR-4319有關。關于胡黃連苷Ⅱ聯合曲美替尼通過何種靶向機制影響miR-4319發(fā)揮作用還需進一步探討。本研究為直腸癌的臨床治療和深入的機制研究奠定了基礎。

參考文獻

[1]李勇敏，譚小寧，徐琳本，等.結直腸癌轉移模型裸鼠血管因子變化及健脾消癌方干預作用[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（6）：167-171.

[2]宋小平.芍藥湯加減聯合常規(guī)化療治療晚期結直腸癌的臨床觀察[J].中國民間療法，2020，28（8）：74-76.

[3]陳曉艷，龔一心，焦順昌.西妥昔單抗聯合曲美替尼對人結腸癌細胞增殖和凋亡的影響[J].解放軍醫(yī)學院學報，2019，40（6）：590-595.

[4]金誠，吳飛，鄭曉，等.胡黃連的化學成分和質量分析及藥理作用研究進展[J].中國新藥雜志，2019，28（3）：292-302.

[5]張璐，胡瑩.胡黃連苷Ⅱ通過線粒體途徑誘導腎癌細胞凋亡的實驗研究[J].臨床腎臟病雜志，2020，20（6）：504-507.

[6]金浩，余佳，王梓瑜，等.槐角黃酮通過調控LncRNA FBXL19-AS1/miR-342-3p通路抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的機制研究[J].中國中藥雜志，2020，45（18）：4440-4447.

[7]Huang L，Zhang Y，Li Z，et al.MiR-4319 suppresses colorectal cancer progression by targeting ABTB1[J].United European Gastroenterol J，2019，7（4）：517-528.

[8]馮文杏，周小舟，韓志毅，等.芪術抗癌方對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響[J].世界中醫(yī)藥，2020，15（11）：1590-1592.

[9]高萌，呼群，李超.過表達富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白對非小細胞肺癌細胞白蛋白結合型紫杉醇敏感性的影響[J].中國醫(yī)藥，2020，15（2）：221-225.

[10]史雪聰，趙熠，羅偉民.miR-29a對口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響[J].中國臨床藥理學雜志，2021，37（3）：270-274.

[11]張夢，何曼，孫強，等.基于Hedgehog信號通路的熊果酸誘導結直腸癌SW480細胞凋亡的機制研究[J].中草藥，2021，52（8）：2365-2373.

[12]韓凱，王鳳偉，潘志忠，等.結直腸癌肝轉移的分子機制研究進展[J].結直腸肛門外科，2019，25（4）：390-393，405.

[13]胡士英，李小平，韓婷婷，等.穴位貼敷聯合手法按摩對結直腸癌患者失眠的干預效果[J].中國醫(yī)藥，2020，15（8）：1263-1265.

[14]池碧霞，王娟，白準，等.莪術醇對結直腸癌細胞裸鼠移植瘤生長及其VEGF和COX-2表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（8）：121-125.

[15]劉浩，劉修恒，王磊，等.胡黃連苷Ⅱ可通過增強自噬抑制炎癥和氧化應激減輕大鼠腎缺血再灌注損傷[J].武漢大學學報：醫(yī)學版，2019，40（2）：203-207.

[16]李嘉，段宇航，張淑靜，等.四逆湯聯合環(huán)磷酰胺對C57BL/6小鼠Lewis肺癌Caspase-3表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2021，36（1）：456-458.

[17]魏鵬飛，黃輝，陳明霞，等.不同部位食管癌患者放療聯合化療的干預效果以及3年內發(fā)生轉移的影響因素分析[J].中國醫(yī)藥，2020，15（6）：898-902.

[18]孫陽，陸奕宇，周錢梅，等.白藜蘆醇通過上皮-間質轉化途徑增強順鉑抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲[J].中華中醫(yī)藥雜志，2019，34（9）：4269-4274.

[19]段斌，符浩，王昕禧.lncRNA MALAT1靶向調控miR-146b-5p影響膀胱癌細胞侵襲和遷移[J].中國病理生理雜志，2020，36（1）：82-88.

[20]金浩，余佳，王梓瑜，等.槐角黃酮通過調控LncRNA FBXL19-AS1/miR-342-3p通路抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的機制研究[J].中國中藥雜志，2020，45（18）：4440-4447.

[21]Bian S.miR-4319 inhibited the development of thyroid cancer by modulating FUS-stabilized SMURF1[J].J Cell Biochem，2020，121（1）：174-182.

[22]Yang Y，Li H，Liu Y，et al.MiR-4319 hinders YAP expression to restrain non-small cell lung cancer growth through regulation of LIN28-mediated RFX5 stability[J].Biomed Pharmacother，2019，115：108956.

（2021-07-06收稿 責任編輯：楊覺雄）