秦碧霞 李戰(zhàn)彪 謝慧婷 周彤 黃所生 崔麗賢 李丹婷 蔡健和 農(nóng)保選 蘭瑩

摘要：南方水稻黑條矮縮病是我國(guó)一類農(nóng)作物病蟲害，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)和糧食安全。種植抗（耐）病品種是防控該病害的有效措施，但對(duì)水稻品種的抗病性評(píng)價(jià)至今尚未有具體操作規(guī)程可循。針對(duì)水稻品種抗病鑒定評(píng)價(jià)及抗源篩選的迫切需求，作者在多年實(shí)踐的基礎(chǔ)上，總結(jié)制定了抗南方水稻黑條矮縮病人工接種鑒定技術(shù)及評(píng)價(jià)規(guī)程，包括有關(guān)術(shù)語(yǔ)定義，人工接種鑒定流程、結(jié)果調(diào)查和抗病性評(píng)價(jià)等，為規(guī)范開展水稻品種抗病性鑒定提供指導(dǎo)和參考。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水稻品種及育種材料抗南方水稻黑條矮縮病性狀的鑒定與評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：南方水稻黑條矮縮病;接種;抗性鑒定;規(guī)程;抗病性評(píng)價(jià);人工接種鑒定技術(shù)

中圖分類號(hào)：S435.111.4+9? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）18-0103-03

收稿日期：2021-01-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018YFD0200302）;國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32060605）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金（編號(hào)：桂農(nóng)科2020ZX13）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（編號(hào)：桂農(nóng)科2021YT071）。

作者簡(jiǎn)介：秦碧霞（1968—），女，廣西桂林人，研究員，主要從事植物病毒學(xué)研究。E-mail：qbx33@163.com。

南方水稻黑條矮縮病病原為南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，簡(jiǎn)稱SRBSDV），屬呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）;主要由遷飛性害蟲白背飛虱以持久增殖的方式進(jìn)行傳播;水稻各生育期均能感染危害，感病后植株矮縮，葉片濃綠卷曲，莖稈出現(xiàn)蠟條等，嚴(yán)重的無(wú)法正常抽穗結(jié)實(shí)，產(chǎn)量損失30%～50%。該病2001年在廣東省陽(yáng)江市陽(yáng)西縣首次被發(fā)現(xiàn)，短短幾年，已給我國(guó)南方稻區(qū)及越南北部等水稻生產(chǎn)造成極大損失。2009年，廣西壯族自治區(qū)、廣東省、海南省等9個(gè)省區(qū)普遍發(fā)病，約33.33萬(wàn)hm2晚稻嚴(yán)重受害，基本失收面積0.67萬(wàn)hm2。2010年，病區(qū)繼續(xù)向長(zhǎng)江以南擴(kuò)散，全國(guó)累計(jì)發(fā)病面積超過120萬(wàn)hm2[1-5]，2017年該水稻黑條矮縮病又一次嚴(yán)重危害廣西壯族自治區(qū)、廣東省等地的晚稻，造成嚴(yán)重?fù)p失。2020年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將南方水稻黑條矮縮病列為我國(guó)一類農(nóng)作物病蟲害。

推廣種植抗（耐）病品種是防控南方水稻黑條矮縮病的重要措施之一。由于該病害出現(xiàn)時(shí)間不長(zhǎng)，尚缺乏統(tǒng)一的抗病性鑒定技術(shù)操作規(guī)程對(duì)水稻品種進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)。人工接種鑒定條件可控，基本不受外界因素影響，能確保鑒定的準(zhǔn)確性、可比性及試驗(yàn)操作的平行性和可重復(fù)性，且能克服田間鑒定中難以規(guī)避的問題，拓寬鑒定時(shí)間。周彤等建立了水稻黑條矮縮病人工接種抗性鑒定方法[6]，并比較了田間鑒定和人工鑒定的結(jié)果，表明人工接種能真實(shí)反映水稻品種抗病性[7]，其研究結(jié)果為南方水稻黑條矮縮病的人工接種鑒定提供了很好的借鑒。曹楊等明確了白背飛虱的獲毒時(shí)間、循回期、接毒時(shí)間等白背飛虱傳播SRBSDV的特性[8]，黃所生等對(duì)白背飛虱傳播SRBSDV的效率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同接蟲密度、不同水稻生育期和白背飛虱的飼毒時(shí)間、傳毒時(shí)間均影響傳毒效率[9]，秦碧霞等進(jìn)行了98份水稻品種的人工接種抗病性鑒定試驗(yàn)，初步建立人工接種抗病性鑒定方法[10]。農(nóng)保選等用人工接種方法對(duì)廣西壯族自治區(qū)核心稻種資源進(jìn)行南方水稻黑條矮縮病抗性鑒定及全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)到8個(gè)抗病相關(guān)基因[11-12]，這些研究結(jié)果說明人工接種在抗病基因篩選等研究中的重要性。研究團(tuán)隊(duì)在開展水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病人工接種篩選鑒定的基礎(chǔ)上，不斷探索優(yōu)化傳毒介體白背飛虱的飼養(yǎng)傳毒條件和鑒定體系，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-12]，確定了人工接種最佳飼毒時(shí)間、最適接種苗齡、接種時(shí)長(zhǎng)、接毒強(qiáng)度等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)，研究制定出“水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)程”，為規(guī)范開展水稻品種抗病性鑒定評(píng)價(jià)提供參考，為加快抗病育種進(jìn)程和進(jìn)行病害綠色防控提供技術(shù)支撐。

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病（病原：南方水稻黑條矮縮病毒，Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）人工接種鑒定的技術(shù)規(guī)范及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于水稻品種及育種材料抗南方水稻黑條矮縮病性狀的鑒定與評(píng)價(jià)。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件：《NY/T 2631—2014 南方水稻黑條矮縮病測(cè)報(bào)技術(shù)規(guī)范》;《NY/T 2918—2016 南方水稻黑條矮縮病防治技術(shù)規(guī)程》

3 術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1 南方水稻黑條矮縮病（southern rice black-streaked dwarf disease）

由南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，簡(jiǎn)稱SRBSDV）侵染引起的水稻病毒病。

3.2 病株（infected plants）

感染南方水稻黑條矮縮病毒并表現(xiàn)相應(yīng)癥狀的水稻植株（病害鑒定調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)見“4.4.2”節(jié)）。

3.3 發(fā)病率（rate of infected plants）

病株占調(diào)查水稻總植株數(shù)的百分比。

3.4 無(wú)毒白背飛虱（non-viruliferous white-backed planthopper）

不攜帶南方水稻黑條矮縮病毒的白背飛虱[Sogatella furcifera （Horváth）]。

4 人工接種鑒定

4.1 接種用白背飛虱的準(zhǔn)備

4.1.1 白背飛虱的采集和飼養(yǎng) 白背飛虱若蟲或成蟲采集自田間，在養(yǎng)蟲室內(nèi)用感蟲水稻品種TN1連續(xù)飼養(yǎng)。養(yǎng)蟲室條件：溫度（26±1） ℃，相對(duì)濕度80%～90%，光—暗周期為12 h—12 h。

4.1.2 無(wú)毒白背飛虱群體的獲得 選取白背飛虱喜食的水稻種子（如TN1）用清水常溫浸種24 h后，紗布保濕，恒溫箱（32±2） ℃催芽24～48 h，選取出芽整齊一致的種子25～30粒，點(diǎn)播到裝有育苗基質(zhì)的塑料杯中（內(nèi)徑80～110 mm，下同），常規(guī)管理，6～7 d后，水稻苗長(zhǎng)至1.5葉期時(shí)，把待產(chǎn)的單頭白背飛虱雌成蟲移入杯中的水稻苗上產(chǎn)卵，3 d后取出成蟲，立即進(jìn)行帶毒性檢測(cè)或-20 ℃保存待檢。稻苗繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，孵化出白背飛虱后代若蟲群體，每群體取10～20頭2齡或3齡若蟲進(jìn)行帶毒性檢測(cè)。白背飛虱帶毒性檢測(cè)按NY/T 2631中附錄C或NY/T 2918中附錄A的規(guī)定進(jìn)行，產(chǎn)卵成蟲及其后代若蟲均不帶毒的群體定義為無(wú)毒白背飛虱群體。

4.2 毒源準(zhǔn)備

4.2.1 病株采集 田間采集表現(xiàn)南方水稻黑條矮縮病疑似癥狀的分蘗期水稻植株，種植在防蟲網(wǎng)籠中的塑料桶中。

4.2.2 病株檢測(cè)確定 采病株葉片按NY/T 2631中附錄C或NY/T 2918中附錄A的規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)感染南方水稻黑條矮縮病毒則作為毒源保存在防蟲籠中。

4.2.3 病株純化擴(kuò)繁 隔離條件下白背飛虱在“4.2.2”節(jié)病株上飼毒后接種水稻秧苗，純化并擴(kuò)繁病株。

4.3 接種鑒定

4.3.1 參鑒水稻苗的準(zhǔn)備 參鑒品種（含感病對(duì)照TN1）經(jīng)“4.1.2”節(jié)方法浸種、催芽;各選取30粒左右發(fā)芽整齊一致的種子，分別點(diǎn)播于盛有育苗基質(zhì)的塑料杯中，每個(gè)品種重復(fù)3次。

4.3.2 白背飛虱飼毒 將經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)感染SRBSDV的病株種于大燒杯中，土面覆蓋濾紙，將 1～2 齡無(wú)毒白背飛虱移入杯中，用60目防蟲網(wǎng)覆蓋杯口。飼毒2 d后將蟲移入塑料杯（預(yù)先育有白背飛虱喜食品種如TN1的秧苗）中飼養(yǎng)，度過循回期（11 d）后，每批隨機(jī)取出30頭白背飛虱高齡若蟲或成蟲，按NY/T 2631中附錄C或NY/T 2918中附錄A的規(guī)定檢測(cè)白背飛虱群體帶毒情況，計(jì)算白背飛虱群體的帶毒率。

4.3.3 接種方法 接種前隨機(jī)抽取50頭已飼毒且度過循回期的白背飛虱高齡若蟲或成蟲，測(cè)定帶毒率，計(jì)算接蟲數(shù)量后接入已育有參鑒品種的塑料杯中，接種苗齡為1.5～2.0葉齡，接種時(shí)間為2 d，接種溫度（26±1） ℃，每天上午、下午各趕蟲1次，使白背飛虱分布均勻，2 d后用殺蟲劑噴殺接種用白背飛虱，將秧苗移出塑料杯，種植在防蟲網(wǎng)室水田池中，于20～35 ℃條件下常規(guī)管理，定期觀察植株發(fā)病情況。

人工接種鑒定的有效接種蟲量用IVS表示，數(shù)值以頭/株計(jì)，按公式（1）計(jì)算：

IVS=N×PVS。（1）

式中：IVS為人工接種鑒定的有效接種蟲量;N為接種白背飛虱數(shù)量;PVS為白背飛虱帶毒率。當(dāng)IVS值處于1～2頭/株范圍內(nèi)，則試驗(yàn)有效。

4.4 調(diào)查

4.4.1 調(diào)查時(shí)間 接種15～20 d后，感病對(duì)照癥狀明顯時(shí)調(diào)查發(fā)病情況，同時(shí)確定有效鑒定株數(shù)，間隔7 d調(diào)查1次，共調(diào)查3次。

4.4.2 調(diào)查標(biāo)準(zhǔn) 苗期發(fā)病癥狀：（1）秧苗葉色濃綠，葉片短小僵直，心葉扭曲，或現(xiàn)鋸齒葉;（2）植株矮化不明顯，葉背沿葉脈有縱向不規(guī)則蠟白色瘤狀突起，后變黑褐色;（3）植株矮小，葉色稍濃綠。

出現(xiàn)（1）或（2）癥狀的植物直接記為病株;出現(xiàn)（3）癥狀的植株按NY/T 2631—2014中附錄C或NY/T 2918中附錄A的規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)確認(rèn)。

4.4.3 發(fā)病率計(jì)算 根據(jù)感病對(duì)照3次調(diào)查的最高發(fā)病率確定待鑒品種發(fā)病率的計(jì)算方式，感病對(duì)照3個(gè)重復(fù)3次調(diào)查中的最高發(fā)病率均超過30%，則認(rèn)定本次鑒定有效;若參鑒品種3個(gè)重復(fù)3次調(diào)查中的最高抗性級(jí)別差異均不超過1個(gè)等級(jí)，則認(rèn)定本次鑒定準(zhǔn)確。在鑒定有效且準(zhǔn)確的前提下，取3個(gè)重復(fù)3次調(diào)查中的最高發(fā)病率確定品種的抗性級(jí)別。如果感病對(duì)照最高發(fā)病率小于30%，則本次鑒定結(jié)果無(wú)效。

發(fā)病率用Ri表示，數(shù)值以%計(jì)，按公式（2）計(jì)算：

Ri=ni/nt×100%。（2）

式中：Ri為發(fā)病率;ni為病株數(shù);nt為總株數(shù)。結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后2位。

5 水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病性狀的評(píng)價(jià)

5.1 抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：發(fā)病率為0，免疫;1級(jí)：發(fā)病率為0.1%～5.0%，高抗;3級(jí)：發(fā)病率為5.1%～15.0%，中抗;5級(jí)：發(fā)病率為15.1%～30.0%，中感;7級(jí)：發(fā)病率為30.1%～60.0%，感病;9級(jí)：發(fā)病率大于等于60.1%，高感。

5.2 抗性評(píng)價(jià)

當(dāng)參鑒品種在不同年度間或不同批次間抗性鑒定結(jié)果不一致時(shí)，以發(fā)病率最高的抗性鑒定結(jié)果為準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]周國(guó)輝，溫錦君，蔡德江，等. 呼腸孤病毒科斐濟(jì)病毒屬一新種：南方水稻黑條矮縮病毒[J]. 科學(xué)通報(bào)，2008，53（20）：2500-2508.

[2]周國(guó)輝，張曙光，鄒壽發(fā)，等. 水稻新病害南方水稻黑條矮縮病發(fā)生特點(diǎn)及為害趨勢(shì)分析[J]. 植物保護(hù)，2010，36（1）：144-146.

[3]劉萬(wàn)才，劉 宇，郭 榮. 南方水稻黑條矮縮病發(fā)生現(xiàn)狀及防控對(duì)策[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2010，30（3）：17-18.

[4]鐘天潤(rùn)，劉 宇，劉萬(wàn)才. 2010年我國(guó)南方水稻黑條矮縮病發(fā)生原因及趨勢(shì)初析[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2011，31（4）：32-34.

[5]Hoang A T，Zhang H M，Yang J，et al. Identification，characterization，and distribution of southern rice black-streaked dwarf virus in Vietnam[J]. Plant Disease，2011，95（9）：1063-1069.

[6]周 彤，王 英，吳麗娟，等. 水稻品種抗黑條矮縮病人工接種鑒定方法[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2011，38（4）：301-305.

[7]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 水稻品種試驗(yàn)水稻黑條矮縮病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程：NY/T 2955—2016[S]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2016.

[8]曹 楊，潘 峰，周 倩，等. 南方水稻黑條矮縮病毒介體昆蟲白背飛虱的傳毒特性[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，2011，48（5）：1314-1320.

[9]黃所生，吳碧球，秦碧霞，等. 白背飛虱對(duì)南方水稻黑條矮縮病傳毒效率的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，29（12）：2840-2844.

[10]秦碧霞，蔡健和，李戰(zhàn)彪，等. 廣西水稻品種抗水稻南方黑條矮縮病鑒定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，45（1）：38-42.

[11]農(nóng)保選. 南方水稻黑條矮縮病苗期抗性基因的關(guān)聯(lián)分析、精細(xì)定位及候選基因分析[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2018.

[12]農(nóng)保選，秦碧霞，夏秀忠，等. 南方水稻黑條矮縮病苗期抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析[J]. 分子植物育種，2019，17（4）：1069-1079.