劉 岑，王 芬，馬 蘭，張紅霞

(鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市婦幼保健院/湖北理工學(xué)院附屬婦幼保健院產(chǎn)科，湖北黃石 435003)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，運(yùn)用宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)進(jìn)行宮頸癌的監(jiān)控預(yù)測(cè)具有重要的臨床意義[1]。人類(lèi)乳頭狀瘤病毒(HPV)感染可影響宮頸組織多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)[2]，是宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的高危因素，CIN及宮頸癌均和感染高危型HPV具有密切相關(guān)性[3]。CIN不同病變的宮頸組織中P21活化激酶(PAK1)和Spred1的表達(dá)PAK1/Spred/MAPK信號(hào)通路在CIN發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。PAK1參與在細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞骨架系統(tǒng)重排、細(xì)胞凋亡過(guò)程[4]，Ras-MAPK途徑在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、增殖和分化過(guò)程中起重要協(xié)同作用，Spred可抑制細(xì)胞分化，對(duì)多種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的Ras-ERK途徑均有抑制作用。P21活化激酶在正常宮頸組織一般情況不表達(dá)，宮頸前驅(qū)病變均為高危型HPV感染所致，隨著CIN級(jí)別增高，血清PAK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)表達(dá)量亦隨之升高，趙健等[5]研究證實(shí)慢性宮頸炎P21蛋白表達(dá)陽(yáng)性率及高危型HPV病毒呈正相關(guān)。 P21活化激酶受內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié)成為與宮頸組織相關(guān)的特殊分化組織P16、18，作為細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑，HPV癌基因E6、E7的持續(xù)表達(dá)造成CIN中P16的過(guò)度表達(dá)，使P16的負(fù)反饋抑制解除，致使P16表達(dá)異常，是高危型HPV感染并引致宿主細(xì)胞變異的客觀表現(xiàn)，在宮頸病變的早期診斷中發(fā)揮作用[6]。對(duì)HPV感染的流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究，有助于宮頸癌的早期診斷和聯(lián)合治療，使患者預(yù)后得到明顯改善[7]。本文對(duì)CIN中PAK1、Spred1的表達(dá)水平及病理特征進(jìn)行分析，并就CIN與高危型HPV感染的相關(guān)性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1-12月臨床檢驗(yàn)中心手術(shù)后送檢的200例宮頸組織標(biāo)本，獲得CIN組織標(biāo)本76份。CIN采用2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，CIN標(biāo)本中CINⅠ期31例、Ⅱ期27例、Ⅲ期18例；低分化29例，中分化28例，高分化19例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。選取同期因其他疾病行全子宮切除的58例患者的正常宮頸組織作為對(duì)照，患者年齡37～68歲，平均(51.50±6.20)歲。所有患者術(shù)前3個(gè)月均未接受藥物治療、放療、新輔助化療或中藥治療，且臨床病理資料完整、病例信息完整。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查備案，征得患者或配偶知情同意，保護(hù)其隱私和匿名權(quán)，所有資料僅用于研究。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法

兔抗人PAK1多克隆抗體bs-17685R、DAB顯色試劑(北京中山試劑公司提供)1∶50倍稀釋、兔抗人Spred1多克隆抗體1∶75倍稀釋?zhuān)徊捎妹庖呓M織化學(xué)法檢測(cè)，按照要求步驟進(jìn)行操作。PAK1及Spred1采用雙盲法按著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分級(jí)，低倍鏡視野計(jì)數(shù)取各視野中陽(yáng)性數(shù)的平均值作為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，以兩者相乘的結(jié)果作為最終評(píng)分，≤3分為陰性，>3分為陽(yáng)性[8]。

1.2.2宮頸組織病變病理檢查

取宮頸組織標(biāo)本于固定液內(nèi)固定12 h以上，脫水2 h進(jìn)行透明處理，浸蠟3 h石蠟包埋切片(厚度3 μm)，脫蠟10 min后水化，采用蘇木素-伊紅(HE)染色封片，標(biāo)本低倍鏡觀察不同宮頸組織病變各期CIN病理特征和高危型HPV感染與宮頸組織病變病理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，相關(guān)性采用Spearman分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同病理組織PAK1和Spred1蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較

正常宮頸組織、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ期PAK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，Spred1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同病理組織PAK1和Spred1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較[n(%)]

2.2 高危型HPV感染后不同宮頸組織病變病理特征

CIN宮頸組織標(biāo)本見(jiàn)圖1～3。少量宮頸及外陰組織活檢病理結(jié)果為外陰鱗狀上皮內(nèi)瘤變Ⅲ期伴HPV感染(HPV16/18+、HPV31/33-)，CINⅡ期伴HPV16和HPV18感染，見(jiàn)圖4。

圖1 宮頸組織CINⅠ期病理圖片(HE,×100)

圖2 宮頸組織CINⅡ期病理圖片(HE,×100)

圖3 宮頸組織CINⅢ期病理圖片(HE,×100)

2.3 不同病理特征PAK1和Spred1陽(yáng)性表達(dá)比較

PAK1陽(yáng)性表達(dá)與病理分級(jí)和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，而Spred1陽(yáng)性表達(dá)與病理分級(jí)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖4 宮頸組織CINⅡ期伴HPV16、18感染病理圖片(HE,×100)

表2 不同病理特征PAK1和Spred1陽(yáng)性表達(dá)比較[n(%)]

2.4 高危型HPV感染與PAK1、Spred1表達(dá)的相關(guān)性

高危型HPV感染與PAK1、Spred1均有相關(guān)性(P<0.05)，且PAK1與Spred1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.504，P<0.001)，見(jiàn)表3。

3 討 論

CIN已經(jīng)成為造成女性腫瘤患者死亡的重要原因，該病多以遺傳、慢性婦科炎癥等因素而引起[9]，而高危型HPV已成為CIN的重要致病因素。秦麗等[10]meta分析結(jié)果證實(shí)，陰道菌群以非乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)的女性更可能與HPV感染，發(fā)生宮頸病變或?qū)m頸癌相關(guān)。近年來(lái)隨著分子靶向藥物的臨床應(yīng)用治療多種腫瘤，取得了比較理想的治療效果，因此，對(duì)靶向治療敏感的分子信號(hào)通路的研究，是腫瘤治療領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)問(wèn)題[11]。 PAK1是蘇氨酸蛋白、絲氨酸蛋白激酶，作為Rho下游的靶蛋白和MAPK上游的調(diào)節(jié)蛋白[12],PAK1主要通過(guò)結(jié)合CDC42或Rac1被激活, 調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞活力和形態(tài)，在瘤體的生成及轉(zhuǎn)移過(guò)程與腫瘤血管中起相互作用，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)腫瘤血管供給瘤體生長(zhǎng)，有報(bào)道PAK1的表達(dá)與人鱗狀細(xì)胞癌的分期和分級(jí)相關(guān)[13]。劉暢等[14]研究發(fā)現(xiàn)P21活化激酶能夠抑制MAPK信號(hào)通路的活化，因此，PAK1與CIN的發(fā)病、發(fā)展存在潛在關(guān)系。

PAK1過(guò)度表達(dá)是CIN過(guò)程中的一個(gè)早期事件，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及演進(jìn)過(guò)程有密切的關(guān)系[15]。Spred1在RhoA介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)行及信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用，Notch 基因的細(xì)胞表面受體影響細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)過(guò)程，影響母細(xì)胞的分化、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡過(guò)程，Notch1的作用在不同細(xì)胞中運(yùn)行機(jī)制不同，基因位點(diǎn)突變引起的表型改變，表明Notch信號(hào)作用的多樣性，在機(jī)體細(xì)胞組織腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，通過(guò)與活化的RhoA結(jié)合來(lái)抑制其誘導(dǎo)的Rho激酶的激活，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)廣泛分布于多種惡性腫瘤間質(zhì)中，它的聚集程度與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，可以認(rèn)為CINⅠ期可向正常組織轉(zhuǎn)化。在Spred1、PAK1、MAPK信號(hào)通路中，Spred1為抑癌基因，PAK1為促癌基因，通過(guò)上調(diào)Spred1為靶向蛋白，達(dá)到抑制PAK1的活化[16]，提示PAK1與Spred1的相互作用在高危型HPV持續(xù)感染情況下，HPV通過(guò)感染、整合、癌變3個(gè)階段，導(dǎo)致宮頸癌前病變的發(fā)生、發(fā)展，引起陰道上皮細(xì)胞成熟障礙，形成陰道上皮細(xì)胞的不典型增生。Spred1可能具有一種抑癌基因的潛能，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑制作用，當(dāng)Spred1基因突變使抑制功能下調(diào)，對(duì)PAK的負(fù)調(diào)控作用引起PAK1表達(dá)水平的上調(diào)，下游蛋白MAPK作用上調(diào)導(dǎo)致CIN的發(fā)生、發(fā)展。

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，有約10%的患者術(shù)后較快出現(xiàn)復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可能與癌細(xì)胞微轉(zhuǎn)移有關(guān)[17]，Spred1基因誘導(dǎo)腫瘤靶細(xì)胞的破壞，來(lái)降低惡性腫瘤的發(fā)生率，宮頸癌患者血清中檢測(cè)其水平表達(dá)，可以評(píng)估宮頸組織皮肌上皮細(xì)胞癌變的發(fā)生、發(fā)展，HPV-16持續(xù)感染是影響患者復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[18]。Spred1基因是人類(lèi)腫瘤中廣泛存在的腫瘤抑制基因，PAK1表達(dá)異常是HPV感染并引致宿主細(xì)胞變異的客觀表現(xiàn)，在宮頸病變的早期診斷中發(fā)揮重要作用[19]。本研究結(jié)果顯示，76例宮頸組織中PAK1陽(yáng)性54例，陰性22例；Spred1陽(yáng)性53例，陰性23例，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析：PAK1和Spred1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.504，P<0.001)。病理檢測(cè)結(jié)果PAK1和Spred1的表達(dá)與高危型HPV感染的相關(guān)性(P<0.05)，PAK1蛋白和Spred因子在宮頸組織中的表達(dá)與腫瘤的臨床分期及組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，陽(yáng)性表達(dá)率比較組織學(xué)分級(jí)越高，PAK1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率越高，而Spred1因子陽(yáng)性表達(dá)率則越低。Spred1因子水平陽(yáng)性表達(dá)率隨著CIN程度的加重反而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

本研究顯示，CIN宮頸組織PAK1與Spred1因子表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示高危型HPV感染與PAK1、Spred1密切相關(guān)，過(guò)表達(dá)可能影響抑癌基因的正常表達(dá)，進(jìn)而影響癌細(xì)胞的增殖、遷移，增加其浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[20]。臨床CINⅠ期病例很常見(jiàn)，對(duì)于該類(lèi)病例可不采用任何治療僅觀察隨訪。細(xì)胞學(xué)為高密度鱗狀上皮內(nèi)病變組織學(xué)診斷CINⅡ期時(shí)不僅要觀察隨訪，應(yīng)行LEEP術(shù)及時(shí)治療，可以阻止宮頸浸潤(rùn)癌的發(fā)生。對(duì)術(shù)后病理為CINⅢ期的患者需要定期隨訪，以排除CIN持續(xù)高危型HPV造成CIN的持續(xù)狀態(tài)或復(fù)發(fā)和低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的存在，確診后可以選擇宮頸錐切術(shù)及外陰單純切除術(shù)[21]。對(duì)患者進(jìn)行嚴(yán)密觀察宮頸細(xì)胞學(xué)轉(zhuǎn)化，有利于監(jiān)測(cè)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，對(duì)于臨床下一步制訂治療方案具有重要的意義。

綜上所述，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟的過(guò)程，往往是在多種致病因素作用同時(shí)，通過(guò)基因相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。對(duì)高危型HPV感染與PAK1、Spred1在CIN宮頸組織表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行研究，可為宮頸鱗癌的早期診斷與治療提供理論依據(jù)，對(duì)評(píng)估CIN近期預(yù)后提供參考，具有重要的臨床意義。