金 婷，王 芳，王 利△

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院血液科，武漢 430014；2.山東省棗莊市山亭區(qū)人民醫(yī)院藥劑科 277200)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是嚴重威脅人類健康的一種惡性血液腫瘤。老年AML患者面臨的問題是化療緩解率低，移植相關死亡率高。我國學者在《Blood》雜志報道人類白細胞抗原(human lymphocyte antigen，HLA)半相合外周造血干細胞輸注聯(lián)合化療(微移植)能較好提高老年AML的治療療效[1]。但微移植抗白血病的機制尚未研究清楚，T淋巴細胞、自然殺傷(natural killer，NK)細胞均可能參與發(fā)揮作用。NK細胞主要通過穿孔蛋白/顆粒酶途徑直接殺傷靶細胞，NK細胞擴增后穿孔蛋白及顆粒酶B基因的表達水平明顯增加，NK細胞的殺傷功能明顯加強[2]。在蛋白質水平，分泌干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)是NK細胞活化的一個標志，激活后的NK細胞通過分泌IFN-γ等細胞因子參與免疫調節(jié)[3]。本課題組前期已經(jīng)成功建立了白血病的微移植小鼠模型，發(fā)現(xiàn)微移植后IFN-γ釋放增加，證明了IFN-γ水平與抗白血病效應呈正相關[4]。因此，筆者推測NK細胞可能通過釋放IFN-γ在微移植抗白血病效應中起重要作用，遂進行了相關研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月至2018年12月在武漢市中心醫(yī)院血液科行微移植治療的20例老年低中危AML患者為微移植組，選取同一時期行常規(guī)化療的20例老年低中危AML患者為對照組。納入標準:(1)明確診斷AML；(2)年齡大于或等于60歲；(3)美國東部腫瘤協(xié)作組(eastern cooperative oncology group,ECOG)評分小于或等于2分。供者標準：(1)身體健康，無精神病或嚴重心、肺、肝、腎疾病者；(2)供受者HLA配型小于或等于7個位點相合。排除標準:(1)AML-M3型；(2)供受者HLA配型大于7個位點相合；(3)高?；颊撸?4)全身情況差、嚴重感染、心肌病及心肌炎、其他實體腫瘤、嚴重肝、腎功能不全、妊娠、結締組織疾病及自身免疫性疾??；(5)治療依從性差。微移植組男13例，女7例，年齡60～81歲，平均(66.8±6.68)歲。對照組男11例，女9例，年齡60～80歲，平均(68.3±7.28)歲。所有患者及家屬均簽署知情同意書，供者簽署干細胞采集及干細胞捐獻知情同意書。本研究通過倫理委員會審查。

1.2 方法

1.2.1標準化療方案

誘導化療方案為地西他濱+HAG方案：地西他濱20 mg·m-2·d-1(化療第1～5天)+高三尖杉酯堿1～2 mg·m-2·d-1(化療第1～7天)+阿糖胞苷10～20 mg·m-2·d-1(化療第1～14天)+重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)5 μg·kg-1·d-1，當白細胞計數(shù)大于20×109/L時，停用rhG-CSF。鞏固方案為中劑量或大劑量阿糖胞苷：阿糖胞苷0.5～2.5 g/m2，每12小時1次(化療第1～3天)。對照組采用上述方案誘導化療及鞏固化療，共4個療程。

1.2.2外周血干細胞輸注程序

對供者使用rhG-CSF(惠爾血，協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社)600 μg/d皮下注射，共5 d，第5、6天用費森尤斯卡比血細胞分離機采集外周血干細胞(peripheral blood hematopoietic stem cells，PBHSC)。將采集到的PBHSC分為4等份，受者第1次輸注的PBHSC為新鮮采集物，剩余3份凍存于液氮罐中，以后輸注的供者PBHSC均為快速復蘇的凍存細胞。分別于化療結束后24～48 h，給受者輸注PBHSC采集物，輸注過程中嚴密監(jiān)測受者生命體征。

微移植組為化療+供者PBHSC輸注(單個核細胞輸注中位數(shù)范圍為2.5～3.0×108/kg，或CD3+T細胞數(shù)大于1×108/kg，稱為1個微移植療程)，每1～2個月1次，完成4個微移植療程后停止治療。

1.2.3觀察指標

1.2.3.1療效評價和隨訪

(1)完全緩解(complete remission，CR)。CR定義為骨髓中原始細胞比例小于或等于5%，中性粒細胞計數(shù)(ANC)≥1.0×109/L，血小板大于或等于100×109/L。(2)嵌合率。微移植組取患者微移植后外周血或者骨髓標本經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后采用短串聯(lián)重復序列的熒光PCR檢測技術計算得出供者嵌合率(常州金麥格全血基因核酸提取試劑盒)。(3)NK細胞比例。取患者微移植前后EDTA抗凝血3～4 mL，采用流式檢測術檢測NK細胞比例(流式檢測術試劑購自美國BD公司)。(4)IFN-γ濃度。取患者微移植前后血清標本3～4 mL，采用雙抗體夾心ELISA法檢測標本中IFN-γ濃度(ELISA試劑購自中國武漢光谷聯(lián)合醫(yī)學檢驗所有限公司)。(5)總生存(overall survival，OS)和無病生存(disease-free survival，DFS)。OS定義為確診至死亡或隨訪結束，隨訪時間為確診到死亡或隨訪結束。DFS定義為從CR到復發(fā)或死亡的時間。統(tǒng)計兩組2年OS、DFS數(shù)據(jù)，并繪制生存曲線。

1.2.3.2不良反應

(1)血液系統(tǒng)：監(jiān)測ANC、血紅蛋白、血小板計數(shù)。當患者ANC<0.5×109/L時，給予rhG-CSF 300 μg/d皮下注射。當患者血紅蛋白小于60 g/L時，予懸浮紅細胞輸注；當血小板小于20×109/L時，予血小板輸注。(2)非血液系統(tǒng)：①過敏反應或移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)；②微移植治療相關感染發(fā)生情況；③胃腸道反應、肝腎功能損害、神經(jīng)系統(tǒng)損害等。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 治療情況

微移植組20例患者中有1例患者僅完成2個療程微移植治療，其余患者均順利完成4個療程治療，總計78個療程。對照組20例患者有1例患者因消化道出血死亡僅完成2個療程化療，共78個療程。

2.2 療效

2.2.1近期療效及嵌合率情況

誘導化療結束，微移植組CR率為60%，對照組為35%。所有療程結束后，微移植組中性粒細胞恢復(ANC>1.5×109/L)時間為(13.18±4.23)d，對照組為(15.79±4.76)d，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.627，P<0.05)。微移植組血小板恢復(血小板大于20×109/L)時間為(14.19±4.94)d，對照組為(19.62±5.58)d，差異有統(tǒng)計學意義(t=-6.428，P<0.05)。所有患者的供者細胞嵌合率均小于1%。

2.2.2微移植前后兩組NK細胞比例及IFN-γ濃度

與微移植前比較，微移植后NK細胞比例、IFN-γ濃度升高，見表1。采用Pearson相關分析評價微移植后NK細胞比例與IFN-γ濃度的關系，結果顯示兩個變量存在線性關系，為強相關(P<0.05)，見圖1。

表1 微移植前后兩組NK細胞比例及IFN-γ濃度比較

圖1 Pearson相關分析

2.2.3OS及DFS

至隨訪結束，微移植組8例患者死亡，4例復發(fā)狀態(tài)，8例達CR狀態(tài)。對照組13例患者死亡，2例復發(fā)狀態(tài)，5例達CR狀態(tài)。2年OS率微移植組、對照組分別為61.8%、43.3%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.039)。2年DFS率微移植組、對照組分別為51.6%、23.7%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.040)，見圖2。

2.3 不良反應

(1)血液系統(tǒng)：所有患者都發(fā)生Ⅳ度骨髓抑制。(2)非血液系統(tǒng)：所有患者治療過程中均出現(xiàn)惡心、乏力表現(xiàn)，均未出現(xiàn)肝腎功能損害。微移植組患者均未觀察到GVHD臨床表現(xiàn)，在輸注PBHSC時均未出現(xiàn)發(fā)熱，患者耐受性良好。9例患者在骨髓抑制期發(fā)生感染，均為肺部感染，其中1例在第2療程治療后因肺部感染引起呼吸衰竭導致死亡。1例抽搐，1例皮疹，1例血壓升高，1例消化道出血，2例腹瀉，經(jīng)過治療后均恢復良好。對照組12例患者在骨髓抑制期發(fā)生感染，均為肺部感染，另有1例在第2療程治療后因消化道出血死亡。

A：OS；B：DFS。

3 討 論

微移植是指血液系統(tǒng)腫瘤在誘導或強化治療后輸注經(jīng)rhG-CSF動員的HLA不相合異基因造血干細胞的一種移植方式，也是一種不伴有持續(xù)植入的異源反應性細胞治療，是將化學治療、移植和免疫治療有機結合的一種新的治療模式[5]。微移植治療AML的基本思路是[6-7]：選用經(jīng)典聯(lián)合化療方案或靶向藥物，盡可能降低腫瘤負荷(期間無需使用GVHD預防藥物)；化療后通過程序性輸注經(jīng)rhG-CSF動員的HLA不相合PBHSC，使供體細胞在受者體內形成微嵌合(<1%)，誘導移植物抗白血病(graft versus leukemia,GVL)的作用，避免臨床GVHD的發(fā)生，實現(xiàn)GVHD與GVL分離。

異源反應性是供受者之間的免疫反應，這種免疫反應發(fā)生在同種異體造血干細胞移植的背景下，已被證明是血液系統(tǒng)腫瘤最有效的免疫治療形式之一。同樣，在微移植治療AML中，T淋巴細胞和NK細胞的異源反應性起著直接的抗白血病作用[8]。目前估計微移植可能有以下3種機制參與發(fā)揮作用[9]：(1)輸入的異源反應供者細胞或腫瘤特異性殺傷細胞，如T淋巴細胞、NK細胞介導的直接細胞毒性作用；(2)供者CD4+T淋巴細胞給受者CD8+T淋巴細胞提供“幫助”，激活CD8+T淋巴細胞的抗腫瘤活性，使無抗腫瘤活力的CD8+T淋巴細胞重新獲得抗腫瘤能力；(3)受者異源反應細胞在排斥供者細胞的過程中誘導產(chǎn)生促進代謝反應因子，打破免疫耐受或增強宿主抗腫瘤效應。國內學者認為供體微嵌合的外周血干細胞中含有較多淋巴細胞、CD34+細胞及細胞因子(如白細胞介素-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α)，這些細胞及細胞因子可能起到促進造血功能恢復及發(fā)揮GVL效應的作用[1,10-11]。

NK細胞是先天性免疫細胞，可通過直接殺傷作用、抗體介導的細胞依賴的細胞毒性作用、分泌細胞因子等機制發(fā)揮殺傷作用[12-14]。在造血干細胞移植中，NK細胞有抗白血病作用[15-17]。GUO等[18]證實在微移植治療中NK細胞等免疫細胞可通過細胞毒作用發(fā)揮抗白血病效應，對預后起著重要作用。NK細胞的功能受到抑制性和激活性受體的調節(jié)，這些受體起到抗腫瘤監(jiān)測和細胞毒性調節(jié)的作用[19]，在這些受體中，殺傷免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)是介導自我耐受、抗腫瘤、抗感染的主要受體之一[20-21]。當受體白血病靶細胞上主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ表達降低時，供體NK細胞表達的抑制性KIR將不能與其結合產(chǎn)生的抑制信號，供體NK細胞的殺傷功能被激活，因此，能溶解受體中的殘留白血病細胞[15]。HU等[22]根據(jù)供體和受體中HLA抑制性KIR配體(A11/3、HLA-Bw4、HLA-Cw)表達的不同，將105例微移植AML患者分為兩組，即供體-受體KIR配體重疊組(受者HLA配體可識別供體抑制性KIR)和供體-受體KIR配體不重疊組(受者HLA配體不可識別供體抑制性KIR)，結果顯示，不重疊組有更高的5年無白血病生存率(44.0% vs.71.1%)，5年OS率分別為60.1%、74.4%，5年復發(fā)率分別為42.6%、27.5%。紅白血病細胞系K562是NK細胞的敏感靶細胞，部分原因在于它們MHC-Ⅰ分子的低表達或不表達[23]。FOLEY等[24]設計成人非親緣造血干細胞移植模型證實，受人紅白血病細胞系K562靶細胞刺激后，高表達KIR的NK細胞分泌更高水平的IFN-γ(Pearson相關系數(shù)r=0.412，P=0.023)。本課題組前期已經(jīng)成功建立了白血病的微移植小鼠模型，發(fā)現(xiàn)微移植后IFN-γ釋放增加，證明了IFN-γ與抗白血病效應呈正相關[4]。

本研究通過分析比較微移植前后NK細胞比例變化和INF-γ濃度變化之間的相關性發(fā)現(xiàn)微移植治療后NK細胞比例明顯高于微移植治療前，IFN-γ的濃度微移植后較微移植前明顯升高，進一步采用Pearson相關性分析微移植后NK細胞比例和微移植后IFN-γ的濃度之間相關性，證實二者為強相關。因此，推測NK細胞與微移植治療AML的療效有強相關性。

本研究不足之處在于未明確NK細胞如何直接或間接促進IFN-γ釋放的機制，未來有待深入研究NK、CD8+T和CD4+T細胞等免疫細胞如何協(xié)同促進IFN-γ釋放從而提高微移植療效的具體機制。