朱小雨，譚玉潔

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，貴陽(yáng) 550004)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命健康。隨著篩查技術(shù)的不斷提升，其發(fā)病率和病死率已經(jīng)明顯下降，但在發(fā)展中國(guó)家仍然是女性死亡的重要原因[1]。因此，探究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的影響因素，發(fā)現(xiàn)有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)尤為重要。帕金森病相關(guān)蛋白7(parkinson protein 7,PARK7/DJ-1)是一種高度保守的蛋白，以同源二聚體的形式廣泛表達(dá)于機(jī)體各組織細(xì)胞，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖等生理病理活動(dòng)[2-4]。它以二聚體的形式參與多種病理生理過(guò)程的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)DJ-1與肝癌細(xì)胞增殖相關(guān)[5]，此外，DJ-1在膽管癌中表達(dá)上調(diào)且與其預(yù)后相關(guān)[6]。甲基胞嘧啶雙加氧酶(ten eleven translocation 1，TET1)是TET蛋白家族的主要成員之一，是新近發(fā)現(xiàn)的一種基因甲基化調(diào)節(jié)酶，其主要功能是通過(guò)將5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)，從而發(fā)揮DNA去甲基化的作用[7]。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要部分，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。有研究報(bào)道，在肝癌[8]、乳腺癌[9]、卵巢癌[10]組織中TET1表達(dá)明顯下調(diào)。此外，TET1還參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[11]。目前，DJ-1和TET1在宮頸癌中的作用還尚未明確。因此，本研究探討宮頸癌患者DJ-1和TET1的表達(dá)水平與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為進(jìn)一步尋找宮頸癌早期診斷的生物標(biāo)志物和治療相關(guān)靶點(diǎn)提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1-9月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科診治的40例宮頸疾病患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮肌瘤經(jīng)婦科和B超確診[12]，宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)參照《中國(guó)子宮頸癌篩查及異常管理相關(guān)問(wèn)題專家共識(shí)》[13]標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合病史、細(xì)胞學(xué)檢查、病理活檢結(jié)果確診；(2)患者入院前未接受化療、放療及激素治療，同時(shí)也未服用過(guò)其他類型的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并傳染性疾??；(2)合并自身免疫性疾??；(3)繼發(fā)性盆腔癌，或合并乳腺、 肝、腎、肺等其他臟器惡性腫瘤；(4)入院前半年接受免疫抑制劑治療。40例患者按照檢查結(jié)果分為宮頸癌Ⅰ組、CINⅢ級(jí)組和子宮肌瘤組。其中宮頸癌Ⅰ組15例，年齡38～70歲，平均(50.60±3.49)歲；CINⅢ級(jí)組15例，年齡28～59歲，平均(42.80±9.45)歲；子宮肌瘤組10例，年齡43～54歲，平均(47.10±2.92)歲。3組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。另選取2020年6-8月行婦科手術(shù)切除的10例宮頸癌患者作為宮頸癌Ⅱ組，并以其癌旁組織作為癌旁對(duì)照組，患者年齡38～62歲，平均(47.00±8.15)歲。本研究所有研究對(duì)象知情同意，且經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理批件號(hào)：2018倫審第075號(hào))。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)

宮頸癌Ⅰ組、CINⅢ級(jí)組、子宮肌瘤組組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，水化，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)3 min，3%過(guò)氧化氫30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，山羊血清封閉30 min，滴加DJ-1抗體(1∶1 000)，濕盒4 ℃過(guò)夜，次日取出，平衡至室溫30 min，棄去一抗，PBS洗3次，每次10 min，滴加酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，室溫放置2 h；棄掉二抗，PBS洗3次，每次10 min；DAB顯色，顯色時(shí)間為3～5 min，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，返藍(lán)，脫水透明，封片。用已知宮頸癌的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)組織切片著色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色面積進(jìn)行評(píng)分，挑選5個(gè)高倍鏡視野(×400)觀察，采用二級(jí)計(jì)分法進(jìn)行結(jié)果判斷，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：未著色，陰性，0分；著色呈淺黃色，弱陽(yáng)性，1分；著色呈黃色或深黃色，中度陽(yáng)性，2分；著色較強(qiáng)呈黃褐色，強(qiáng)陽(yáng)性，3分。染色面積評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，0分；陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)小于25%，1分；陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)占25%～50%，2分；陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)大于50%，3分。免疫組織化學(xué)著色評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×染色面積評(píng)分，0分記為“-”，表示陰性；1～2分記為“+”，表示弱陽(yáng)性；3～4分記為“++”，表示中陽(yáng)性；≥5分記為“+++”，表示強(qiáng)陽(yáng)性。為方便統(tǒng)計(jì)，本研究將“-”“+”定為陰性,“++”“+++”定為陽(yáng)性[14]。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

人正常子宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)、宮頸癌細(xì)胞SiHa和HeLa(南京科佰生物科技有限公司)均用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，濕度為97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換1次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.3Western blot

稱取宮頸癌Ⅱ組和癌旁對(duì)照組組織各50～80 mg，剪碎，在液氮中充分研磨，或?qū)?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HcerEpic、SiHa和HeLa細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，加入約100 μL RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min后取上清液,測(cè)定蛋白濃度。配制5%濃縮膠和12%或8%的分離膠,每泳道加總蛋白量25 μg進(jìn)行電泳分離；恒壓80 V，30 min，后轉(zhuǎn)120 V至當(dāng)樣品中的溴酚藍(lán)移動(dòng)至膠底邊上時(shí)，即可結(jié)束電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,在含5%脫脂奶粉溶液中常溫封閉2 h，分別加入兔抗人DJ-1單克隆抗體(1∶10 000)、兔抗人TET1多克隆抗體(1∶1 500)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜，每次10 min，共3次，后加入辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，每次10 min，共3次。電化學(xué)發(fā)光(ECL)進(jìn)行顯影，GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J圖像分析軟件,分別用DJ-1和TET1與GAPDH灰度比值表示DJ-1和TET1蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同宮頸組織DJ-1表達(dá)情況比較

DJ-1主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，部分細(xì)胞核也有表達(dá)，呈棕色。DJ-1在子宮肌瘤組[2/10(20%)]、CINⅢ級(jí)組[9/15(60%)]和宮頸癌Ⅰ組[12/15(80%)]陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.091，P=0.004)，見圖1。

A：子宮肌瘤組；B：CINⅢ級(jí)組；C：宮頸癌Ⅰ組。

2.2 宮頸癌及癌旁正常組織DJ-1和TET1表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示，與癌旁對(duì)照組比較，宮頸癌Ⅱ組DJ-1表達(dá)水平升高，TET1表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 宮頸癌及癌旁正常組織DJ-1和TET1表達(dá)情況

2.3 不同宮頸細(xì)胞DJ-1和TET1表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示，與人正常子宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic比較，宮頸癌細(xì)胞SiHa和HeLa的DJ-1表達(dá)水平升高，TET1表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、5。

a：P<0.05，與癌旁對(duì)照組比較。

a：P<0.05，與HcerEpic比較。

3 討 論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其治療手段有限，手術(shù)、放化療等對(duì)早期的宮頸癌來(lái)說(shuō)還尚有效，但對(duì)于晚期宮頸癌來(lái)說(shuō)，療效及預(yù)后較差。對(duì)此，尋找更為有效的、針對(duì)性的早期診斷與治療靶點(diǎn)就顯得尤為重要。

DJ-1主要存在于細(xì)胞質(zhì)，也可存在于細(xì)胞核，與線粒體功能密切相關(guān)[15]。目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)野生型DJ-1以二聚體形式參與人體中多種病理生理過(guò)程的調(diào)控，其中包括細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、分子伴侶活性及負(fù)性調(diào)節(jié)等，這些調(diào)控功能均可能在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義[16]。在原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌組織中，DJ-1的表達(dá)高于正常細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)DJ-1高表達(dá)與患者預(yù)后和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[17]。多項(xiàng)研究表明DJ-1與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、促進(jìn)細(xì)胞存活及增殖等[18-20]。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)宮頸癌Ⅰ組、CINⅢ級(jí)組和子宮肌瘤組DJ-1的表達(dá)情況，結(jié)果表明，DJ-1陽(yáng)性表達(dá)率隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的增加而逐漸升高，提示DJ-1與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。為了進(jìn)一步了解DJ-1在宮頸癌組織中的表達(dá)水平，本研究采用Western blot檢測(cè)DJ-1在宮頸癌細(xì)胞SiHa、HeLa及宮頸癌Ⅱ組的表達(dá)水平，結(jié)果顯示DJ-1在宮頸癌組織中的表達(dá)水平升高，這與WANG等[21]研究結(jié)果一致。

表觀遺傳學(xué)是指在不改變核苷酸序列的前提下染色體所發(fā)生的、可以遺傳給后代的變化。而DNA甲基化是迄今為止哺乳動(dòng)物研究最多的表觀遺傳修飾之一，它的異常表現(xiàn)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。TET1是TET蛋白家族的主要成員之一，是新發(fā)現(xiàn)的一種基因甲基化調(diào)節(jié)酶。文獻(xiàn)報(bào)道在許多實(shí)體瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，腫瘤組織中TET1的表達(dá)水平明顯減少，且還伴隨著5-hmC的表達(dá)降低及異常DNA甲基化積累，表明在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，TET1具有重要作用。研究報(bào)道在卵巢癌組織中，TET1的表達(dá)與臨床分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[22]。此外，文獻(xiàn)報(bào)道TET1可因自身被甲基化而表達(dá)沉默，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，表明TET1自身也具有抑癌基因的作用[23]。還有研究發(fā)現(xiàn)，TET1可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[24]，但在宮頸癌研究中少有報(bào)道。本研究用Western blot檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞SiHa、HeLa及宮頸癌Ⅱ組TET1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TET1在宮頸癌中的相對(duì)表達(dá)水平降低，提示TET1可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，DJ-1和TET1在宮頸癌的異常表達(dá)可能與其發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，但由于本研究樣本量較小，未對(duì)腫瘤患者臨床病理特征做相關(guān)性分析，需加大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。此外，DJ-1和TET1之間是否存在相互作用的途徑，下調(diào)DJ-1或上調(diào)TET1表達(dá)在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的影響還有待進(jìn)一步研究，而這一機(jī)制的闡明可為宮頸癌的早期診斷、干預(yù)和靶向治療提供試驗(yàn)依據(jù)。