黃麗芳，許 彥，唐乾利，曾鴻孟，毛康任，王 兵△

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001；2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530001)

膽石癥是指膽道系統(tǒng)包括膽囊或膽管內(nèi)外發(fā)生結(jié)石的疾病，是膽道系統(tǒng)中最常見的病變[1]，肝內(nèi)膽管結(jié)石是膽結(jié)石的一種類型。我國膽石癥的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢[2]，其中肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病率在2.0%～2.5%[3]，歐美地區(qū)的發(fā)病率相對較低[4]，其在韓國及日本均是常見疾病。目前肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病機制尚未明確，多認為它與膽道細菌和寄生蟲感染、膽管炎和膽汁淤滯、遺傳和環(huán)境、飲食與代謝等多種因素有關(guān)[5-8]，且各種因素可相互作用促進結(jié)石形成。因其易于復(fù)發(fā)并感染，能夠引起肝左葉的萎縮、纖維化和功能減弱，故本病治療難度較大，具有復(fù)發(fā)率高、殘石率高、與肝內(nèi)膽管癌關(guān)系密切等特點，在全世界范圍內(nèi)屬于難治型膽道疾病[9-11]。目前研究多傾向于利用動物模型構(gòu)建炎癥環(huán)境[12-13]，這已經(jīng)被證實是一種有效的研究方法。因此，本課題組提出構(gòu)建炎癥動物模型，通過參照文獻方法[14]，在肝內(nèi)膽管注射脂多糖(LPS)構(gòu)建大鼠肝內(nèi)膽管炎癥動物模型，探討肝內(nèi)膽管炎癥參與結(jié)石形成的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

無特殊病原體(SPF)級健康雄性大鼠80只，體重200～250 g，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證SCXK桂2011-0001。大鼠放置于飼養(yǎng)籠，室內(nèi)溫度控制在23～25 ℃，濕度保持在48%～62%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.1.2試劑與儀器

熊去氧膽酸膠囊(意大利貝斯迪大藥廠，國藥準字H20150398，0.25克/粒，25粒/盒)。LPS(北京索萊寶科技有限公司，國藥準字L8880，10毫克/支)。全自動組織脫水機(Leica ASP300S)、展烤片機(ZKPJ-1A型)、Thermo Shandon切片機(A78100101型)、病理石蠟包埋機(TMA81010100)、全自動蘇木素-伊紅(HE)染色儀器(DAKEWE)、倒置顯微鏡(CKX41)、細胞自動計數(shù)器、超低溫冰箱(EXF40086V)、 臺式高速冷凍離心機(Centrifuge 5810R)、超凈工作臺(SW-CJ-IFD)、日立7180自動生化分析儀(HITACHI)、希森美康XT-1800i全自動血液分析儀。

1.2 方法

1.2.1腹腔內(nèi)膽總管注射LPS誘導(dǎo)大鼠肝內(nèi)膽管炎癥形成

1.2.1.1實驗分組

將80只大鼠分為空白對照組、模型組A、模型組B和模型組C，每組各20只，放置于干凈的飼養(yǎng)籠內(nèi)正常喂食飼養(yǎng)，自來水飲食共7 d。

1.2.1.2模型構(gòu)建

各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，將1 mg LPS重懸于1 mL無菌平衡鹽溶液或細胞培養(yǎng)基，輕輕旋渦振蕩直至粉末完全溶解，變成模糊的淡黃色溶液，即得到1 mg/mL的儲存液。用濃度為10%的水合氯醛按1 mL/200 g通過左(右)下腹部采用腹腔注射大鼠進行麻醉，將大鼠麻醉后、腹部剃毛、腹部朝上、一次性橡皮筋固定四肢放置于木板上、聚維酮碘或乙醇消毒，在劍突下靠右作橫行切口，直徑2～3 cm，切開皮膚、肌肉、腹膜、找到十二指腸，用眼科鑷子提起十二指腸，再仔細觀察十二指腸的腸系膜，找到淡黃色的韌性很好的小管，即肝內(nèi)膽管(見圖1)。為研究不同濃度的LPS構(gòu)建大鼠肝內(nèi)膽管炎癥動物模型，本次實驗分為4組進行濃度研究對比，從中篩選出構(gòu)建肝內(nèi)膽管炎癥動物模型的最佳造模方案，空白對照組按5 mL/kg在肝內(nèi)膽管一次性注射0.9%生理鹽水，模型組A、B、C分別按5.00、2.50、1.25 mg/kg 3種不同濃度在肝內(nèi)膽管一次性注射LPS構(gòu)建大鼠肝內(nèi)膽管炎癥動物模型(見圖2)。均予常規(guī)飼料正常喂食，自來水飲食，放置于干凈飼養(yǎng)籠內(nèi)，觀察大鼠存活時間，共7 d。造模過程中對死亡的大鼠進行解剖，提取肝臟組織待后期進行病理檢測。

圖1 暴露大鼠肝內(nèi)膽管

1.2.2標本采集

用濃度為10%的水合氯醛按1 mL/200 g通過左(右)下腹部采用腹腔注射進行大鼠麻醉。分別于造模后2、4、6、8 h和7 d采集各組3只大鼠股動脈血液標本，每只2 mL。同時于造模后7 d取各組3只大鼠肝臟組織，切除右肝臟邊緣組織，大小為0.3 cm×0.5 cm，放置于甲醛溶液中浸泡待后期行病理檢測。取完標本后使用空氣栓塞方法將大鼠處死。

圖2 肝內(nèi)膽管注射LPS

1.2.3血液標本血常規(guī)、生化指標檢測

大鼠股動脈血液放入4 ℃的冰箱60 min，分別檢測白細胞計數(shù)(white blood cell,WBC)、中性粒細胞百分比(percentage of neutrophils, N%)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminortransferase,ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST)的水平變化。

1.2.4HE染色觀察大鼠肝臟組織病理特征

通過肝臟組織標本固定、脫水透明、石蠟包埋，切片厚度在4 μm，展片，撈片，烘片脫去溶化組織間隙的石蠟，將烤好的切片用彈簧夾夾好，放入全自動HE儀器中進行HE染色，取出吹干、封片，干燥后在顯微鏡下觀察肝臟組織病理切片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組存活率比較

80只大鼠共存活45只，存活率為56%。術(shù)后15 d大鼠傷口基本愈合，4組存活率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.406，P=0.001)，見表1。

表1 各組存活率比較(n=20)

2.2 結(jié)果分析

2.2.1不同時間段各組WBC、N%、ALT及AST水平比較

模型組C的WBC、N%在造模8 h，ALT、AST在造模后2、4、6、8 h較其他3組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同時間段各組WBC、N%、ALT及AST水平比較

2.2.2造模后7 d各組WBC、N%、ALT及AST水平比較

模型組C的WBC、N%、ALT及AST水平較其他3組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 造模后7 d各組WBC、N%、ALT、AST水平比較

2.2.3造模后7 d各組肝臟組織病理結(jié)果

使用LPS造模7 d后，通過HE染色，空白對照組可見完整的正常肝細胞形成，未見炎性細胞浸潤；模型組A肝血竇間隙增大，炎性細胞呈向心性浸潤；模型組B炎性細胞浸潤程度較模型組A輕；模型組C可見肝內(nèi)膽管排列紊亂，大量炎性細胞浸潤肝內(nèi)膽管，見圖3。

A：空白對照組；B：模型組A;C：模型組B；D：模型組C。

3 討 論

肝內(nèi)膽管結(jié)石是肝膽外科中最常見的疾病，給人們的健康帶來嚴重影響。目前肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病機制尚未明確，大部分學(xué)者認為其形成與肝內(nèi)膽管炎癥密切相關(guān)。LPS是革蘭陰性菌致病的重要因素之一，它可以激活機體內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞及單核吞噬細胞，誘導(dǎo)炎性因子合成和釋放[15-16]。相關(guān)研究顯示，LPS可以誘導(dǎo)動物模型發(fā)生炎性反應(yīng)，如急性肝損傷、急性肺損傷、急性腎損傷[17-19]。本實驗采用LPS構(gòu)建大鼠肝內(nèi)膽管炎癥動物模型，通過血常規(guī)、生化檢測及肝臟組織HE染色探求肝內(nèi)膽管炎癥參與結(jié)石形成的機制。在實驗中嚴格控制LPS注射劑量，有效減少了實驗動物造模過程中的死亡率，提高了造模成功率，其中模型組C的成活率較高；不同濃度LPS可致大鼠WBC、N%、ALT、AST水平升高，模型組C最明顯；肝臟病理組織可見肝內(nèi)膽管大量炎性細胞浸潤。

在造模過程中發(fā)現(xiàn)以下幾個問題：(1)LPS溶液應(yīng)儲存于硅烷化容器內(nèi)，在使用前需旋渦振蕩至少30 min，如果振蕩時間不夠，則很難看到溶液變淡黃色。LPS儲存液可進一步用無菌平衡鹽或細胞培養(yǎng)基稀釋至需要的濃度。該儲存液(1 mg/mL)可放在4 ℃保存，大約1個月穩(wěn)定。(2)每次腹腔注射前及灌胃前大鼠需禁食，麻醉時，麻醉藥需要根據(jù)大鼠體重計算精準，避免麻醉劑量過大導(dǎo)致大鼠死亡。(3)對于注射LPS的濃度，在造模過程中比較了5.00、2.50、1.25 mg/kg這3種濃度，最終通過造模致死率，總結(jié)出最佳的肝內(nèi)膽管LPS注射濃度為1.25 mg/kg。(4)所有實驗大鼠造模后，每只大鼠需要放置單獨的籠子里，避免雙方互相斗毆致死。(5)造模術(shù)口應(yīng)橫切，較好找到膽總管，術(shù)口切口不宜超過3 cm。如果切口過大會使造模后大鼠因體溫下降甚至失血過多導(dǎo)致死亡。(6)室內(nèi)溫度低于23 ℃會導(dǎo)致大鼠體溫下降或切口感染，進而傷口難愈合最后導(dǎo)致死亡。因此，要保持室內(nèi)溫度控制在23～25 ℃，濕度保持在45%～65%，有利于大鼠生存及結(jié)石的形成，使造模更容易成功[20]。

綜上所述，肝內(nèi)膽管注射1.25 mg/kg 濃度的LPS是構(gòu)建大鼠肝內(nèi)膽管炎癥動物模型的最佳濃度，本研究為肝內(nèi)膽管炎癥動物模型的構(gòu)建奠定了理論基礎(chǔ)，為相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究提供了新方法、新思路及指導(dǎo)作用。