楊婕琳 翟明慧 張凡 趙東強(qiáng)

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1．消化內(nèi)科；2．腫瘤內(nèi)科；3.病理科，河北 張家口 075000； 4.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

目前，結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)已成為第三大常見的癌癥，隨著人類生活條件和環(huán)境的不斷變化，其發(fā)病率也逐年增加，且發(fā)病人群趨于年輕化[1]。手術(shù)切除仍是該病的主要治療手段，對(duì)切除的癌癥進(jìn)行病理檢查是確定預(yù)后和指導(dǎo)輔助腫瘤治療的關(guān)鍵。研究表明，多數(shù)CRC起源于腺瘤性息肉[2]。結(jié)腸息肉是長(zhǎng)在結(jié)腸腔內(nèi)的粘膜表面的突出，在15%～20%的人群中診斷出的腸粘膜內(nèi)最常見的變化，當(dāng)結(jié)腸息肉大于10 mm時(shí)，發(fā)生癌變的可能性大大增加[3]。結(jié)腸息肉的病理類型與惡性病變之間密切關(guān)聯(lián)，近年來，關(guān)于結(jié)腸息肉的研究越來越受到重視，及時(shí)診斷和治療結(jié)腸息肉是控制和減少結(jié)腸癌發(fā)生的重要途徑[4]。然而，關(guān)于結(jié)腸息肉發(fā)生癌變的具體機(jī)制仍不清楚，以往較多的研究結(jié)果顯示，硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)不僅參與機(jī)體氧化應(yīng)激過程[5]，還通過與硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)的作用參與調(diào)控糖尿病、腎病、乳腺癌、膀胱癌、動(dòng)脈粥樣硬化以及白血病等疾病的進(jìn)程[6-8]。本研究通過觀察Trx與TXNIP在結(jié)腸息肉癌變過程中的表達(dá)及規(guī)律，以探索兩者在結(jié)腸息肉癌變中所起的作用，為后續(xù)研究腫瘤的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2019年1月～2019年10月消化內(nèi)科門診和住院患者共100例，其中男68例，女32例，年齡39～62歲，平均(49.34±5.31)歲。其中結(jié)腸息肉(結(jié)腸息肉組)20例、結(jié)腸腺瘤(結(jié)腸腺瘤組)40例、結(jié)腸癌(結(jié)腸癌組)20例以及正常結(jié)腸(正常結(jié)腸組)20例。所有患者均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①電子結(jié)腸鏡檢查，明確有結(jié)直腸息肉且病理診斷明確為結(jié)腸息肉、結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸癌。②所有患者術(shù)前均未接受過化療、放療及靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①罹患潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病及其他急慢性結(jié)腸炎患者。②非腺瘤惡變的結(jié)直腸癌患者。③罹患嚴(yán)重心腦血管疾病、血液疾病、炎癥性疾病、缺血/再灌注損傷、糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變等，不能承受內(nèi)鏡下息肉切除者。④依從性差，不能配合完成內(nèi)鏡下息肉切除者。

1.2 主要材料與試劑 Trx ELISA檢測(cè)試劑盒與TXNIP ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，HE染色試劑盒與免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天研究所，TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 以及SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司，胰島素與NADPH購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，鼠抗人Trx抗體、鼠抗人TXNIP抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，本研究使用的引物序列交由上海生工生物公司合成。

1.3 血清Trx、TXNIP含量與Trx活性測(cè)定 患者在空腹情況下通過外周靜脈采血，室溫下靜置30 min，在離心機(jī)中以4000 rpm/s離心 10 min，分離收集上清液，保存于-80℃冰箱中。通過ELISA法檢測(cè)血清Trx與TXNIP 含量，采用胰島素還原法檢測(cè)血清Trx活性，所有步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 HE染色 將采集的組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，修剪包埋，浸于梯度乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)上連續(xù)切片為厚度約4 μm的石蠟切片，采用蘇木精染色 5 min，流水沖洗多余染液，再使用伊紅染色液染色3 min，流水沖洗干凈，通過無水乙醇脫水和二甲苯中透明后，利用中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 將制備的石蠟切片脫蠟至水，使用0.01mol/L枸椽酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，加入3% H2O2溶液處理10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后加入10%羊血清工作液在室溫下封閉 30 min，接著滴加鼠抗人Trx(1∶100)、TXNIP(1∶100)作為第一抗體，置于4℃下孵育過夜。第二日，采用PBS 溶液沖洗后，滴加對(duì)應(yīng)的二抗抗體，在室溫下孵育30 min，PBS 溶液再次清洗，滴加DAB 顯色，經(jīng)過復(fù)染后，采用中性樹膠封片，在電子顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集。所有病理染色標(biāo)本均由2名病理醫(yī)師進(jìn)行判斷，蛋白陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為棕黃色至棕褐色。以陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)定，染色強(qiáng)度為未著色記 0 分；淺黃色記1分；棕黃色記2分；褐色記3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例為0%記為0分；1%～30%記為1分；31%～60%記為2分；>60%記為3分。最后將染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例相加，小于2分判定為陰性結(jié)果，大于等于2分判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將各組織在無菌條件下剪碎并研磨勻漿，根據(jù)TRIzol法提取組織的總RNA，使用NanoDrop2000 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA 的純度、濃度。通過PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)合成cDNA，接著以cDNA為模板，利用SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)各組織中Trx、TXNIP的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min(循環(huán)1次)；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s(循環(huán)40次)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平。通過Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)各基因的引物序列，Trx：上游引物5′-CATATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3′，下游引物5′-TGTCACGCAGATGGCAACTG-3′； TXNIP：上游引物5′-GACTTCGGAGTACCTGCGC-3′，下游引物5′- AAGCTCAAAGCCGAACTTGTA CTCA-3′；GAPDH：上游引物5′-TGTGAAGGTCGG TGTGAAC-3′，下游引物5′-CAGATGGTGATGGG CTGCC-3′。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清Trx、TXNIP 含量與Trx活性比較 各組患者血清Trx、TXNIP 含量與Trx活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸組比較，結(jié)腸腺瘤組與結(jié)腸癌組患者血清中Trx含量和活性均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而結(jié)腸息肉組、結(jié)腸腺瘤組與結(jié)腸癌組患者血清中的TXNIP 含量較正常結(jié)腸組明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組患者血清Trx、TXNIP含量與Trx活性比較

2.2 各組患者組織中的HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，正常結(jié)腸組組織結(jié)構(gòu)清晰完整，未見明顯異常；結(jié)腸息肉組組織表現(xiàn)出隱窩結(jié)構(gòu)擴(kuò)張，組織內(nèi)可見囊性腫物，伴黏液化，可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；結(jié)腸腺瘤組組織可見明顯的隱窩不規(guī)則的擴(kuò)張，并伴隨著不規(guī)則的分支；結(jié)腸癌組組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域較大，伴有黏膜下層炎癥現(xiàn)象，組織細(xì)胞形態(tài)受到明顯的破壞。見圖1。

圖1 HE染色觀察各組組織學(xué)特征

2.3 Trx在各組患者組織中的表達(dá)檢測(cè) 通過免疫組化染色檢測(cè)Trx在正常結(jié)腸、結(jié)腸息肉、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Trx在結(jié)腸腺瘤組和結(jié)腸癌組組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常結(jié)腸組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而結(jié)腸息肉組中Trx陽(yáng)性表達(dá)率與正常結(jié)腸組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表2。

表2 Trx在各組患者組織中的表達(dá)

圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組織中Trx表達(dá)(200×)

2.4 TXNIP在各組患者組織中的表達(dá)檢測(cè) 利用免疫組化染色檢測(cè)TXNIP在正常結(jié)腸、結(jié)腸息肉、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸組比較，結(jié)腸腺瘤組和結(jié)腸癌組組織中TXNIP陽(yáng)性表達(dá)率明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而結(jié)腸息肉組組織中TXNIP陽(yáng)性表達(dá)率與正常結(jié)腸組組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表3。

表3 TXNIP在各組患者組織中的表達(dá)

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組織中TXNIP表達(dá)(200×)

2.5 四組患者組織中Trx、TXNIP的 mRNA表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組組織中Trx、TXNIP mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸組比較，結(jié)腸息肉組、結(jié)腸腺瘤組組織以及結(jié)腸癌組組織中Trx mRNA的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，而TXNIP mRNA的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組織中Trx mRNA與TXNIP mRNA的表達(dá)

3 討論

目前，雖結(jié)直腸癌(CRC)的治療方法取得了很大進(jìn)步，但CRC死亡率仍位于所有腫瘤死亡率的第五位[1]。CRC通常采用侵入性外科手術(shù)方法去除患者的大部分癌癥組織。為了根除殘余的癌組織，在外科手術(shù)后經(jīng)常使用放射療法或化學(xué)療法輔以治療[9-10]，雖患者的預(yù)后得到了較大改善，但癌細(xì)胞終會(huì)對(duì)化學(xué)治療劑產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致這些治療方案的失敗[11]。因此，從分子層面尋找關(guān)鍵部位的有效靶點(diǎn)，對(duì)于揭示驅(qū)動(dòng)CRC進(jìn)展的機(jī)制以及CRC患者獲得更好治療和改善預(yù)后奠定了基礎(chǔ)。

結(jié)腸息肉是結(jié)腸和直腸上皮上形成的增生組織，屬于消化道中常見的疾病類型，其形成與多種因素相關(guān)，主要包括遺傳、環(huán)境、飲食以及生活習(xí)慣[3]。結(jié)腸息肉多無明顯癥狀，常在體檢或結(jié)腸鏡檢時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，部分病例可表現(xiàn)為便血、粘液便腸梗阻、息肉脫垂等癥狀[12]。結(jié)腸息肉可分為非腫瘤性息肉(增生性、炎癥性)和腫瘤性息肉(腺瘤性息肉)，非腫瘤性息肉發(fā)生癌變的幾率較小，而腺瘤性息肉惡變的幾率較高。據(jù)研究[13]顯示，息肉的各種分子變化可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，大約三分之二的結(jié)腸息肉是腺瘤性癌前病變。腺瘤根據(jù)其組織學(xué)特點(diǎn)分為管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、管狀絨毛腺瘤和鋸齒狀腺瘤四種，約80%的結(jié)腸癌由結(jié)腸腺瘤演變而來，結(jié)腸腺瘤演變成為結(jié)腸癌歷時(shí)5～10年[14]，患者生存率與腫瘤的檢出時(shí)間密切相關(guān)，5年生存率在早期患者中可高達(dá)90%以上，而在晚期患者中僅為5%左右，然而超過約50%的患者確診時(shí)已出現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[15]。關(guān)于結(jié)直腸腺瘤發(fā)生和惡變的病因及確切機(jī)制至今仍未完全明確，腺瘤癌變是一個(gè)多基因變化與多階段綜合作用累積的復(fù)雜過程。

硫氧還蛋白系統(tǒng)是一類具有氧化還原活性的小分子蛋白系統(tǒng)，由還原的底物硫氧還蛋白(Trx)、還原型輔酶(NADPH)和硫氧還蛋白還原酶(TRXR)組成，在TRXR催化下，將還原當(dāng)量從還原的底物轉(zhuǎn)移至Trx，Trx通過二硫醇-二硫鍵交換將還原劑分配至選定的靶標(biāo)，從而導(dǎo)致靶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能修飾能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)、激活轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)以及抑制細(xì)胞凋亡等功能[5,16]。Trx作為具有氧化還原活性的二硫化物低分子量蛋白質(zhì)，多項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Trx在腫瘤細(xì)胞中的功能隨著腫瘤發(fā)展階段的不同而不同，一旦細(xì)胞發(fā)生惡性變異，Trx表現(xiàn)出促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及抗凋亡的功能，加速腫瘤進(jìn)展，并與腫瘤血管形成和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散密切相關(guān)[17]。如Zhou 等[18]研究表明了Trx表達(dá)在急性髓細(xì)胞性白血病患者和急性淋巴細(xì)胞性白血病患者中均被上調(diào)，此外白血病細(xì)胞系THP-1、U937和MOLM-13細(xì)胞中c-Jun激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1(Jab1)和Trx蛋白表達(dá)水平也均升高。Lu等[19]通過研究表明了在結(jié)腸癌細(xì)胞中Trx系統(tǒng)通過活化NF-κB途徑從而上調(diào)Bcl-2、CyclinD1等促進(jìn)腫瘤進(jìn)程相關(guān)基因的表達(dá)。硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)屬于硫氧還蛋白結(jié)合蛋白的家族成員，作為Trx的配體蛋白，能夠負(fù)向調(diào)節(jié)Trx的功能，促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生與積聚，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)或細(xì)胞凋亡的發(fā)生[20]。研究表明，血管炎癥性疾病、缺血/再灌注損傷、糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變等疾病的發(fā)生與 TXNIP 表達(dá)的上調(diào)密切相關(guān)，而在多種腫瘤疾病中TXNIP 表達(dá)明顯降低[21-22]。關(guān)于硫氧還蛋白及硫氧還蛋白相互作用蛋白在腫瘤疾病例如肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌等已有研究，而這兩種腫瘤相關(guān)性因子在結(jié)直腸腺瘤以及癌變過程中起到的作用未見報(bào)道，本研究結(jié)果表明，結(jié)腸腺瘤患者與結(jié)腸癌患者血清中Trx含量與Trx活性明顯升高， TXNIP 含量明顯下降，同時(shí)，結(jié)腸息肉組織、結(jié)腸腺瘤組織以及結(jié)腸癌組織中Trx、TXNIP的表達(dá)水平也呈不同程度的上調(diào)與下調(diào)。由此說明，Trx與TXNIP可能參與了結(jié)腸息肉的癌變過程。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸息肉癌變中Trx異常高表達(dá)而TXNIP表達(dá)降低，兩者可能都參與了結(jié)腸癌變。本結(jié)果為結(jié)腸息肉癌變的分子機(jī)制研究提供了新思路，并為多指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者的預(yù)后和治療效果提供了科學(xué)依據(jù)。