王友強 蘭由玉 李世勇 黃曉玲

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，四川 瀘州 646000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是最普遍的自身免疫性疾病之一，可影響手足的小關(guān)節(jié)，引起患者關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及僵硬，并逐漸導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能障礙及殘疾[1]。成纖維樣滑膜細胞(FLS)是構(gòu)成滑膜內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的主要細胞類型，滑膜內(nèi)膜結(jié)構(gòu)是RA發(fā)展和進程中的決定性因素之一，F(xiàn)LS參與RA的炎癥和關(guān)節(jié)破壞，且炎癥的發(fā)生是導(dǎo)致關(guān)節(jié)和骨骼進行性損傷的主要原因[2-3]。CCR5是一種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，CCR5與其相應(yīng)的配體結(jié)合后可通過調(diào)節(jié)WBC的活化和定向遷移來調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)[4-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)CCR5參與了包括RA、骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機制[6-7]?；細胞中的CCR5水平升高，并與RA的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8]，但關(guān)于CCR5具體的作用機制研究目前報道甚少。因此，本研究擬通過RNA干擾技術(shù)抑制RA大鼠中CCR5的表達，以探討沉默CCR5對RA大鼠滑膜細胞炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠30只，體重(170±6)g，購買于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗通過了西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 實驗材料 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (美國Invitrogen公司)，弗氏完全佐劑(CFA)(美國Sigma公司)，Trizol Reagent(日本Takara公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)，大鼠TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3 ELISA試劑盒(上海吉泰依科賽生物科技有限公司)，CCR5抗體(英國Abcam公司)，二抗(兔抗羊IgG)(英國Abcam公司)，PCR試劑盒(日本Takara公司)，CCR5 siRNA(3條)和NC siRNA(1條)序列由GeneChem公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA載體構(gòu)建 將事先設(shè)計好的大鼠CCR5 siRNA(3條)和NC siRNA(1條)序列(見表1)經(jīng)處理后構(gòu)建成pU6-siRNA-GFP載體(均由GeneChem公司完成)，再通過Lipofectamine 2000將載體轉(zhuǎn)入大鼠滑膜細胞，操作按照說明書進行。轉(zhuǎn)染完成48h后檢測細胞CCR5 mRNA的水平以判斷轉(zhuǎn)染效率，選取效率最佳的一條進行后續(xù)實驗。

表1 CCR5 siRNA序列

1.2.2 RA大鼠模型構(gòu)建 SPF級Wistar雄鼠30只飼養(yǎng)1周后隨機分為control(WC)組(10只)與RA模型組(20只)。用膠原蛋白誘導(dǎo)法構(gòu)建RA大鼠模型，具體方法為：將Ⅱ型膠原蛋白充分溶解于濃度為0.1 mmol/L的醋酸溶液中，然后再將相同劑量的弗氏完全佐劑(Complete Freund’s adjuvant，CFA)充分與上述混合液一起混勻，最后放置在冰浴中待其完全乳化；用注射器在Wistar雄鼠尾根部多處注射，同樣的方法再于1周后重復(fù)操作一次；Control組的Wistar雄鼠可以在同樣的時間、同樣的部位僅注射Ⅱ型膠原蛋白0.2 mg。采用關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)(Arthritis index，AI)評分法評估RA大鼠模型是否構(gòu)建成功，AI≥4分提示造模成功，每隔5天觀察一次，四肢評分標準，見表2。

表2 AI評分標準

1.2.3 滑膜細胞的分離與培養(yǎng) 用6 g/L的Ⅱ型膠原酶處理滑膜組織，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化3 h；再將細胞團用2.5 g/L的胰蛋白酶消化5 min；離心棄上清，將得到的細胞重新懸浮于含1.5 mL/L胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3～5天。使用臺盼藍初步判斷細胞的存活率，若存活率大于95%，可供后續(xù)實驗使用。第7d，經(jīng)2.5 g/L的胰酶-EDTA消化傳代細胞，取3代的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4 滑膜細胞的轉(zhuǎn)染與分組 在轉(zhuǎn)染前24h，將待轉(zhuǎn)染的大鼠滑膜細胞以2×105細胞/mL的密度鋪于6孔板內(nèi)；每孔添加500 μL不含抗生素的完全培養(yǎng)液，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h后，待細胞匯合達50%即可用于轉(zhuǎn)染。將細胞分為4組：RA組(RA大鼠滑膜細胞)、RA+NC組(加入脂質(zhì)體包裹的NC siRNA)、RA+mock組(加入脂質(zhì)體)、RA+siRNA組(加入脂質(zhì)體包裹的CCR5 siRNA)。轉(zhuǎn)染前更換細胞培養(yǎng)基(37℃預(yù)溫)，用250 μL不含血清培養(yǎng)基OPti-MEM 稀釋100 pmol mock、siRNA(終濃度50 nM)及5 μL liPofectamin2000，輕輕混勻并室溫孵育5min后加入6孔板中輕搖，常溫放置20min；再在6孔板中添加含10% 血清的細胞培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2放置6～8 h后，換完全培養(yǎng)基，持續(xù)放置48 h后獲取細胞。

1.2.5 CCR5及炎癥因子mRNA水平測定 各組滑膜細胞用Trizol法提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以GAPDH為內(nèi)參基因，將cDNA進行PCR擴增，引物序列[9-12]參考文獻資料并由公司合成，見表3。

表3 引物序列

1.2.6 CCR5蛋白水平測定 滑膜細胞以2×105個/mL的濃度平鋪于6孔板培養(yǎng)72h，加入蛋白裂解液提取蛋白，再利用10% SDS分離膠與濃縮膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，滴加稀釋的一抗兔抗鼠CCR5，4℃孵育過夜；加入二抗37 ℃振蕩孵育l h后用化學(xué)發(fā)光儀檢測。

1.2.7 ELISA檢測炎性因子的表達 收集各組細胞上清液，分別按照大鼠TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3 ELISA試劑盒操作說明書檢測TNF-α、IL-6、MMP-1和MMP-3的水平，最后用酶標儀在450 nm下測試待檢品OD值，每個實驗樣本均設(shè)有復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 RA大鼠模型鑒定 在給大鼠注射CFA 8小時后，RA組大鼠在注射一側(cè)足趾部位出現(xiàn)紅腫等關(guān)節(jié)炎癥的表現(xiàn)，24 h出現(xiàn)足踝部腫脹。10天后RA模型大鼠表現(xiàn)出多關(guān)節(jié)炎，具體為前肢或?qū)?cè)肢體甚至耳、尾均有前面所述的炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)。皮毛暗沉，有部分褪毛現(xiàn)象，體重下降，食欲減退，活動量減少，甚至有脫皮、潰瘍和結(jié)節(jié)。與Control組比較，RA模型組大鼠在10天時AI(1.21±0.73)明顯升高(P<0.05)；分別與 10d、15d時AI比較，25 d時AI(7.12±1.13)進一步增高(P<0.05)，且AI隨著時間的增加而升高。而Control組大鼠無關(guān)節(jié)炎癥等表現(xiàn)。由此可見RA大鼠模型構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 RA模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染大鼠滑膜細胞48h后，qRT-PCR測定CCR5 mRNA表達水平，3條siRNA序列轉(zhuǎn)染后均可引起CCR5 mRNA明顯下降(P<0.05)，其中CCR5 siRNA-2序列轉(zhuǎn)染效率較CCR5 siRNA-1和CCR5 siRNA-3更高(見圖2)。因此本研究選用CCR5 siRNA-2序列為最終實驗所用序列，進行后續(xù)研究。

圖2 CCR5 siRNA序列轉(zhuǎn)染效率(n=3)

2.3 沉默CCR5對CCR5 mRNA和蛋白水平的影響 與RA組相比，RA+siRNA組CCR5 mRNA和蛋白水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而RA+NC組、RA+mock組與RA組比較無明顯變化(P>0.05)，見圖3。

圖3 各組滑膜細胞CCR5 mRNA和蛋白表達情況

2.4 CCR5基因沉默對RA大鼠滑膜細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響 與RA組相比，RA+siRNA組TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3 mRNA水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，RA+NC組、RA+mock組與RA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4。

圖4 各組滑膜細胞炎癥因子mRNA相對表達水平

2.5 CCR5基因沉默對RA大鼠滑膜細胞炎癥因子蛋白水平的影響 ELISA方法測定各組細胞上清液炎癥因子的水平示：與RA組對比，RA+siRNA組TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而RA+NC組、RA+mock組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠滑膜細胞TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3水平

3 討論

RA是一種嚴重的慢性自身免疫性疾病，影響世界1%的人口[13]?；罨幕ぜ毎c滑膜組織的增生以及促炎細胞因子(尤其是IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-17)、MMPs和趨化因子的產(chǎn)生有關(guān)，且這些因子介導(dǎo)了RA的關(guān)節(jié)炎癥[14]并可降解軟骨，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[15-16]。

CCR5與相應(yīng)的趨化因子結(jié)合后，具有調(diào)節(jié)細胞活化和遷移的能力[17]，并且CCR5還可通過調(diào)節(jié)白細胞的趨化活性參與免疫和炎癥反應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，滑膜T細胞中的CCR5水平升高，其基因中的32 bp缺失與RA的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[8]。由既往的研究可知，CCR5在RA的疾病進展中起了作用，因此，抑制CCR5的表達可能成為RA治療的一種新途徑。

將事先設(shè)計好的的3條CCR5 siRNA序列轉(zhuǎn)染RA大鼠滑膜細胞后，利用qRT-PCR測定CCR5 mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3條siRNA序列均可引起CCR5表達下降，但CCR5 siRNA-2序列轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于CCR5 siRNA-1和CCR5 siRNA-3，因此本研究選擇CCR5 siRNA-2序列用于后續(xù)研究。

本研究利用RNA干擾技術(shù)抑制CCR5的表達后，觀察其對各組滑膜細胞炎癥因子的影響，以此探討CCR5在 RA大鼠滑膜細胞炎癥反應(yīng)中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與RA組比較，RA+siRNA組CCR5及TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3 mRNA和蛋白水平均顯著降低，而RA+NC組、RA+mock組無明顯差別。由此可見，CCR5基因沉默可有效抑制RA大鼠滑膜細胞CCR5的表達，并可降低滑膜細胞所產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3的水平，從而減輕滑膜細胞的炎癥反應(yīng)。 CCR5的下調(diào)與TNF-α的生成減少和抗炎因子IL-10的上調(diào)密切相關(guān)[18]；且CCR5的下調(diào)還可導(dǎo)致MMP-2和MMP-3的減少[19]，這與我們的研究結(jié)果一致。

TNF-α是RA中一種關(guān)鍵的促炎細胞因子，是多種慢性炎癥疾病的主要治療靶點[20]；同時TNF-α還是可以直接增加骨骼吸收的主要炎癥細胞因子，骨丟失是RA的新興關(guān)節(jié)外表現(xiàn)之一[21]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)炎癥作用的TNF-α和IL-6與RA的發(fā)展密切相關(guān)，其中IL-6是RA發(fā)病機制中的主要參與者[22]。MMP是RA-FLS分泌的一類鋅依賴性蛋白水解酶，在RA關(guān)節(jié)破壞中扮演重要角色[23]。TNF-α等可增加MMPs產(chǎn)生，特別是MMP-1、MMP-3，其中MMP-3還與骨侵蝕有關(guān)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[24-26]。RA的滑膜細胞中還發(fā)現(xiàn)了IL-6、MMP-1和MMP-3的上調(diào)[27]，與本研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

CCR5基因沉默可抑制CCR5的表達，并有助于降低RA大鼠滑膜細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3的水平，減輕大鼠滑膜細胞炎癥反應(yīng)，為RA的治療提供了新的方向和治療靶點，但關(guān)于CCR5在RA中的具體作用機制還需要在后續(xù)研究中進一步論證。