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        CCR5基因沉默對RA大鼠滑膜細胞炎癥反應(yīng)的影響*

        2021-09-28 03:08:14王友強蘭由玉李世勇黃曉玲
        西部醫(yī)學(xué) 2021年9期
        關(guān)鍵詞:水平實驗

        王友強 蘭由玉 李世勇 黃曉玲

        (1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗科,四川 瀘州 646000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,四川 瀘州 646000)

        類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是最普遍的自身免疫性疾病之一,可影響手足的小關(guān)節(jié),引起患者關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及僵硬,并逐漸導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能障礙及殘疾[1]。成纖維樣滑膜細胞(FLS)是構(gòu)成滑膜內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的主要細胞類型,滑膜內(nèi)膜結(jié)構(gòu)是RA發(fā)展和進程中的決定性因素之一,F(xiàn)LS參與RA的炎癥和關(guān)節(jié)破壞,且炎癥的發(fā)生是導(dǎo)致關(guān)節(jié)和骨骼進行性損傷的主要原因[2-3]。CCR5是一種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR),CCR5與其相應(yīng)的配體結(jié)合后可通過調(diào)節(jié)WBC的活化和定向遷移來調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)[4-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)CCR5參與了包括RA、骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機制[6-7]?;細胞中的CCR5水平升高,并與RA的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8],但關(guān)于CCR5具體的作用機制研究目前報道甚少。因此,本研究擬通過RNA干擾技術(shù)抑制RA大鼠中CCR5的表達,以探討沉默CCR5對RA大鼠滑膜細胞炎癥反應(yīng)的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物與材料

        1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠30只,體重(170±6)g,購買于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,實驗通過了西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

        1.1.2 實驗材料 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (美國Invitrogen公司),弗氏完全佐劑(CFA)(美國Sigma公司),Trizol Reagent(日本Takara公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司),大鼠TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3 ELISA試劑盒(上海吉泰依科賽生物科技有限公司),CCR5抗體(英國Abcam公司),二抗(兔抗羊IgG)(英國Abcam公司),PCR試劑盒(日本Takara公司),CCR5 siRNA(3條)和NC siRNA(1條)序列由GeneChem公司設(shè)計合成。

        1.2 方法

        1.2.1 siRNA載體構(gòu)建 將事先設(shè)計好的大鼠CCR5 siRNA(3條)和NC siRNA(1條)序列(見表1)經(jīng)處理后構(gòu)建成pU6-siRNA-GFP載體(均由GeneChem公司完成),再通過Lipofectamine 2000將載體轉(zhuǎn)入大鼠滑膜細胞,操作按照說明書進行。轉(zhuǎn)染完成48h后檢測細胞CCR5 mRNA的水平以判斷轉(zhuǎn)染效率,選取效率最佳的一條進行后續(xù)實驗。

        表1 CCR5 siRNA序列

        1.2.2 RA大鼠模型構(gòu)建 SPF級Wistar雄鼠30只飼養(yǎng)1周后隨機分為control(WC)組(10只)與RA模型組(20只)。用膠原蛋白誘導(dǎo)法構(gòu)建RA大鼠模型,具體方法為:將Ⅱ型膠原蛋白充分溶解于濃度為0.1 mmol/L的醋酸溶液中,然后再將相同劑量的弗氏完全佐劑(Complete Freund’s adjuvant,CFA)充分與上述混合液一起混勻,最后放置在冰浴中待其完全乳化;用注射器在Wistar雄鼠尾根部多處注射,同樣的方法再于1周后重復(fù)操作一次;Control組的Wistar雄鼠可以在同樣的時間、同樣的部位僅注射Ⅱ型膠原蛋白0.2 mg。采用關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)(Arthritis index,AI)評分法評估RA大鼠模型是否構(gòu)建成功,AI≥4分提示造模成功,每隔5天觀察一次,四肢評分標準,見表2。

        表2 AI評分標準

        1.2.3 滑膜細胞的分離與培養(yǎng) 用6 g/L的Ⅱ型膠原酶處理滑膜組織,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化3 h;再將細胞團用2.5 g/L的胰蛋白酶消化5 min;離心棄上清,將得到的細胞重新懸浮于含1.5 mL/L胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3~5天。使用臺盼藍初步判斷細胞的存活率,若存活率大于95%,可供后續(xù)實驗使用。第7d,經(jīng)2.5 g/L的胰酶-EDTA消化傳代細胞,取3代的細胞用于后續(xù)實驗。

        1.2.4 滑膜細胞的轉(zhuǎn)染與分組 在轉(zhuǎn)染前24h,將待轉(zhuǎn)染的大鼠滑膜細胞以2×105細胞/mL的密度鋪于6孔板內(nèi);每孔添加500 μL不含抗生素的完全培養(yǎng)液,放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h后,待細胞匯合達50%即可用于轉(zhuǎn)染。將細胞分為4組:RA組(RA大鼠滑膜細胞)、RA+NC組(加入脂質(zhì)體包裹的NC siRNA)、RA+mock組(加入脂質(zhì)體)、RA+siRNA組(加入脂質(zhì)體包裹的CCR5 siRNA)。轉(zhuǎn)染前更換細胞培養(yǎng)基(37℃預(yù)溫),用250 μL不含血清培養(yǎng)基OPti-MEM 稀釋100 pmol mock、siRNA(終濃度50 nM)及5 μL liPofectamin2000,輕輕混勻并室溫孵育5min后加入6孔板中輕搖,常溫放置20min;再在6孔板中添加含10% 血清的細胞培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2放置6~8 h后,換完全培養(yǎng)基,持續(xù)放置48 h后獲取細胞。

        1.2.5 CCR5及炎癥因子mRNA水平測定 各組滑膜細胞用Trizol法提取總RNA,并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以GAPDH為內(nèi)參基因,將cDNA進行PCR擴增,引物序列[9-12]參考文獻資料并由公司合成,見表3。

        表3 引物序列

        1.2.6 CCR5蛋白水平測定 滑膜細胞以2×105個/mL的濃度平鋪于6孔板培養(yǎng)72h,加入蛋白裂解液提取蛋白,再利用10% SDS分離膠與濃縮膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜,滴加稀釋的一抗兔抗鼠CCR5,4℃孵育過夜;加入二抗37 ℃振蕩孵育l h后用化學(xué)發(fā)光儀檢測。

        1.2.7 ELISA檢測炎性因子的表達 收集各組細胞上清液,分別按照大鼠TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3 ELISA試劑盒操作說明書檢測TNF-α、IL-6、MMP-1和MMP-3的水平,最后用酶標儀在450 nm下測試待檢品OD值,每個實驗樣本均設(shè)有復(fù)孔。

        2 結(jié)果

        2.1 RA大鼠模型鑒定 在給大鼠注射CFA 8小時后,RA組大鼠在注射一側(cè)足趾部位出現(xiàn)紅腫等關(guān)節(jié)炎癥的表現(xiàn),24 h出現(xiàn)足踝部腫脹。10天后RA模型大鼠表現(xiàn)出多關(guān)節(jié)炎,具體為前肢或?qū)?cè)肢體甚至耳、尾均有前面所述的炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)。皮毛暗沉,有部分褪毛現(xiàn)象,體重下降,食欲減退,活動量減少,甚至有脫皮、潰瘍和結(jié)節(jié)。與Control組比較,RA模型組大鼠在10天時AI(1.21±0.73)明顯升高(P<0.05);分別與 10d、15d時AI比較,25 d時AI(7.12±1.13)進一步增高(P<0.05),且AI隨著時間的增加而升高。而Control組大鼠無關(guān)節(jié)炎癥等表現(xiàn)。由此可見RA大鼠模型構(gòu)建成功。見圖1。

        圖1 RA模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)

        2.2 siRNA轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染大鼠滑膜細胞48h后,qRT-PCR測定CCR5 mRNA表達水平,3條siRNA序列轉(zhuǎn)染后均可引起CCR5 mRNA明顯下降(P<0.05),其中CCR5 siRNA-2序列轉(zhuǎn)染效率較CCR5 siRNA-1和CCR5 siRNA-3更高(見圖2)。因此本研究選用CCR5 siRNA-2序列為最終實驗所用序列,進行后續(xù)研究。

        圖2 CCR5 siRNA序列轉(zhuǎn)染效率(n=3)

        2.3 沉默CCR5對CCR5 mRNA和蛋白水平的影響 與RA組相比,RA+siRNA組CCR5 mRNA和蛋白水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而RA+NC組、RA+mock組與RA組比較無明顯變化(P>0.05),見圖3。

        圖3 各組滑膜細胞CCR5 mRNA和蛋白表達情況

        2.4 CCR5基因沉默對RA大鼠滑膜細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響 與RA組相比,RA+siRNA組TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3 mRNA水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),RA+NC組、RA+mock組與RA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4。

        圖4 各組滑膜細胞炎癥因子mRNA相對表達水平

        2.5 CCR5基因沉默對RA大鼠滑膜細胞炎癥因子蛋白水平的影響 ELISA方法測定各組細胞上清液炎癥因子的水平示:與RA組對比,RA+siRNA組TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3水平顯著下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而RA+NC組、RA+mock組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表4。

        表4 各組大鼠滑膜細胞TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3水平

        3 討論

        RA是一種嚴重的慢性自身免疫性疾病,影響世界1%的人口[13]?;罨幕ぜ毎c滑膜組織的增生以及促炎細胞因子(尤其是IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-17)、MMPs和趨化因子的產(chǎn)生有關(guān),且這些因子介導(dǎo)了RA的關(guān)節(jié)炎癥[14]并可降解軟骨,最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[15-16]。

        CCR5與相應(yīng)的趨化因子結(jié)合后,具有調(diào)節(jié)細胞活化和遷移的能力[17],并且CCR5還可通過調(diào)節(jié)白細胞的趨化活性參與免疫和炎癥反應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn),滑膜T細胞中的CCR5水平升高,其基因中的32 bp缺失與RA的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[8]。由既往的研究可知,CCR5在RA的疾病進展中起了作用,因此,抑制CCR5的表達可能成為RA治療的一種新途徑。

        將事先設(shè)計好的的3條CCR5 siRNA序列轉(zhuǎn)染RA大鼠滑膜細胞后,利用qRT-PCR測定CCR5 mRNA表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3條siRNA序列均可引起CCR5表達下降,但CCR5 siRNA-2序列轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于CCR5 siRNA-1和CCR5 siRNA-3,因此本研究選擇CCR5 siRNA-2序列用于后續(xù)研究。

        本研究利用RNA干擾技術(shù)抑制CCR5的表達后,觀察其對各組滑膜細胞炎癥因子的影響,以此探討CCR5在 RA大鼠滑膜細胞炎癥反應(yīng)中的作用。本研究發(fā)現(xiàn),與RA組比較,RA+siRNA組CCR5及TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3 mRNA和蛋白水平均顯著降低,而RA+NC組、RA+mock組無明顯差別。由此可見,CCR5基因沉默可有效抑制RA大鼠滑膜細胞CCR5的表達,并可降低滑膜細胞所產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3的水平,從而減輕滑膜細胞的炎癥反應(yīng)。 CCR5的下調(diào)與TNF-α的生成減少和抗炎因子IL-10的上調(diào)密切相關(guān)[18];且CCR5的下調(diào)還可導(dǎo)致MMP-2和MMP-3的減少[19],這與我們的研究結(jié)果一致。

        TNF-α是RA中一種關(guān)鍵的促炎細胞因子,是多種慢性炎癥疾病的主要治療靶點[20];同時TNF-α還是可以直接增加骨骼吸收的主要炎癥細胞因子,骨丟失是RA的新興關(guān)節(jié)外表現(xiàn)之一[21]。目前,已有研究發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)炎癥作用的TNF-α和IL-6與RA的發(fā)展密切相關(guān),其中IL-6是RA發(fā)病機制中的主要參與者[22]。MMP是RA-FLS分泌的一類鋅依賴性蛋白水解酶,在RA關(guān)節(jié)破壞中扮演重要角色[23]。TNF-α等可增加MMPs產(chǎn)生,特別是MMP-1、MMP-3,其中MMP-3還與骨侵蝕有關(guān),從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[24-26]。RA的滑膜細胞中還發(fā)現(xiàn)了IL-6、MMP-1和MMP-3的上調(diào)[27],與本研究結(jié)果一致。

        4 結(jié)論

        CCR5基因沉默可抑制CCR5的表達,并有助于降低RA大鼠滑膜細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、MMP-1、MMP-3的水平,減輕大鼠滑膜細胞炎癥反應(yīng),為RA的治療提供了新的方向和治療靶點,但關(guān)于CCR5在RA中的具體作用機制還需要在后續(xù)研究中進一步論證。

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