倪換娟 周維 李廣瑩 曲長紅 裴麗鵬

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平院區(qū),遼寧 沈陽 110000)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其快速增長的發(fā)病率引起人們的高度關(guān)注[1]。其在絕經(jīng)前后婦女中是發(fā)病率最高的癌癥[2]。腫瘤細胞的研究日益受到重視，對子宮內(nèi)膜癌細胞的研究可以深入了解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機制，為臨床治療提供新的方向。

環(huán)狀RNA是一類新的內(nèi)源性非編碼RNA，其特點是其共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)沒有5′帽或3′ poly A尾[3]。雖然環(huán)狀RNA產(chǎn)生和功能的機制尚不完全清楚，但最近的研究表明，環(huán)狀RNA可能作為疾病診斷和治療的潛在分子標志物，在人類疾病的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用，尤其是在腫瘤中[4]。近年來，關(guān)于環(huán)狀RNA在子宮內(nèi)膜癌中的研究有少量報道。Shen等結(jié)果顯示，circ_0002577通過調(diào)控miR-197/CTNND1[5]軸及激活Wnt/β-catenin通路促進子宮內(nèi)膜癌進展。Liu等[6]報告稱，circ_0061140通過調(diào)節(jié)miR-149-5p/STAT3促進子宮內(nèi)膜癌進展。Zong等[7]的研究指出，circ_PUM1通過靶向miR-136/NOTCH2通路促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[7]。還有研究表明，circTNFRSF21通過調(diào)控miR-1227-MAPK13/ATF2軸促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制[8]。然而，環(huán)狀RNA MYLK對子宮內(nèi)膜癌的作用還未見報道。本研究探討子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞生長、凋亡、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 HEC-1A細胞(人子宮內(nèi)膜腺癌細胞)購自武漢Procell公司；10%胎牛血清購自美國Gibco公司；Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基、SYBR Green Master Mix購自美國Thermo Fisher公司；GV248 干擾載體購自中國吉凱基因公司；Lipofectamine?2000、Superscript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Invitrogen公司；RNA purification system購自德國Qiagen公司；DNase-I購自瑞士Roche公司；隨機六聚體購自美國Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶、Giemsa染色液、10 mg/mL RnaseA、碘化丙啶、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、羊抗兔IgG-HRP、1%結(jié)晶紫、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；抗體E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH、Ki67，SignalStain?Boost IHC檢測試劑、SignalStain DAB Substrate Kit購自美國CST公司。ABI Prism 7000系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司； C6流式細胞儀購自美國BD公司；E100光學顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 實驗動物 選取20只7周齡清潔級雄性BALB/c裸小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。實驗動物生產(chǎn)許可證號 ：SCXK(京)2018-0002。飼養(yǎng)溫度18～25℃，濕度50%～70%。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) HEC-1A細胞保存于含10%胎牛血清(FBS)，37℃，含5% CO2的濕化培養(yǎng)箱中，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。

1.3.2 MYLK干擾實驗 選擇三種shRNA：shRNA1、shRNA2、shRNA3用來干擾circMYLK基因。分為對照組、shRNA-NC組、circMYLK- shRNA1組、circMYLK-shRNA2組和circMYLK-shRNA3組。circMYLK-shRNAs是針對circMYLK基因設(shè)計的(NC_000003.12)；采用RT-PCR檢測干擾效率。將特異性shRNAs克隆到GV248 干擾載體中。綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒載體作為陰性對照。慢病毒通過Lipofectamine?2000(將慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEC-1A細胞。轉(zhuǎn)染48h后，收集并濃縮含有慢病毒的細胞上清液，校準病毒效價。慢病毒的最終濃度為4×108TU/mL，儲存于-80℃。

1.3.3 異種移植瘤裸鼠模型 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。將轉(zhuǎn)染shRNA-NC和MYLK-shRNA1的HEC-1A細胞皮下注射至右大腿形成異種移植瘤。將小鼠分為shRNA-NC組和MYLK-shRNA1組，每組各10只。分別于第5、10、15、20、25、30天測定腫瘤體積。注射后30天測定腫瘤重量。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(體重200 mg/kg)安樂死。為后續(xù)實驗收集腫瘤。所有實驗都是根據(jù)動物實驗3R原則制定的，并且得到了醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.3.4 RT-qPCR法 總RNA用RNA purification system提取。用DNase-I去除基因組DNA。用Superscript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機六聚體從5 mg總RNA中制備cDNA。對于qRT-PCR，在ABI Prism 7000系統(tǒng)中，使用SYBR Green Master Mix和引物在優(yōu)化濃度下測定基因表達。檢測基因的引物如下：MYLK正向引物 5′- CAGTGCATGCTGTTTGTTCA-3′，反向引物 5′-TCGGAGCCTTGACTTCCAG-3′；內(nèi)參基因GAPDH正向引物5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3′ ，反向引物5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′。每個基因均生成標準曲線，擴增效率為90%～100%。通過閾值比較，確定基因表達的相對定量。所有結(jié)果均以GAPDH為基準進行歸一化。

1.3.5 克隆形成實驗 將對照組、shRNA-NC組及MYLK-shRNA1組的HEC-1A細胞接種于6孔板中，每孔200個細胞，連續(xù)接種7天。廢棄培養(yǎng)基，每個孔用PBS仔細洗兩次。將菌落在甲醇中固定20min，然后用Giemsa染色液染色。統(tǒng)計≥50個細胞的菌落數(shù)，計算菌落形成效率：菌落百分比=菌落形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.3.6 流式細胞術(shù) 用胰蛋白酶消化HEC-1A細胞，用70%乙醇在4°C下過夜固定細胞。然后加入10 mg/mL RnaseA和碘化丙啶于4℃染色過夜。使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒按照說明書使用流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)檢測細胞凋亡率。AnnexinV-FITC(-)/PI(-)(左下)為正常細胞，AnnexinV-FITC (+)/PI(-)細胞(右下)為早期凋亡細胞，AnnexinV-FITC(+)/PI(+)(右上)為晚期凋亡細胞。AnnexinV(-)/PI(+)(左上)為壞死細胞。所有實驗重復三次。

1.3.7 Transwell實驗 HEC-1A細胞經(jīng)胰蛋白酶處理后，接種于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，細胞數(shù)為3×104個/孔。培養(yǎng)24小時后，用棉簽將上層殘留的細胞取出。遷移后的細胞在室溫下用95%乙醇固定，然后用1%結(jié)晶紫染色。在光學顯微鏡下觀察每個孔的五個隨機區(qū)域的染色情況。

1.3.8 Western Blot法 用10% SDS-PAGE分離細胞和腫瘤中的蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在被5%脫脂牛奶封閉后，蛋白質(zhì)與第一抗體在4℃下孵育過夜。主要抗體如下：E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH。PBS洗滌，羊抗兔IgG-HRP(索萊寶)孵育1h。用ECL化學發(fā)光檢測試劑盒觀察這些條帶。

1.3.9 免疫組化法 脫蠟、復水、修復后，用5%正常山羊血清封閉石蠟切片1h，與抗體共培養(yǎng)過夜：Ki67和Vimentin。切片用TBST沖洗，與SignalStain?Boost IHC檢測試劑室溫下孵育30分鐘。切片用SignalStain DAB Substrate Kit染色，在E100光學顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 shRNAs抑制circMYLK表達的干擾效率檢測 設(shè)計circMYLK-shRNA1、circMYLK-shRNA2和circMYLK-shRNA3分別轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞，RT-qPCR檢測干擾效率。與對照組(0.99±0.06)比較，circMYLK-shRNA1組 (0.08±0.05)、circMYLK-shRNA2組 (0.48±0.08)和circMYLK-shRNA3 組(0.30±0.07)的MYLK表達均顯著下調(diào)(P<0.05)，其中circMYLK-shRNA1組干擾效果最佳，因此選用shRNA1進行后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 shRNAs抑制circMYLK表達的干擾效率檢測(n=3)

2.2 MYLK干擾對HEC-1A細胞克隆形成的影響 與對照組(48.8±11.2)比較，circMYLK-shRNA1組(11.46±5.89)的克隆形成率顯著降低(P<0.05)?？梢?，干擾MYLK能抑制HEC-1A細胞的克隆形成，見圖2。

圖2 MYLK干擾對HEC-1A細胞克隆形成的影響

2.3 MYLK干擾對HEC-1A細胞凋亡的影響 與對照組(5.16±2.92)比較，circMYLK-shRNA1組(29.44±6.22)的細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)?？梢姡蓴_MYLK能促進HEC-1A細胞的凋亡，見圖3。

圖3 MYLK干擾對HEC-1A細胞凋亡的影響

2.4 MYLK干擾對HEC-1A細胞侵襲的影響 與對照組(48.25±6.67)比較，circMYLK-shRNA1組(18.88±8.11)的侵襲細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)?？梢?，干擾MYLK能抑制HEC-1A細胞的侵襲，見圖4。

圖4 MYLK干擾對HEC-1A細胞侵襲的影響

2.5 MYLK干擾對HEC-1A細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響 與對照組比較，circMYLK-shRNA1組的E-cadherin (0.028±0.013 vs 0.134±0.048)表達顯著上調(diào)(P<0.05)，而N-cadherin (0.824±0.078 vs 0.040±0.018)和Vimentin (0.544±0.07 vs 0.063±0.037)表達顯著下調(diào)(P<0.05)。表明干擾MYLK能抑制HEC-1A細胞的EMT，見圖5。

圖5 MYLK干擾對HEC-1A細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

2.6 MYLK干擾對裸鼠模型移植瘤的影響 轉(zhuǎn)染shRNA-NC或circMYLK-shRNA1的HEC-1A細胞皮下注射裸鼠建立移植瘤裸鼠模型。注射30d后，與shRNA-NC組比較，circMYLK-shRNA1組的腫瘤體積和腫瘤重量(0.40±0.08 vs 0.15±0.07)均顯著降低(P<0.05)(見圖6A、B、C)。與shRNA-NC組比較，circMYLK-shRNA1組的MYLK表達顯著下調(diào)(P<0.05)(見圖6D)。與shRNA-NC組比較，circMYLK-shRNA1組增殖相關(guān)的Ki67 (58.42±8.93 vs 14.79±7.17)和侵襲相關(guān)的Vimentin (65.91±9.88 vs 18.69±5.98)表達顯著下調(diào)(P<0.05)(見圖6E、F)。可見，干擾MYLK能抑制裸鼠移植瘤的生長和EMT。

圖6 MYLK干擾對裸鼠模型移植瘤的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的生殖系統(tǒng)癌癥[2]。轉(zhuǎn)移前腹腔鏡與開腹手術(shù)治可能是比較有效的診斷和治療手段[9]，且腹腔鏡子宮內(nèi)膜癌根治術(shù)可能是較優(yōu)的選擇[10]。然而轉(zhuǎn)移一旦方發(fā)生，治療難度將大大增加。因此，探索轉(zhuǎn)移的機制，以便開發(fā)更多抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的藥物，對于子宮內(nèi)膜癌治療很重要。

非編碼RNA已被廣泛證明參與生理、病理和疾病治療過程[11]。如在子宮內(nèi)膜癌中，長鏈非編碼RNA-C00473高表達于腫瘤組織，可能通過cyclin D1途徑促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖能力[12]。環(huán)狀RNA是閉合環(huán)狀的長鏈非編碼RNA，主要由蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子產(chǎn)生。由于不含5′或3′端，在許多情況下，比線性產(chǎn)物更為豐富。某些環(huán)狀RNA非分裂細胞中非常豐富，許多也表現(xiàn)出生理特異性和組織特異性的表達[13]。大量重要的研究文章指出了癌癥和某些環(huán)狀RNA之間的關(guān)系。MYLK是最近表征的促癌基因。MYLK可能是VEGF的重要調(diào)控基因。在膀胱癌中，MYLK可能作為miR-29a的內(nèi)源競爭RNA，激活VEGFA信號促進腫瘤進展[14]。為了考察MYLK在子宮內(nèi)膜癌中的作用，在本研究中干擾MYLK表達。與此前研究一致，我們發(fā)現(xiàn)，MYLK在子宮內(nèi)膜癌中也扮演著促癌基因的角色。

腫瘤的惡性程度與相關(guān)蛋白的表達關(guān)系密切，其中Ki67是與細胞分裂有關(guān)的蛋白抗原，Ki67的表達量與細胞增殖能力呈正比[15]。而細胞凋亡(Apoptosis)在胚胎發(fā)育、系統(tǒng)功能完善、機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面起重要作用。當細胞凋亡功能受到抑制時，將導致腫瘤的發(fā)生及免疫功能的異常[16]。此外，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)在腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和耐藥性中同樣扮演重要角色[17]。在EMT過程中上皮細胞改變其形態(tài)、細胞結(jié)構(gòu)而失去上皮細胞特征，并獲得侵襲性和遷移性間充質(zhì)表型，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，尤其在促進腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮著重要作用[18]。其中E-鈣黏蛋白(E-cadherin, E-cad)、波形蛋白(Vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin, N-cad)等是EMT的重要標志物[19]。此外，經(jīng)歷EMT的細胞表現(xiàn)出與腫瘤干細胞(CSCs)相似的特征，如藥物外排泵的增加和抗凋亡作用[20]。

MYLK可能是通過對腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控實現(xiàn)促癌作用的。位于3q21上的MYLK基因通過三個獨立的啟動子編碼三種蛋白質(zhì)(非肌肉肌球蛋白輕鏈激酶即nmMLCK，平滑肌MLCK和telokin。nmMLCK調(diào)節(jié)肌動蛋白的細胞骨架重排和收縮，驅(qū)動肌動蛋白單體組裝成聚合物或應(yīng)力纖維，并進一步發(fā)出信號表明肌動蛋白應(yīng)力纖維收縮[21]。這一過程對于癌細胞增殖和遷移的細胞骨架的快速動態(tài)協(xié)調(diào)至關(guān)重要[22]。VEGF信號通路的激活在mRNA和蛋白水平上增加了MYLK基因產(chǎn)物，而MYLK則通過注入調(diào)控miR-513a-5p之類的VEGF抑制MiRNA，促進VEGF的高表達[23]。因此，VEGF與MYLK可能構(gòu)成了一個促進腫瘤增殖遷移的正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。在膀胱癌中上調(diào)MYLK可促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，而敲減MLYK則會抑制細胞增殖、活力并誘導細胞凋亡[14]。有結(jié)果顯示，MLYK促進前列腺癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，干擾MYLK明顯加速了細胞凋亡[24]。Lin等[25]指出，MYLK敲減明顯抑制了肝癌細胞的創(chuàng)面愈合能力和遷移入侵的能力，進而阻礙了肝癌細胞的EMT。Zhao等[26]研究揭示，沉默MYLK后卵巢癌細胞增殖能力明顯減弱。在本研究中，我們的結(jié)果表明，干擾MYLK促進了子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞凋亡，并抑制了細胞的增殖、侵襲及EMT，進而阻礙體內(nèi)腫瘤的生長。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，MYLK可促進子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞增殖、侵襲及EMT，并阻礙凋亡，MYLK沉默逆轉(zhuǎn)了上述腫瘤惡性生物學行為，并且抑制了裸鼠模型異種移植瘤的生長。