陳燕偉 馬善波 張蕊

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院1.神經(jīng)外科；2.藥劑科;3.耳鼻喉科，陜西 西安 710032)

腦膠質(zhì)瘤是臨床常見的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤之一，發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的35.2%～61.0%[1]。由于腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制尚不明確，在臨床治療中有發(fā)病率及死亡率高，治愈率低等特點[2]。替莫唑胺為常用的治療腦膠質(zhì)瘤的藥物之一，其在臨床應用中存在有效率低、不良反應大等缺點[3]，所以對于腦膠質(zhì)瘤治療藥物的研發(fā)成為目前的臨床工作重點之一。血府逐瘀湯是以中醫(yī)學理論為指導的具有活血化瘀等作用的中藥湯劑，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在腦膠質(zhì)瘤的臨床治療中有顯著效果[4-5]。ERK/MAPK信號通路是與細胞增殖分化功能相關的重要信號通路之一，研究報道[6-7]其在體內(nèi)的表達水平與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后等密切相關。本文探討血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺對腦膠質(zhì)瘤大鼠的作用及機制，旨在為腦膠質(zhì)瘤的治療及血府逐瘀湯的藥理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠60只，雄性，8月齡，體重200～240g，購自山東大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(魯) 2019 0001]，在實驗動物房飼養(yǎng)，溫度20～25℃，濕度40%～60%，自由進食水；C6膠質(zhì)瘤細胞(中科院上海細胞庫)。

1.2 主要試劑 血府逐瘀湯(由桃仁12g，紅花、當歸、生地黃、牛膝各9g，川芎、桔梗各4.5g，赤芍、枳殼、甘草各6g，柴胡3g組成)由藥材飲片制成生藥含量為5g/mL的湯劑，購自北京同仁堂藥業(yè)公司(批號201908151)；替莫唑胺(江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，批準文號：H20040637，規(guī)格：50mg)；ERK、p38MAPK兔單克隆抗體、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IGg、生物素標記山羊抗兔IGg、大鼠TGF-β1檢測試劑盒(碧云天生物公司，貨號AF1051、AF7668、P0018M、A0208、A0277、PT878)；總RNA提取試劑盒、一步法逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、大鼠IL-2檢測試劑盒、大鼠IL-10檢測試劑盒、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號R1200、T2240、SR1110、SEKR-0003、SEKR-0006、G1120)；F-12K培養(yǎng)基(上海雅吉生物科技有限公司，貨號P007)；小鼠抗大鼠CD4+CD25+-FITC單克隆抗體(英國AbD Serotec公司，貨號DC040)；CD8+T細胞(艾美捷科技有限公司，貨號MAB4598)。PCR引物設計及合成由賽默飛世爾科技公司完成。

1.3 設備及儀器 DM2500光學/熒光顯微鏡(德國徠卡公司)；HM355S 全自動切片機、E-Gel Imager凝膠成像儀(賽默飛世爾科技公司)；3-18KS臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)CytoFLEX S 流式細胞儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 60只大鼠隨機分為空白對照組、腦膠質(zhì)瘤組、血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組，每組各12只，除空白對照組外，其余大鼠按照參考文獻方法[8]進行造模，C6膠質(zhì)瘤細胞復蘇傳代，并保證細胞活力在90%以上。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，頭、背部表面消毒后沿中線切開，暴露顱骨，在前冠狀縫與矢狀縫交點前1.0mm、右3.0mm 處鉆一小孔，直徑為1.0mm。沿鉆孔垂直進針，每只大鼠緩慢注射25μL的C6膠質(zhì)瘤細胞，10min后退針，骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚并切口消毒，并在手術后對動物觀察一小時，常規(guī)飼養(yǎng)，10d后以大鼠出現(xiàn)自主活動障礙，顱內(nèi)壓升高，磁共振成像可見類圓形腫塊及環(huán)狀強化長 T1低信號、長T2高信號視為造模成功[8]。血府逐瘀湯組按照20g/kg灌胃給予血府逐瘀湯[9]，替莫唑胺組給予替莫唑胺(25mg/kg)[10]，聯(lián)合給藥組同時給予血府逐瘀湯及替莫唑胺，空白對照組及腦膠質(zhì)瘤組給予蒸餾水，1次/d，連續(xù)5w[10]。對大鼠的處理符合動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意批準。

1.4.2 大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、CD8+T細胞測定 大鼠取血后置于肝素潤洗過的離心管中，參照文獻方法[11]測定大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、CD8+T細胞百分比。

1.4.3 大鼠瘤重占腦重比及抑瘤率測定 每組取6只大鼠，末次給藥后處死，取腫瘤組織并稱重，計算瘤重占腦重比及抑瘤率。瘤重占腦重比=(瘤重)/腦重×100%，抑瘤率=(腦膠質(zhì)瘤組瘤重占腦重比-給藥組瘤重占腦重比)/腦膠質(zhì)瘤組瘤重占腦重比。

1.4.4 大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平測定 取大鼠腫瘤組織(空白對照組取正常腦組織)，研磨勻漿取上清液，按照試劑盒方法測定大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平。

1.4.5 大鼠腦組織病理學檢查 每組取6只大鼠腦組織，在中性甲醛中固定后進行4μm石蠟切片，經(jīng)常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

1.4.6 腦膠質(zhì)瘤組織ERK、p38MAPKmRNA水平測定 取大鼠腦膠質(zhì)瘤組織，空白對照組取正常腦組織，提取總RNA并逆轉錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，使用試劑盒進行qRT-PCR檢測，結果以2-ΔΔCT法計算基因表達量。引物序列為：GAPDH: 正向引物5′-AACAAGAATGGTGGGCAGTC-3′，反向引物5′-AACTCCTCGTCCGTCTGTC-3′；ERK:正向引物5′-TTGAGACCCTGGTGGACATC-3′，反向引物5′-CTACCAAAGTTCCCCCTCTC-3′；P38MAPK:正向引物5′-GATTTTTCACGACACCCTTCACC-3′，反向引物5′-GGTCCTCTGGTCAAACTCTTGGAG-3′。

1.4.7 Western blot檢查腦膠質(zhì)瘤組織ERK、p38MAPK蛋白水平 取腫瘤組織(空白對照組取正常腦組織)，裂解并勻漿后，以8000rpm離心10min，收集上清液，水浴煮沸變性后測定蛋白濃度，取50μg蛋白電泳分離，用ERK、p38MAPK、GAPDH兔單克隆抗體(1∶500稀釋)及二抗(1∶1000稀釋)孵育后，滴加顯影劑，凝膠成像后使用ImageJ進行定量分析。

1.4.8 免疫組化檢查腦膠質(zhì)瘤組織ERK、p38MAPK表達水平 取大鼠腦膠質(zhì)瘤組織(空白對照組取正常腦組織)5μm石蠟切片，脫蠟、復水后進行抗原修復，切片經(jīng)ERK、p38MAPK兔單克隆抗體(1:200稀釋)在 4℃條件下孵育過夜，洗滌后，切片經(jīng)山羊抗兔二抗室溫孵育2h，二氨基聯(lián)苯胺顯影，顯微鏡下拍照并使用Image-Pro Plus 6.0測定免疫組化積分光密度。

2 結果

2.1 各組大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、CD8+T細胞水平比較 與空白對照組比較，腦膠質(zhì)瘤組大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)升高(P<0.05)，CD8+T細胞數(shù)降低(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)降低(P<0.05)，CD8+T細胞數(shù)升高(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)降低(P<0.05)，CD8+T細胞數(shù)升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、CD8+T細胞水平

2.2 各組大鼠瘤重占腦重比及抑瘤率比較 與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組大鼠瘤重占腦重比顯著降低(P<0.05)，與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組大鼠瘤重占腦重比顯著降低(P<0.05)；抑瘤率計算結果表明，與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組抑瘤率顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠瘤重占腦重比及抑瘤率比較

2.3 各組大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平比較 與空白對照組比較，腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織IL-2水平降低(P<0.05)，IL-10、TGF-β1水平升高(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組腫瘤組織IL-2水平升高(P<0.05)，IL-10、TGF-β1水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組腫瘤組織IL-2水平升高(P<0.05)，IL-10、TGF-β1水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平比較

2.4 各組大鼠腫瘤組織病理變化的影響 空白對照組大鼠腦組織未見明顯病理學變化，與空白對照組比較，腦膠質(zhì)瘤組大鼠腦組織可見明顯腫瘤細胞浸潤，細胞排列不整齊，邊界不清晰；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組大鼠腦組織腫瘤細胞浸潤明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腫瘤組織病理學變化(HE200×)

2.5 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平的影響 與空白對照組比較，腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平升高(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平比較

2.6 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平的比較 與空白對照組比較，腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK 蛋白水平升高(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平

2.7 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化水平比較 與空白對照組比較，腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK 免疫組化IOD水平升高(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化IOD水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化IOD水平降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化水平

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是由于腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞在高電離輻射、遺傳因素、病毒感染等多種因素影響下發(fā)生基因突變而引起的腫瘤疾病，其5年病死率在全身腫瘤疾病中位居第三位[12]。目前臨床上對于腦膠質(zhì)瘤的治療存在復發(fā)風險高、不良反應大、患者生存質(zhì)量低等多種缺點，所以對于治療腦膠質(zhì)瘤的藥物開發(fā)仍是臨床的迫切需求。

血府逐瘀湯是基于中醫(yī)學理論形成的具有活血化瘀療效的中藥成方制劑，其出自中醫(yī)學著作《醫(yī)林改錯》，中醫(yī)常用其治療各種血瘀證，在現(xiàn)代醫(yī)學中常用于治療腦震蕩后遺癥、腦血栓等多種心腦血管疾病[13-14]。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀湯對于腦膠質(zhì)瘤具有顯著的治療作用，其中呂廣梅[4]、門艷芳等[5]先后報道了血府逐瘀湯治療腦膠質(zhì)瘤取得顯著成效的臨床案例，并指出血府逐瘀湯能夠抑制中晚期膠質(zhì)瘤患者腫瘤進展，提高化療療效并減少化療相關性不良反應。

外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是機體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)細胞，其發(fā)揮免疫抑制作用進而誘導腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展[15]，而CD8+T細胞作為特異性T細胞能夠分泌細胞因子，進而促進T淋巴細胞對病毒、腫瘤細胞等的殺傷作用[16]。IL-2主要由活化的T細胞產(chǎn)生，起到免疫促進作用，誘導自然殺傷細胞增殖，促進B細胞增殖及抗體的產(chǎn)生，進而發(fā)揮對腫瘤細胞的殺傷作用[17]；腦膠質(zhì)瘤細胞能夠分泌TGF-β1，促進神經(jīng)小膠質(zhì)細胞分化并分泌IL-10、TGF-β1等因子，起到免疫抑制作用，并進一步促進了腫瘤細胞的增殖。本實驗結果表明，與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)、腫瘤組織IL-10、TGF-β1水平降低，CD8+T細胞數(shù)、IL-2水平升高，且聯(lián)合給藥組變化更明顯，這表明血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺能夠通過調(diào)節(jié)自身免疫功能，激活體內(nèi)免疫過程，增強體內(nèi)淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，進而發(fā)揮對腫瘤進展的抑制作用。

ERK/MAPK信號通路在細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)等刺激因素作用下被激活，進而細胞分化、細胞增殖、凋亡和自噬、運動性、學習記憶和新陳代謝等細胞生命活動[18]。在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中，ERK/MAPK信號通路接受生長因子、環(huán)境刺激等信號，通過信號級聯(lián)反應作用于NF-кB等核轉錄因子，誘導腫瘤進展，在乳腺癌、膠質(zhì)細胞瘤等腫瘤組織中都可發(fā)現(xiàn)ERK/MAPK的過度激活[19-20]。金戈等[21]研究發(fā)現(xiàn)ERK通路異常激活會增強腦膠質(zhì)瘤 U251 細胞增殖能力，而抑制ERK通路及相關蛋白則能夠顯著抑制U251 細胞增殖；張靜等[21]通過對人腦膠質(zhì)瘤組織樣本的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤組織中MAPK通路相關蛋白過度激活，并指出MAPK通路的異常激活在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用；由此可見調(diào)節(jié)ERK/MAPK通路可能是腦膠質(zhì)瘤治療的新的方向。本實驗結果表明，與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組大鼠腫瘤組織ERK、p38MAPK mRNA水平及蛋白水平、免疫組化表達水平均降低，且血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺組對ERK、p38MAPK表達的抑制作用更明顯，提示血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺對腦膠質(zhì)瘤的抑制作用可能是通過抑制ERK/MAPK通路實現(xiàn)的。由于時間及實驗條件的限制，本實驗尚未能研究血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺對腦膠質(zhì)瘤大鼠ERK/MAPK通路上下游其他相關蛋白的調(diào)節(jié)作用及對ERK、p38MAPK的靶向調(diào)節(jié)作用，擬在今后的研究中對上述問題做進一步討論，并就血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺對ERK/MAPK通路相關蛋白的反饋性調(diào)節(jié)作用進行闡述。

4 結論

血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺能夠抑制腦膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤進展，調(diào)節(jié)大鼠免疫功能，其機制可能與調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號通路有關。