鄧 多，譚會(huì)玲，上官云蘭，吳道勛，耿 玲，劉光明，陳俊雅*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理671000； 2.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，云南 大理671006； 3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是肺炎、敗血癥、呼吸道細(xì)菌或病毒感染等多種因素引起的危重癥常見的嚴(yán)重肺部并發(fā)癥［1］，其特征主要是中性粒細(xì)胞內(nèi)流，肺泡毛細(xì)血管屏障損傷導(dǎo)致間質(zhì)性水腫，呼吸功能受損［2］，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致多器官功能衰竭而死亡。目前，由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS?CoV?2）引發(fā)的2019 新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）依然在全球蔓延，造成許多患者出現(xiàn)嚴(yán)重肺炎和急性肺損傷，在COVID?19 中嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能障礙綜合征［3］。雖然目前有關(guān)ALI 病理生理學(xué)方面的研究已有了很大進(jìn)展，但尚無特效藥物，仍然是危重病人發(fā)病和死亡的主要原因。

研究表明，松科松屬植物云南松Pinus yunnanensisFranch.的球果松塔乙醇提取物具有抗腫瘤［4?5］、抗氧化［6］等多種藥理活性，能明顯抑制肺纖維化動(dòng)物模型炎癥因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF?α）、白介素1β（interleukin 1β，IL?1β）、白介素6（interleukin 6，IL?6）和干擾素γ（interferon gamma，IFN?γ）釋放，但未見其對(duì)急性肺損傷的深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期建立云南松松塔對(duì)肺纖維化動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過考察云南松松塔對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的ALI 大鼠的影響，進(jìn)一步明確該藥材對(duì)肺部疾病的治療作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016?0004，給藥前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由飲水進(jìn)食。

1.2 試劑與藥物 云南松松塔采自云南省大理州大理市下關(guān)鎮(zhèn)蒼山東坡，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院劉光明教授鑒定為云南松Pinus yunnanensisFranch.的松果，即松塔，自然晾干后粉碎，95% 乙醇浸泡3 次，1%氫氧化鈉提取，濾過，濾液分別用1、2、5倍量95%乙醇沉淀，合并沉淀物，減壓干燥，得到云南松松塔提取物。脂多糖（LPS）（批號(hào)042619190814，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；醋酸地塞米松片（批號(hào)170108，浙江仙琚制藥股份有限公司）。酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（大鼠IL?6，批號(hào)20 190524；大鼠TNF?α，批號(hào)20 190902；大鼠TGF?β1，批 號(hào)20 190902；大 鼠IL?10，批 號(hào)20 190902；大鼠IL?1β，批號(hào)20190920）均購(gòu)自深圳索萊寶科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）測(cè)試盒（批號(hào)20190820）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒（批 號(hào)20190829）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒（批號(hào)20190827）、過氧化氫酶（catalase，CAT）測(cè)試盒（批號(hào)20190829）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TrizolTMRegent、cDNA 第一鏈合成試劑盒、Power UpTMGreen Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；RT?PCR 引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Gene 公司）；8 道分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Thermo fisher 科技公司）；PCR 儀（德國(guó)Biometra 公司）；電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 分組與給藥 將大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，陽性組及云南松松塔提取物低、中、高劑量組，每組8 只，陽性組灌胃給予1.5 mg／kg 地塞米松，云南松松塔低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予50、100、200 mg／kg 相應(yīng)提取物，空白組、模型組大鼠灌胃給予等容量生理鹽水，連續(xù)4 d。第4 天給藥后1 h 除空白組外，其余各組大鼠均腹腔注射LPS（10 mg／kg）誘導(dǎo)急性肺損傷［7］，4 h 后處死，收集心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺、肺臟，計(jì)算臟器指數(shù)，公式為臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量／體質(zhì)量。

2.2 支氣管肺泡灌洗液制備 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，打開胸腔，左肺上葉結(jié)扎，摘取支氣管，用5 mL生理鹽水沖洗，收集沖洗液，3 000 r／min 離心10 min，收集上清，在－80 ℃下保存，即為支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。

2.3 組織學(xué)評(píng)價(jià) 剪取結(jié)扎大鼠左肺，固定于4%多聚甲醛溶液中，脫水后石蠟包埋，5 μm 切片，蘇木素?伊紅（hematoxylin?eosin，HE）染色，觀察肺泡壁及支氣管壁厚度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況、充血水腫情況。

2.4 BALF 中氧化因子水平檢測(cè) 取大鼠BALF，按照試劑盒說明書檢測(cè)SOD、MDA、NO、CAT 水平。

2.5 BALF 中炎癥因子水平檢測(cè) 取上清、不同質(zhì)量濃度對(duì)照品及其稀釋液各100 μL，加入預(yù)包被單克隆抗體的96 孔板中，洗板，加入100 μL 生物素化抗體孵育1 h，洗板，加入辣根過氧化物酶并避光孵育30 min，洗板，加入100 μL 酶結(jié)合物抗體，孵育15 min 后加入終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量3 次。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，檢 測(cè)BALF 中TNF?α、IL?6、IL?1β、IL?10、TGF?β1 水平。

2.6 TLR4／NF?κB 信號(hào)通路因子的mRNA 相對(duì)表達(dá)檢測(cè) 取20 mg 大鼠肺組織，按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，利用NanoDrop One spectrophotometer、1%瓊脂糖凝膠精確測(cè)定RNA 濃度和確定完整性，當(dāng)A260／A280在1.8～2.0 范圍內(nèi)時(shí)，可用于后續(xù)的cDNA 分析。取500 ng 總RNA，按照試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，Toll 樣因子4（TLR4）、核因子κB（NF?κB）、IL?1β、IL?6、TNF?α的相對(duì)基因表達(dá)通過PCR 進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA 稀釋8 倍，并進(jìn)行RT?PCR 分析，條件設(shè)定為95 ℃變性30 s，95 ℃變性10 s，40 個(gè)循環(huán)，60 ℃變性30 s，最后運(yùn)行溶解曲線。以 GAPDH（glyceraldehyde 3?phosphate dehydrogenase）為內(nèi)參，特異性引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，結(jié)果采用2－ΔΔCT法進(jìn)行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK?q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 臟器指數(shù) 與正常組比較，模型組大鼠肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)升高（P＜0.05，P＜0.01），胸腺指數(shù)降低（P＜0.01），心臟指數(shù)無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，云南松松塔高劑量組大鼠肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)降低（P＜0.01），胸腺指數(shù)升高（P＜0.01）腎臟指數(shù)、心臟指數(shù)無明顯變化（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠臟器指數(shù)（， n＝8）Tab.2 Organs indices of rats in various groups（， n＝8）

表2 各組大鼠臟器指數(shù)（， n＝8）Tab.2 Organs indices of rats in various groups（， n＝8）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 組織病理學(xué)變化 與正常組比較，模型組大鼠肺組織肺泡壁、支氣管壁中有大量炎癥細(xì)胞積聚，肺泡隔膜水腫變厚，導(dǎo)致肺泡空間急劇減少和間質(zhì)充血；云南松松塔高劑量組明顯減輕了LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI 組織損傷，包括水腫、充血、炎癥等，見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化（HE，×200）Fig.1 Histopathological changes of rat lung tissues in various groups（HE，×200）

3.3 抗炎能力 與正常組比較，模型組大鼠BALF 中TNF?α、IL?6、IL?1β、TGF?β 水平升 高（P＜0.01），IL?10 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組、云南松松塔高劑量組大鼠BALF 中TNF?α、IL?6、IL?1β、TGF?β 水平降 低（P＜0.01），IL?10 水平升高（P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠BALF 中炎性因子水平（， n＝8）Tab.3 Levels of inflammatory factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

表3 各組大鼠BALF 中炎性因子水平（， n＝8）Tab.3 Levels of inflammatory factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 抗氧化能力 與正常組比較，模型組大鼠BALF 中SOD、CAT 水平降低（P＜0.01），MDA、NO 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，云南松松塔高劑量組大鼠BALF 中SOD 水平升高（P＜0.01），MDA、NO 水平降低（P＜0.01），見表4。

表4 各組大鼠BALF 中氧化／抗氧化因子水平（， n＝8）Tab.4 Levels of oxidative／anti?oxidative factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

表4 各組大鼠BALF 中氧化／抗氧化因子水平（， n＝8）Tab.4 Levels of oxidative／anti?oxidative factors in BALF of rats in various groups（， n＝8）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 肺組織mRNA 相對(duì)表達(dá) 與正常組比較，其余各組大鼠肺組織中TLR4、NF?κB、TNF?α、IL?6、IL?1β相 對(duì)mRNA 表達(dá)升 高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，陽性組、云南松松塔高、中劑量組大鼠肺組織中TLR4、NF?κB、TNF?α、IL?6、IL?1β相對(duì)mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織中TLR4、 NF?κB、 TNF?α、 IL?6、 IL?1β 相對(duì)mRNA 表達(dá)（， n＝8）Fig.2 Relative mRNA expressions of TLR4， NF?κB， TNF?α， IL?6 and IL?1β in lung tissues of rats in various groups（， n＝8）

4 討論

ALI 是一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，是急性和持續(xù)性肺部炎癥的基礎(chǔ)，可由敗血癥、肺創(chuàng)傷、燒傷等多種因素引起［8］。在ALI 起始和發(fā)展階段，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞招募發(fā)揮重要作用［9］。在本研究中，給予ALI 大鼠云南松松塔提取物預(yù)處理后，其肺泡壁和支氣管壁中的炎癥細(xì)胞大量減少，肺泡隔膜水腫減輕，間質(zhì)充血得到改善。

LPS 是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，也是重要的炎癥誘導(dǎo)劑［10］。LPS 誘導(dǎo)的ALI 與NF?κB 通路有關(guān)［11］。在ALI 中，LPS 被TLR4 識(shí)別，從而激活NF?κB［12］，誘導(dǎo)多種促炎因子的釋放，包括TNF?α、IL?1β、IL?6 等［13］，引發(fā)炎癥反應(yīng)和進(jìn)一步的組織損傷。而TNF?α、IL?1β、IL?6 的產(chǎn)生，會(huì)引起NF?κB 的持續(xù)激活，從而誘導(dǎo)持續(xù)的炎癥反應(yīng)［14］。因此，抑制TLR4／NF?κB 信號(hào)通路的激活能夠改善ALI 炎癥狀態(tài)［15］。RT?PCR 結(jié)果表明，PE 能夠下調(diào)TLR4、NF?κB的mRNA 相對(duì)表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)炎癥因子TNF?α、IL?1β、IL?6的mRNA 相對(duì)表達(dá)，從而減少BALF 中促炎細(xì)胞因子TNF?α、IL?1β、IL?6 的釋放，減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠炎癥水平。

除了炎癥反應(yīng)外，氧化應(yīng)激在LPS 誘導(dǎo)的肺損傷病理過程中也發(fā)揮重要作用［16］。急性肺損傷發(fā)生后，受損細(xì)胞釋放大量氧自由基，如NO 等而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，從而使生物膜通透性增加，穩(wěn)定性變差［17］。此外，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA 與氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等生物分子結(jié)合會(huì)造成這些生物分子失活而產(chǎn)生毒性［18］。因此，提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶如SOD、CAT 活力，降低氧化酶和氧化產(chǎn)物如NO、MDA 等的量則能夠抑制氧化應(yīng)激，改善急性肺損傷。在LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 中，云南松松塔提取物顯著增強(qiáng)了ALI 大鼠抗氧化酶SOD 的活力，并降低MDA 和NO 水平。

綜上，云南松松塔提取物能通過抑制TLR4／NF?κB 炎癥信號(hào)通路和氧化應(yīng)激，下調(diào)促炎基因TNF?α、IL?1β、IL?6 的相對(duì)mRNA 表達(dá)，而減少炎癥因子分泌，抑制ROS，增強(qiáng)抗氧化酶活性，從而保護(hù)LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI。當(dāng)然，本研究仍然存在一定的局限性。目前研究發(fā)現(xiàn)云南松松塔提取物能夠從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)炎癥，但是否能夠從翻譯水平改善ALI 動(dòng)物炎癥水平，以及云南松松塔提取物如何調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥信號(hào)通路，以及云南松松塔提取物能否預(yù)防急性肺損傷后的并發(fā)癥，需要我們進(jìn)一步進(jìn)行深入研究，從而為云南松松塔的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。