莫禎妮，熊盈盈，邱樹毅，曾祥勇,*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省發(fā)酵與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

食品的腐敗變質(zhì)是由于腐敗或致病微生物的生長和繁殖引起的，生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、銷售和貯藏等過程都有可能引起腐敗或致病微生物的生長，形成相應(yīng)的生物膜。生物膜是指細(xì)菌附著在固體表面上，產(chǎn)生細(xì)胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）基質(zhì)，并將原核微生物和/或真核微生物嵌入其中，形成具有空間組織的群落[1]。生物膜的基本骨架是由多種EPS組成的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)菌在固體表面黏附以及細(xì)胞內(nèi)的聚集起關(guān)鍵作用[2]。生物膜可以保護(hù)內(nèi)部病原菌細(xì)胞，有助于營養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充，因此生物膜黏附在生物或非生物表面會(huì)導(dǎo)致食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，且難以被清潔劑和消毒劑清除，從而影響食品安全[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)道，每年由病原菌引起的食源性疾病占比高達(dá)30%，其中有65%都是因?yàn)椴≡纬缮锬ぴ斐傻腫3]。因此，在食品加工生產(chǎn)過程中控制生物膜形成已成為當(dāng)今亟需解決的一個(gè)重要問題。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細(xì)胞-細(xì)胞的交流機(jī)制，是細(xì)菌進(jìn)行種間或種內(nèi)信息交流的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，當(dāng)群體密度達(dá)到一定閾值時(shí)，能夠自發(fā)產(chǎn)生、釋放一些信號(hào)分子，細(xì)胞受體識(shí)別信號(hào)，可調(diào)控基因表達(dá)，并參與許多重要的生物學(xué)過程，如孢子形成、毒力和發(fā)病機(jī)制、食物腐敗和生物膜形成等[4]。細(xì)菌從游離狀態(tài)到形成成熟的生物膜的過程中，主要是通過QS系統(tǒng)和一系列的環(huán)境信號(hào)調(diào)節(jié)表達(dá)。QS現(xiàn)象與生物膜形成有著至關(guān)重要的關(guān)系，當(dāng)環(huán)境條件不利于細(xì)菌生長時(shí)，細(xì)菌在QS系統(tǒng)的調(diào)控下聚集，形成生物膜，若缺失QS系統(tǒng)，形成的生物膜會(huì)變得稀薄。QS系統(tǒng)不僅可以影響細(xì)菌的聚集，還會(huì)影響細(xì)菌的黏附性、疏水性、EPS的含量等。同時(shí)，生物膜的形成也可以影響QS信號(hào)分子的擴(kuò)散[5]。

生物膜是食品工業(yè)中最常見的污染形式，在食品加工中形成生物膜，會(huì)降低食品加工過程的有效性，影響食品品質(zhì)和安全，從而導(dǎo)致細(xì)菌食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此抑制生物膜的形成和去除生物膜具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)菌生物膜的形成都依賴于QS系統(tǒng)的調(diào)控[6]，所以，通過抑制QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)生物膜的形成已成為一項(xiàng)有效的控制策略[7]。

1 生物膜的形成

生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，該過程中涉及到細(xì)胞表面分子、毒力因子等多方面的變化，最終達(dá)到促進(jìn)細(xì)菌在不利環(huán)境中生長的目的。食品中多種微生物（包括導(dǎo)致腐敗和致病的微生物）都可以形成生物膜，并在許多感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。生物膜的形成一般分為5 個(gè)階段[8-9]（圖1）：1）可逆黏附階段。在環(huán)境中浮游的細(xì)菌會(huì)通過物理作用（如范德華力、靜電相互作用）或借助鞭毛、菌毛的運(yùn)動(dòng)黏附在物體表面，這一階段是形成生物膜的關(guān)鍵，附著的微生物起初只有少量EPS，不具有分化能力，可能會(huì)從表面脫落重新回到浮游狀態(tài)，因此這個(gè)階段是可逆的[10]。黏附物的表面性質(zhì)如粗糙度、表面電荷、疏水性等在細(xì)菌黏附中起重要作用[11]。塑料、玻璃、金屬、木材和食品等疏水性表面更容易形成生物膜[12]。2）不可逆黏附階段。細(xì)菌在生物或非生物表面進(jìn)行最初的可逆黏附后，附著的細(xì)胞開始分泌群體感應(yīng)分子（quorum sensing molecules，QSMs）和EPS，從而提供較強(qiáng)的附著能力，導(dǎo)致不可逆黏附。此時(shí)生物膜變得難以去除，需要酶、表面活性劑、消毒劑和/或熱量對(duì)附著力進(jìn)行強(qiáng)剪切或化學(xué)反應(yīng)才能破壞。3）微菌落形成階段。當(dāng)細(xì)菌附著在生物或非生物表面時(shí)，可以通過QS機(jī)制相互交流并分泌EPS，在EPS內(nèi)繁殖形成微菌落，這有助于加強(qiáng)細(xì)菌與基質(zhì)之間的聯(lián)系，并在環(huán)境中穩(wěn)定菌落，該過程需要如鞭毛、菌毛、QSMs和EPS的共同參與。4）成熟階段。此階段是最穩(wěn)定的，形成了成熟的生物膜，附著的菌群以單層或多層的聚集體存在，菌群具有不同的形狀，如蘑菇狀等，細(xì)胞外基質(zhì)可以保護(hù)細(xì)胞免受外部損傷。在生物膜成熟階段中，QS系統(tǒng)會(huì)調(diào)節(jié)EPS中某些重要基因的表達(dá)，表明QSMs是參與生物膜形成的重要調(diào)控機(jī)制[13]。5）分散階段。此階段生物膜內(nèi)的細(xì)菌開始凋亡，當(dāng)受到外部因素如流體剪切力增加，內(nèi)部因素如內(nèi)源性酶降解、EPS或表面結(jié)合蛋白的釋放影響時(shí)，活的細(xì)菌又可以分散到周圍環(huán)境中，這些浮游態(tài)細(xì)菌再次附著在表面形成新生物膜，重復(fù)以上這些過程。

圖1 生物膜形成階段假想模型[8-9]Fig.1 Hypothetical model of biofilm formation stages[8-9]

2 QS調(diào)控生物膜形成

2.1 QS系統(tǒng)的分類

QS是基于細(xì)胞外化學(xué)信號(hào)分子的產(chǎn)生、釋放和控制來調(diào)整自身群體密度和行為的過程，細(xì)菌在生長和繁殖過程中向周圍環(huán)境分泌特定的信號(hào)分子，這種信號(hào)分子被稱為自誘導(dǎo)物（autoinducer，AI）[4]。QS信號(hào)分子可分為3大類：N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserine lactones，AHLs）、自誘導(dǎo)寡肽（autoinducing peptide，AIP）和自誘導(dǎo)子-2（autoinducer-2，AI-2）。當(dāng)這些信號(hào)分子濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，細(xì)菌群體會(huì)通過特異性靶基因的協(xié)同表達(dá)來響應(yīng)[14-15]。

2.1.1 AHLs介導(dǎo)的革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)

大多數(shù)革蘭氏陰性菌（G-）的QS系統(tǒng)都是以AHLs信號(hào)分子介導(dǎo)的。AHLs是以N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)為核心的，酰基鏈通常含有4～18 個(gè)碳。高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)部分來源于S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），?；鶄?cè)鏈部分來源于?；d體蛋白或?；o酶A[16]。luxI/luxR系統(tǒng)是G-中典型的QS調(diào)控系統(tǒng)。LuxI同源蛋白合成酶產(chǎn)生的AHLs作為AI，然后分泌到細(xì)胞膜外，當(dāng)達(dá)到閾值濃度時(shí)與LuxR家族的受體蛋白相互作用，導(dǎo)致靶基因的抑制或激活[17]。

2.1.2 AIP介導(dǎo)的革蘭氏陽性菌QS系統(tǒng)

在革蘭氏陽性菌（G+）中，AIP信號(hào)分子是一種特有的經(jīng)過翻譯、修飾后形成的具有穩(wěn)定性的自誘導(dǎo)肽，AIPs必須通過ATP-結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)或其他膜蛋白才能分泌到胞外。AIP與由膜結(jié)合的傳感器激酶受體和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子組成的雙組分系統(tǒng)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[16]。當(dāng)AIP累積到一定濃度閾值時(shí)，雙組分系統(tǒng)的感應(yīng)識(shí)別元件識(shí)別到AIP，AIP被磷酸激酶受體識(shí)別，激酶中的組氨酸殘基磷酸化，將磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)到與之對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的天冬氨酸殘基后，最終磷酸化的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白與DNA特定位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控QS相關(guān)基因的表達(dá)，形成動(dòng)態(tài)的交流系統(tǒng)[4]。

2.1.3 AI-2介導(dǎo)的QS系統(tǒng)

AI-2信號(hào)系統(tǒng)是在G+和G-中共同存在的一種QS系統(tǒng)，既可用于細(xì)菌種內(nèi)也可用于種間的通訊。AI-2與生物膜形成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、結(jié)合和毒力因子產(chǎn)生等細(xì)菌表型有關(guān)[18]，是由LuxS酶在活化甲基循環(huán)中合成的4,5-二羥基-2,3-戊二酮衍生的一系列相互轉(zhuǎn)化化合物[19]。在該系統(tǒng)中，LuxS蛋白酶調(diào)控AI-2的合成，隨著細(xì)胞的分裂和增殖，轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外的AI-2濃度增加，達(dá)到某一閾值時(shí)會(huì)與LuxP受體蛋白結(jié)合，從而調(diào)節(jié)包括生物膜形成的QS基因表達(dá)[20]。

2.2 QS在生物膜形成中的調(diào)控作用

生物膜的形成通常通過細(xì)胞間的交流或QS來協(xié)調(diào)[1]。當(dāng)細(xì)菌受到不利外界條件脅迫后，會(huì)激發(fā)細(xì)胞的環(huán)境信號(hào)應(yīng)答系統(tǒng)，激活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)或改變調(diào)控元件轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)EPS（多糖基質(zhì)、纖維蛋白等）的合成與釋放，細(xì)菌黏附性發(fā)生改變，進(jìn)而影響生物膜成熟與結(jié)構(gòu)。當(dāng)黏附細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量時(shí)產(chǎn)生信號(hào)分子，信號(hào)分子濃度積累到閾值時(shí)，引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，形成生物膜[21-22]。

Davies等[23]描述了lasQS系統(tǒng)在銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中形成生物膜的作用，首次研究了QS與生物膜的關(guān)系。P.aeruginosa的lasI缺陷型突變株形成未成熟的生物膜，在添加信號(hào)分子3OC12-HSL后，又能重新形成成熟的生物膜[23]。在P.aeruginosa中已知兩套QS調(diào)控系統(tǒng)——lasI/lasR、rhlI/rhlR，lasQS系統(tǒng)決定了細(xì)菌生物膜的差異性，LasI合酶催化產(chǎn)生的3-oxo-C12-HSL信號(hào)分子，可以調(diào)控細(xì)菌的黏附、游動(dòng)和細(xì)菌生物膜的形成，激活lasI、lasB、lasA、toxA基因的表達(dá)；而rhl系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)鼠李糖脂產(chǎn)量維持細(xì)菌生物膜的基本結(jié)構(gòu)[24]。研究表明，AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)使P.aeruginosaPAO1菌株形成的生物膜釋放eDNA和PA14菌株產(chǎn)生EPS[25]。隨后，研究人員在P.aeruginosa中又發(fā)現(xiàn)了第3套QS調(diào)控系統(tǒng)——喹諾酮類假單胞菌信號(hào)（Pseudomonasquinolone signal，PQS）系統(tǒng)，該系統(tǒng)以2-烷基-4-喹諾酮（2-alkyl-4-quinolone，AQ）作為信號(hào)分子，主要包括2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮和2-庚基-4-羥基喹啉（2-heptyl-4-quinolone，HHQ），PQS的合成由pqsABCDE操縱子和兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單元pqsH和pqsL負(fù)責(zé)[26]。PQS突變菌株會(huì)抑制生物膜的形成，降低藻酸鹽、鼠李糖脂等的產(chǎn)量，使生物膜結(jié)構(gòu)變得松散，外源添加信號(hào)分子后，可以正常形成生物膜，所以PQS系統(tǒng)對(duì)生物膜形成具有重要作用[27]。PQS系統(tǒng)還可以控制eDNA的釋放，可能是因?yàn)镻QS系統(tǒng)正向調(diào)控綠膿菌素的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞裂解來促進(jìn)P.aeruginosa中eDNA的釋放[28]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的食源性致病微生物，是G+的代表微生物，它會(huì)導(dǎo)致肺炎、心內(nèi)膜炎、傷口感染和其他并發(fā)癥。S.aureus的QS系統(tǒng)是由信號(hào)分子AIP介導(dǎo)的附屬基因調(diào)節(jié)因子（accessory gene regulator，Agr）系統(tǒng)，生物膜的形成及毒力因子的產(chǎn)生受此調(diào)控。該系統(tǒng)中的agr基因由兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元RNA II和RNA III組成，分別從P2和P3啟動(dòng)子上啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。P2驅(qū)動(dòng)的操縱子包含agrBDCA基因，前體肽agrD經(jīng)調(diào)控蛋白agrB和蛋白酶加工合成AIP，agrC和agrA編碼的轉(zhuǎn)膜受體組氨酸激酶AgrC和細(xì)胞質(zhì)調(diào)控子AgrA組成雙組分傳導(dǎo)系統(tǒng)，AIP與組氨酸激酶AgrC結(jié)合后使AgrA發(fā)生磷酸化，通過結(jié)合同源DNA序列來調(diào)控轉(zhuǎn)錄重組，導(dǎo)致基因表達(dá)的上調(diào)或抑制[29]。磷酸化的AgrA還能夠調(diào)節(jié)由P3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的RNA III的表達(dá)，RNA III是一種參與α-溶血素等外毒素上調(diào)的多效性效應(yīng)因子，而RNA III轉(zhuǎn)錄是由P3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，能使編碼生物被膜形成必需基因黏附素的表達(dá)下調(diào)，并誘導(dǎo)莢膜、毒素以及蛋白酶的產(chǎn)生[30]。RNA III進(jìn)一步與其靶蛋白TRAP結(jié)合，促進(jìn)S.aureus生物膜生成[31]。AIP和調(diào)節(jié)效應(yīng)器RNA III生成能力缺失影響S.aureus的生物膜形成[32]。酚溶性調(diào)節(jié)蛋白（phenol-soluble modulin，PSM）是具有α-螺旋兩親性結(jié)構(gòu)的葡萄球菌肽，具有表面活性劑的特性，是S.aureus形成生物膜的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因子，AgrA反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白控制著psm操縱子的轉(zhuǎn)錄，psm基因的表達(dá)促進(jìn)生物膜的形成，陰礙生物膜分散和再生等過程[32]，而MgrA是psm的負(fù)調(diào)控因子，通過結(jié)合psm啟動(dòng)子區(qū)域抑制psm在S.aureus生物膜中的轉(zhuǎn)錄，從而負(fù)向調(diào)節(jié)生物膜的形成和脫落[33]。

3 QS抑制劑的調(diào)節(jié)機(jī)制及分類

3.1 QS抑制劑的調(diào)節(jié)機(jī)制

生物膜的形成會(huì)給食品行業(yè)帶來巨大的挑戰(zhàn)。一旦形成生物膜就難以去除，在生物膜內(nèi)部，細(xì)菌可以免受環(huán)境壓力的影響，如對(duì)抗生素、消毒劑和高溫等均有耐受性[34]。因此，研究控制生物膜的策略對(duì)于食品安全顯得極為重要。QS抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSIs）是一類以QS系統(tǒng)為靶標(biāo)，干擾細(xì)菌生物被膜形成、毒力因子的產(chǎn)生或致病基因表達(dá)的物質(zhì)，被認(rèn)為是一種抑制生物膜形成的有效方法，通過抑制QS特定基因的表達(dá)陰止細(xì)胞間通訊，而不是像傳統(tǒng)的消毒劑那樣殺死細(xì)菌。因此，開發(fā)新型QSIs成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。據(jù)目前報(bào)道，QSIs可以通過不同機(jī)制調(diào)控生物膜的形成，主要包括抑制信號(hào)分子合成、酶解信號(hào)分子和QS類似物競爭性結(jié)合受體蛋白3 種方式。

3.1.1 抑制信號(hào)分子合成

QS信號(hào)分子主要是底物經(jīng)過酶的催化合成，因此為了陰斷信號(hào)分子的合成，可以通過抑制酶的活性或破壞底物。Chang等[35]測定了水楊酸、單寧酸、反式肉桂醛在0.3 mg/mL時(shí)對(duì)AHL信號(hào)分子產(chǎn)生的效果，結(jié)果表明水楊酸只能減少并不能完全抑制信號(hào)分子的產(chǎn)生，單寧酸和反式肉桂醛能夠抑制AHL合酶（RhlI）的產(chǎn)生，但不能抑制AHL合酶（LasI）的產(chǎn)生，兩者均對(duì)P.aeruginosa沒有抑菌作用，進(jìn)一步對(duì)反式肉桂醛研究發(fā)現(xiàn)，其可以與LasI和RhlI的底物結(jié)合位點(diǎn)相互作用，抑制銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)關(guān)鍵下游基因lasB、rhlA和pqsA的表達(dá)，從而影響生物膜形成。Li Tingting等[36]的研究發(fā)現(xiàn)0.5 μL/mL鄰氨基苯甲酸甲酯可以通過干擾AHL的生物合成以及與受體蛋白的競爭性結(jié)合來抑制溫和氣單胞菌（Aeromonas aeruginosa）的QS系統(tǒng)，顯著減少了生物膜的形成。Lou Zaixiang等[37]通過研究發(fā)現(xiàn)，2 mg/mL牛蒡葉提取物不僅能夠完全抑制生物膜的形成，還能抑制信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL的產(chǎn)生，從而干擾了AHL的合成。有研究發(fā)現(xiàn)一種真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物——Ambuic Acid，能夠通過抑制AgrB合酶活性來干擾G+AIP的生物合成[38]。另外，蘆丁[39]、檸檬醛[40]等能夠減少AI-2的合成，從而抑制生物膜的形成。

3.1.2 酶解信號(hào)分子

在信號(hào)分子合成后，還可以使用降解酶水解信號(hào)分子，使其在細(xì)胞外無法達(dá)到臨界閾值濃度，QS系統(tǒng)無法感知信號(hào)分子，從而陰止QS系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌表型。能降解QS信號(hào)分子的酶稱為群體猝滅酶（quorum quenching，QQ）。目前研究較多的是AHL降解酶，AHL降解有4 種方式：AHL內(nèi)酯酶和AHL?；阜謩e水解AHL的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和酰胺鍵，AHL氧化酶和AHL還原酶不會(huì)降解AHL分子，但會(huì)修飾AHL分子并改變其活性[41]。Vinoj等[42]發(fā)現(xiàn)由地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）DAHB1表達(dá)的AHL內(nèi)酯酶（AiiA）具有廣譜AHL底物特異性。純化的重組AiiA能夠降解產(chǎn)生的C6-HSL，也能抑制弧菌屬（Vibriospp.）生物膜的發(fā)育，并顯著降低循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中蝦的感染和死亡率。Zhang Bao等[43]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌（Bacillus）QSI-1中的AHL內(nèi)酯酶基因aiiA，并將其在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，aiiAQSI-1基因能夠降解嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的C6-HSL信號(hào)分子，導(dǎo)致細(xì)菌游動(dòng)能力下降，胞外蛋白酶和溶血素毒力因子含量減少，并抑制了A.hydrophilaYJ-1的生物膜形成。同時(shí)，Zhang Bao等[43]在飼料中添加AiiAQSI-1蛋白，喂養(yǎng)鯽魚96 h后發(fā)現(xiàn)沒有死亡現(xiàn)象，表明添加AiiAQSI-1蛋白對(duì)魚的生存不具有毒性，故可在飼料中添加該蛋白通過群體猝滅控制嗜水氣單胞菌病。

3.1.3 QS類似物競爭性結(jié)合受體蛋白

大多數(shù)的研究都集中于開發(fā)天然AHL信號(hào)分子的類似物，主要是修飾AHL的?；鶄?cè)鏈或內(nèi)酯部分，只有少數(shù)研究關(guān)注中心酰胺部分的改變，Brackman等[44]合成了酰胺功能被三唑取代的AHL類似物，在此研究中所合成的所有化合物都能夠陰斷QS中的C6-HSL，主要是通過苯基化合物改變酰基側(cè)鏈，活性最強(qiáng)的QSI對(duì)P.aeruginosa生物膜表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制和清除活性。另外，研究人員對(duì)AIP類似物、4,5-二羥基-2,3-戊二酮類似物也有所研究[41]。這些類似物能夠競爭性地與特異性受體蛋白的活性位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，從而陰斷微生物的QS系統(tǒng)。Cheoljin等[45]合成了11 種QS拮抗劑，發(fā)現(xiàn)10 種新的AHLs類似物或N-磺酰高絲氨酸內(nèi)酯衍生物被證明可以作為N-(3-氧辛烷?；?-L-高絲氨酸內(nèi)酯的拮抗劑。通過分子模擬實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)疏水相互作用是一個(gè)重要的影響因素。Qin Xiaofei等[46]合成了4 種與高絲氨酸γ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)類似的化合物，并將其命名為TGK系列化合物。TGK系列化合物與TraR蛋白（LuxR的替代物）的結(jié)合能力比與天然底物N-(3-氧代辛烷?；?-L-高絲氨酸內(nèi)酯（OOHL）的結(jié)合能力更強(qiáng)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其與TraR蛋白形成了比3o-C6-HSL更強(qiáng)的疏水相互作用，從而為合成的TGK系列化合物提高群體猝滅活性提供了理論依據(jù)。姜辣素是從生姜中提取出的辛辣油，是AHL的結(jié)構(gòu)類似物，Parmar等[47]的研究表明姜辣素是通過氫鍵和疏水相互作用與LuxR發(fā)生拮抗作用，與LuxR的自發(fā)結(jié)合可能改變LuxR的構(gòu)象，使其不能轉(zhuǎn)錄激活lux操縱子。

3.2 QSIs的分類

3.2.1 天然QSIs

近十幾年來，研究發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)品，如食用和藥用植物的精油、草藥、香料及其分離成分，在抑制生物膜的形成方面具有相當(dāng)大的潛力，甚至能夠破壞食品工業(yè)中已經(jīng)形成的生物膜，可作為QSIs調(diào)控生物膜的形成。

3.2.1.1 植物源QSIs

目前，植物源的QSIs研究最為廣泛，植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物會(huì)抑制細(xì)菌產(chǎn)生致病性的毒素，抑制其生物膜的形成，具有干擾QS的作用，抗菌活性成分主要是酚類、黃酮、醌類、香豆素等。

精油是從植物的花、葉、莖、根或果實(shí)中，通過水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法或溶劑提取法提煉萃取的揮發(fā)性芳香物質(zhì)。Myszka等[48]研究發(fā)現(xiàn)百里香精油在劑量為10 μL/mL時(shí)抑制了紫羅蘭素的產(chǎn)生，降低了熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物膜的黏附性，有效地抑制了P.fluorescens內(nèi)AHLs的產(chǎn)生，并能顯著抑制細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)，降低鞭毛基因的mRNA水平。Luciardi等[49]用氣相色譜-質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)葡萄柚精油中主要含有萜類物質(zhì)，可以抑制P.aeruginosa中AHLs的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制生物膜的形成，且高質(zhì)量濃度（4 mg/mL）的葡萄柚精油比低質(zhì)量濃度（0.1 mg/mL）精油能夠更好地抑制生物膜的形成。L-香芹酮是留蘭香精油的主要成分，Li Tingting等[50]的研究揭示了L-香芹酮在0.5 μL/mL時(shí)對(duì)生物膜的形成有最好的抑制效果，抑制率達(dá)到了52.41%，通過氣相色譜-質(zhì)譜分析，L-香芹酮能夠顯著抑制哈維氏弧菌（Vibrio Harvei）AHL（C6-HSL和C8-HSL）的產(chǎn)生。此外，在對(duì)AHL合酶HalI和QS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HalR的計(jì)算機(jī)分析和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)L-香芹酮是通過氫鍵與AHL合酶HalI結(jié)合，導(dǎo)致AHL生物合成的中斷。

在香料中也發(fā)現(xiàn)了能夠有效抑制生物膜的天然物質(zhì)，如肉桂醛、姜黃素等。Nakagawa等[51]研究發(fā)現(xiàn)迷迭香葉中的肉桂酸和肉桂醇是金黃色葡萄球菌agr表達(dá)的一種特異性抑制劑，能夠有效抑制S.aureus中的RNA III和psma基因表達(dá)。Li Tingting等[52]研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛在0.025 μg/mL時(shí)就能夠抑制P.fluorescens生物膜的形成。具體來說，肉桂醛通過氫鍵作用與P.fluorescens的LuxR型蛋白競爭性結(jié)合，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其是通過陰止AHLs與其受體蛋白結(jié)合，而不是通過抑制AHLs的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)或抑制QS，可能是通過氫鍵作用與P.fluorescens的LuxR型蛋白結(jié)合，起到競爭作用，使導(dǎo)致P.fluorescens的QS系統(tǒng)受到抑制。由于肉桂醛具有良好的安全性，所以它是一種具有發(fā)展前景的QSIs，在水產(chǎn)品保鮮方面的應(yīng)用具有很大的潛力，以保證食品安全。Srinivasan等[53]研究發(fā)現(xiàn)胡椒乙酸乙酯提取物中主要存在的十六烷酸，可以有效地抑制V.harvei的黏附和微菌落的形成，進(jìn)而陰礙生物膜的形成，十六烷酸對(duì)V.harvei的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為1 600 μg/mL，在亞抑菌質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，對(duì)QS介導(dǎo)的生物發(fā)光生成和生物膜形成的抑制率分別高達(dá)98%和74%。在Shukla等[54]的研究中，姜黃素質(zhì)量濃度在3 μg/mL時(shí)，P.aeruginosa形成的生物膜顯著減少，姜黃素與AHL受體的自發(fā)結(jié)合可能改變其構(gòu)象，使其不能轉(zhuǎn)錄激活一系列基因，因此，姜黃素是一類有效的QSIs。

在一些蔬菜、谷物中，研究人員發(fā)現(xiàn)大麥芽堿、玉米黃質(zhì)等物質(zhì)能抑制生物膜形成。G?kals?n等[55]的研究表明玉米黃質(zhì)在12 μmol/L濃度下即能抑制P.aeruginosaQS系統(tǒng)，是比地衣次生代謝物Everonic Acid更好的抑制劑，對(duì)las和rhlQS系統(tǒng)均表現(xiàn)出顯著的QS抑制作用。Zhou Jinwei等[56]首次發(fā)現(xiàn)發(fā)芽大麥中的大麥芽堿能夠抑制P.aeruginosa的QS，在0.5～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，顯著抑制AHL的合成，QS相關(guān)基因lasI、lasR、rhlI和rhlR的表達(dá)被顯著抑制。Ouyang等[57]研究發(fā)現(xiàn)16 mg/mL的槲皮素就能顯著抑制P.aeruginosa中l(wèi)asI、lasR、rhlI和rhlR的基因表達(dá)。QS在調(diào)節(jié)生物膜形成和毒力因子產(chǎn)生起著重要作用，因此，槲皮素抑制生物膜形成和毒力因子的產(chǎn)生是通過對(duì)QS的影響實(shí)現(xiàn)的。

不僅是陸生植物，在海洋植物中也發(fā)現(xiàn)了如呋喃酮類等化合物可以抑制生物膜的形成。Koh等[58]研究了從澳大利亞海藻Delisea pulchra中分離到的呋喃酮類物質(zhì)，能有效抑制AHL信號(hào)分子產(chǎn)生的化合物。呋喃酮類化合物與LuxR型蛋白競爭性結(jié)合，從而陰止QS系統(tǒng)的形成，導(dǎo)致無法形成生物膜。Karnjana等[59-60]曾發(fā)現(xiàn)紅藻中的乙醇提取物能夠抑制V.harvei生物膜的形成，進(jìn)一步分離乙醇提取物得到兩種名為N-芐基肉桂酰胺和α-間苯二甲酸的化合物，體外活性測定表明兩種化合物均能抑制生物膜的形成，且N-芐基肉桂酰胺比α-間苯二甲酸更為有效。

3.2.1.2 動(dòng)物源QSIs

不僅在植物中具有抑制QS的抗菌活性成分，在一些動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了QS猝滅酶，這可能是動(dòng)物體對(duì)抗其寄生性致病菌的一種防御機(jī)制。Dong Yihu等[61]的實(shí)驗(yàn)證明豬腎臟酰基轉(zhuǎn)移酶I能夠滅活QS信號(hào)分子C6-HSL和3o-C12-HSL，但是不能滅活C4-HSL信號(hào)分子。Pejin等[62-63]首次在體外研究了兩種淡水苔蘚蟲——斑點(diǎn)透明蟲Hyalinella punctata和金絲桃蟲Pectinatella magnifica對(duì)P.aeruginosaPAO1的抗QS活性，發(fā)現(xiàn)生物乙醇提取液對(duì)生物膜的形成有顯著影響；在用0.015 mg/mL和0.03 mg/mL乙醇溶液提取時(shí)，生物膜形成量分別減少了59.14%和54.82%。Vadassery等[64]從尼羅河羅非魚胃腸道中分離出AHL降解菌——糞腸球菌（Enterococcus faecalis）QQ12，其在體外能快速降解合成的C6-HSL，對(duì)A.hydrophila產(chǎn)生的AHL具有良好的降解能力，能夠很好地抑制A.hydrophila毒力因子。孫夢桐等[65]篩選了來源于魚類腸道中的乳酸菌，研究其對(duì)V.harveiQS系統(tǒng)及生物膜形成的抑制作用，其中抑制效果最好的是來自鯉魚腸道的菌株LY3-1，當(dāng)乳酸菌菌液粗提物質(zhì)量濃度為16 mg/mL時(shí)，可完全降解AHLs信號(hào)分子，生物膜抑制率達(dá)90.6%。Meto等[66]的研究發(fā)現(xiàn)蜂交也具有干擾QS系統(tǒng)的活性，分別用乙醇、丙二醇、聚乙二醇400對(duì)蜂交進(jìn)行提取，并用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)所提取的多酚類化合物進(jìn)行了鑒定。乙醇提取物在抑制微生物生長和生物膜形成方面最有效，其次是丙二醇和聚乙二醇400蜂交提取物。蜂交中的多酚類乙醇提取物中會(huì)導(dǎo)致P.aeruginosa中eDNA的釋放和吩嗪的生成減少。

3.2.1.3 微生物源QSIs

微生物來源的QSIs主要是在細(xì)菌、真菌中，其中來源于放線菌的較少。微生物的培養(yǎng)具有高效性，對(duì)QSIs的開發(fā)具有重要意義。微生物在自然環(huán)境中長期進(jìn)化，與其他生物存在競爭關(guān)系，為了生存可能會(huì)產(chǎn)生QSIs抑制其他競爭性細(xì)菌的QS系統(tǒng)。

Rasmussen等[67]在33 種青霉菌屬Penicillium中發(fā)現(xiàn)了QSIs——棒曲霉素或青霉酸，其可干擾P.aeruginosa的RhlR和LasR受體蛋白。Li Rui等[68]研究發(fā)現(xiàn)類桿菌素作為一種天然抗菌肽，在亞抑菌質(zhì)量濃度1.7 mg/mL下顯著降低了單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）prfA和flgE的表達(dá)，通過抑制生物膜相關(guān)基因（prfA、agrA、flaA、fliG和flgE）的表達(dá)來抑制生物膜的形成。Parasuraman等[69]發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉海洋真菌（Pestalotiopsis sydowiana）提取物具有有效的抑菌性，該提取物在亞抑菌質(zhì)量濃度250 μg/mL和500 μg/mL下，能使P.aeruginosaPAO1受QS調(diào)控的毒力表型如綠膿桿菌素、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等的產(chǎn)量有所減少。此外，還能降低胞外多糖、鼠李糖脂和海藻酸鹽的產(chǎn)量，抑制細(xì)菌生物膜的形成。

內(nèi)生真菌普遍存在于各種植物中，Prateeksha等[70]從地衣中分離得到內(nèi)生真菌（endolichenic fungus，ELF），經(jīng)過丙醇提取后在4 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)P.aeruginosaPAO1具有明顯的抗QS活性，但不影響其細(xì)胞活力。ELF的代謝提取物中存在的棕櫚酸和亞油酸可能對(duì)P.aeruginosaPAO1的毒力因子有抑制作用，對(duì)其生物膜形成也有一定的抑制作用。Mishra等[71]從番木瓜中分離到的內(nèi)生真菌（Alternaria alternata），因其含有一種復(fù)合亞硫酸2-丙基十三酯，能對(duì)P.aeruginosaPAO1表現(xiàn)出QSI和生物膜結(jié)構(gòu)的改變。還可以通過抑制褐藻酸鹽、EPS的產(chǎn)生和eDNA的分泌，抑制了綠膿桿菌色素、彈性蛋白酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等多種致病性狀，并減少了生物膜的形成。隨后，Meena等[72]又研究了從番木瓜中分離的內(nèi)生真菌Phomopsis Tersa對(duì)QS介導(dǎo)的P.aeruginosaPAO1致病性的抑制作用。結(jié)果表明，在亞MIC為900 μg/mL時(shí)，Phomopsis Tersa粗提物可使P.aeruginosaPAO1氧化還原活性色素綠青素和吡哆醇的生成量分別減少92.46%和71.55%。此外，粗提物還能抑制與生物膜形成有關(guān)的毒力因子胞外多糖和海藻酸鹽的表達(dá)。

另外，Wang Mengjia等[73]從一株具有抗QS活性的海洋真菌Cladosporiumsp.Z148中分離到一種新型的QSIs Cladodionen，其可下調(diào)QS相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，包括受體蛋白（lasR、rhlR和pqsR）、自身誘導(dǎo)合成酶（lasI、rhlI和pqsA）以及毒力因子（lasB和rhlA）的mRNA表達(dá)，抑制生物膜的形成。Younis等[74]從海洋沉積物和土壤樣品中分離的嗜鹽菌——海洋鏈霉菌，該海洋鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物可抑制奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）QS的產(chǎn)生。

3.2.2 人工合成的QSIs

近年來，人工合成的QSIs變得更加廣泛，主要是對(duì)信號(hào)分子進(jìn)行修飾、人工合成信號(hào)分子類似物、或者是對(duì)受體蛋白進(jìn)行修飾，使信號(hào)分子不能與受體蛋白進(jìn)行結(jié)合，從而不能形成QS。

呋喃酮是最常見的QSIs，人工合成的呋喃酮QSIs的研究最為廣泛。邢家溧等[75]研究3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮對(duì)P.fluorescens的作用，在質(zhì)量濃度為1 MIC（12.5 μg/mL）和5 MIC（800 μg/mL）時(shí)，對(duì)生物膜的抑制率分別為20.59%和99.54%，72 h的生物膜抑制率均高于24 h的抑制率，這就表明通過干擾其QS系統(tǒng)而影響細(xì)菌生物膜的形成，能夠抑制P.fluorescens的群集運(yùn)動(dòng)能力，干擾其QS系統(tǒng)從而影響其總蛋白合成及多糖的含量，可為在食品中預(yù)防或抑制生物膜的形成提供參考。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，添加了呋喃酮C-30后，可以抑制變形鏈球菌（Streptococcus mutans）生物被膜的形成，使生物膜變薄甚至解體，這與C-30降低了QS調(diào)控基因的表達(dá)活性有關(guān)[76]。Yang Sijie等[77]設(shè)計(jì)了一個(gè)新的溴化呋喃酮類化合物（brominated furanones，BBFs），具有溴代基團(tuán)的雙環(huán)結(jié)構(gòu)。所有的BBFs均能抑制P.aeruginosa毒力因子LasR的產(chǎn)生，其中6-BBF和7-BBF對(duì)lasIQS中的LasR蛋白酶有拮抗作用，而5-BBF對(duì)rhlIQS有促進(jìn)作用，故BBFs的結(jié)構(gòu)變化可以作為控制生物被膜形成的靶向功能。本研究還證明了與其他已知的溴化呋喃酮相比，BBFs對(duì)人體細(xì)胞的毒性更低，為探索低毒且高效抑制生物膜的化合物奠定了基礎(chǔ)。

Kalaiarasan等[78]研究發(fā)現(xiàn)，N-[4-(4-氟苯胺)丁?；鵠-L-高絲氨酸內(nèi)酯和N-[4-(4-氯苯胺]丁?；鵠-L-高絲氨酸內(nèi)酯，可以下調(diào)QS基因的表達(dá)水平，與LasR以氫鍵結(jié)合，使lasQS系統(tǒng)表達(dá)顯著降低，影響了生物膜形成。Sully等[79]通過高通量篩選，在多種化合物中發(fā)現(xiàn)一種能夠抑制S.aureus產(chǎn)生毒力因子的QSIs——Savarin，陰礙了該菌的Agr QS系統(tǒng)，從而抑制其形成生物膜，減輕由S.aureus引起的感染。D’Almeida等[80]在合成香豆素及其羥基化衍生物抑制P.aeruginosa和紫色素桿菌（Chromobacterium violaceum）QS產(chǎn)生的研究中發(fā)現(xiàn)，芳香環(huán)上帶有羥基官能團(tuán)的香豆素比C3、C4上有取代基或者在吡喃酮環(huán)C3、C4上沒有雙鍵的香豆素能更好地抑制P.aeruginosa生物膜形成，吡喃酮環(huán)C3上的羥基在抑制紫色桿菌的群體感應(yīng)和銅綠假單胞菌的彈性蛋白水解酶活性方面非常重要。Valliammai等[81]證實(shí)了5-十二烷醇（5-dodecanolide，DD）對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）的非抗菌生物膜抑制作用。DD處理顯著降低了eDNA的合成、自聚集體、葡萄黃質(zhì)的生物合成和環(huán)狀生物膜的形成。DD處理可以誘導(dǎo)agrA和agrC的表達(dá)，調(diào)節(jié)參與生物膜形成的相關(guān)基因，有學(xué)者利用感染MRSA的線蟲評(píng)估了對(duì)DD在體內(nèi)條件下作為一種有效的抗生物膜制劑的潛力，結(jié)果表明DD能有效地降低MRSA細(xì)胞對(duì)線蟲腸道的黏附，證明DD在體內(nèi)的抗生物被膜潛力。Jiang Kai等[82]合成了一系列以QS轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白CviR為靶點(diǎn)的惡唑烷酮類化合物ZS-12，對(duì)C.violaceumCV026QS具有良好的活性。再以ZS-12為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)合成了18 種3-氨基-2-惡唑烷酮類化合物，初步評(píng)價(jià)了新型惡唑烷酮化合物對(duì)QS的抑制活性。結(jié)果表明，其中13 種化合物都對(duì)P.aeruginosaPAO1的生物膜形成和毒力因子有抑制作用，其中化合物YXL-13的效果最好。

部分天然QSIs和部分合成QSIs匯總?cè)绫?、2所示。

表1 部分天然QSIsTable 1 Some natural QSIs

續(xù)表1

表2 部分合成QSIsTable 2 Some synthetic QSIs

4 結(jié) 語

在食品加工生產(chǎn)過程中，由于生產(chǎn)周期長、加工設(shè)備復(fù)雜，一旦形成了生物膜便難以去除，對(duì)食品生產(chǎn)造成了巨大損失。目前研究僅局限于部分細(xì)菌QS系統(tǒng)調(diào)控生物膜形成的分子機(jī)制，但對(duì)其復(fù)雜多層次的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還未能完全了解，不同調(diào)控系統(tǒng)間的相互影響還需要進(jìn)一步探究。另外，雖然目前已將QSIs作為新型的控制生物膜的方法，并在一定程度上避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，但隨著對(duì)食品安全的要求越來越高，仍需要對(duì)其安全性及作用機(jī)制有更深入的研究，闡明常見食源性微生物QSMs參與生物膜形成的調(diào)控機(jī)制；同時(shí)，尋找來源更廣泛的天然QSIs，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物膜形成的靶向控制，從而保證食品安全。