周宏炫，黃 穎，譚書明*，涂永麗，羅繼偉

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗室，貴州 貴陽 550025）

急性酒精中毒（acute alcoholism，AAH）又稱醉酒，是由于一次過量飲酒導(dǎo)致血液中乙醇濃度過高，從而引起頭暈、惡心嘔吐、昏迷等癥狀，并伴隨著肝臟、心腦血管等多系統(tǒng)損傷的現(xiàn)象，嚴(yán)重危害消費(fèi)者身體健康[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲酒習(xí)慣的改變，AAH的發(fā)病率越來越高，并成為除心腦血管及腫瘤外的世界第三大公共衛(wèi)生問題[2]。肝臟是乙醇代謝的主要器官，AAH最常見的癥狀就是酒精性肝病[3]。研究表明，乙醇造成肝損傷的主要機(jī)制是氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，表現(xiàn)為乙醇可以降低機(jī)體抗氧化能力，誘導(dǎo)肝臟發(fā)生脂質(zhì)過氧化進(jìn)而損傷肝細(xì)胞[4]。近期植物多酚緩解酒精性肝損傷機(jī)制的研究眾多，如蜂蜜多酚、茶多酚、石榴葉多酚、葡萄多酚、蘋果多酚等均被證明有較好的護(hù)肝作用，其作用機(jī)理包括激活機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)、抑制脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)信號通路，從而改善肝損傷[5]。

刺梨（Rosa roxburghiiTratt.）屬薔薇科多年生落葉小灌木，廣泛分布于中國西南地區(qū)[6]，具有抗炎[7]、抗氧化[8]、抗癌[9]和抗動脈粥樣硬化[10]等作用。刺梨富含多種生物活性成分，如VC、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多酚和多糖等，因此被譽(yù)為“中國三大新興水果之一”[11]。刺梨中多酚類物質(zhì)含量豐富，具有多元酚結(jié)構(gòu)，主要由沒食子酸、兒茶素、鞣花酸、綠原酸、阿魏酸、表兒茶素等成分復(fù)合而成，是極具開發(fā)利用價值的優(yōu)質(zhì)資源[12]。目前相關(guān)人員對刺梨多酚（Rosa roxburghiiTratt.polyphenols，RRTP）的功能研究多集中在美白[13]、抗氧化[14]方面，而有關(guān)其對AAH的解酒和護(hù)肝作用研究鮮見報道。

本研究采用一次灌胃過量白酒的方式建立大鼠AAH模型，通過測定血液乙醇質(zhì)量濃度和肝臟乙醇代謝酶活力考察RRTP的解酒作用；通過生化指標(biāo)測定、病理學(xué)檢查以及實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測，進(jìn)一步研究RRTP對AAH大鼠肝臟的保護(hù)作用，并從肝臟組織氧化損傷角度探討其作用機(jī)制，以期為RRTP保健食品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性SD大鼠由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，體質(zhì)量為180～200 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014。

刺梨 貴州宏財聚農(nóng)投資集團(tuán)有限責(zé)任公司；白酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)56%） 北京紅星股份有限公司；海王金樽（主要成分為牡蠣提取物） 深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司。

AB-8大孔樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司；乙醇、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）ELISA試劑盒 上海橋杜生物科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色液 賽維爾生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒、TRIzol試劑盒 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SG8200HPT超聲波清洗儀 上海冠特超聲儀器有限公司；CTFD-12S真空冷凍干燥機(jī) 青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；Stepone plus型熒光定量PCR儀 美國ABI公司；SpectraMax190連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；H1-16KR高速冷凍離心機(jī)湖南可成儀器設(shè)備有限公司；DY89-II電動玻璃勻漿機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；BMJ-III型包埋機(jī)常州郊區(qū)中威電子儀器廠；Motic BA400生物顯微鏡麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；MODEL SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 RRTP的制備

稱取20 g切碎的新鮮刺梨果，以料液比1∶10加入60%（體積分?jǐn)?shù)，后同）的乙醇溶液，于50 ℃、350 W條件下超聲提取60 min后抽濾，收集濾液，于45 ℃條件下旋蒸去除乙醇。參考文獻(xiàn)[15]提取RRTP，得到凍干的RRTP。采用Folin-Ciocalteu法[16]測得RRTP樣品中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.41%。

1.3.2 動物分組與建模

60 只雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組以及RRTP低、中、高劑量組，每組10 只。實(shí)驗室溫度（22±2）℃、相對濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)，自由飲水、飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，每日給正常組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，陽性對照組每日灌胃100 mg/kgmb的海王金樽，RRTP低、中、高劑量組分別每日灌胃50、100、200 mg/kgmb的RRTP，灌胃量均為10 mL/kgmb，連續(xù)30 d。于末次給藥30 min后，除正常組給予生理鹽水外，其他5 組均灌胃白酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)56%）。根據(jù)本實(shí)驗室前期研究[17]，選擇白酒灌胃劑量15 mL/kgmb進(jìn)行灌胃，建立AAH模型。

1.3.3 血清指標(biāo)測定

分別于灌酒后30、60、90、120 min剪尾取血，止血后放回籠中，血液于4 ℃、3 000 r/min離心15 min得到上清液即血清，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的測定。使用試劑盒測定血液中的乙醇質(zhì)量濃度。然后于灌酒后12 h摘眼球取血，收集的血液于4 ℃、3 000 r/min離心15 min得到上清液，使用相應(yīng)試劑盒檢測血清中ALT、AST和TG水平。

1.3.4 肝臟指標(biāo)測定

摘除眼球采血完成后，頸椎脫臼處死大鼠，快速取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水漂洗并用濾紙吸干。剪取少量肝組織，加入9 倍體積的生理鹽水，采用電動玻璃勻漿機(jī)于冰上勻漿，在4 ℃條件下，以2 500 r/min離心10 min，得到上清液。按照試劑盒說明書的方法測定肝臟組織中ADH、ALDH、SOD、GSH-Px、CAT活力以及MDA、GSH含量。

1.3.5 肝臟切片觀察

參照Song Haizhao等[18]的方法，將肝臟組織樣品浸泡在體積分?jǐn)?shù)10%的福爾馬林溶液中固定，經(jīng)脫水、包埋、切片及HE染色處理后，使用光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變。

1.3.6 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

按照TRIzol試劑盒說明書，液氮研磨肝臟組織后轉(zhuǎn)入離心管，加入TRIzol提取劑處理組織，5 min后加入氯仿，以12 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀后室溫晾干得到大鼠肝組織總RNA，將mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行定量PCR檢測核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的mRNA相對表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸34 s，40 個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計算基因的mRNA相對表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Sequences of primers used for amplification of target genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 RRTP對AAH大鼠血液乙醇質(zhì)量濃度的影響

一次過量攝入乙醇會引起血液中乙醇質(zhì)量濃度的急劇升高，如表2所示，與正常組相比，模型組大鼠血液乙醇質(zhì)量濃度顯著上升（P＜0.05），并于灌酒后30 min達(dá)到最高值316.95 mg/dL，而后緩慢下降，到120 min時仍具有較高水平，說明AAH模型建立成功；與模型組相比，RRTP低劑量組在灌酒后60、90 min時可顯著降低血液中的乙醇質(zhì)量濃度（P＜0.05），而中、高劑量組在灌酒后30、60、90、120 min時均可顯著降低血液乙醇質(zhì)量濃度（P＜0.05）。結(jié)果表明，RRTP對AAH大鼠具有一定的解酒作用，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表2 RRTP對大鼠血液乙醇質(zhì)量濃度的影響（n ＝10）Table 2 Effect of RRTP on blood alcohol concentration in rats with acute alcoholism (n = 10)mg/dL

2.2 RRTP對AAH大鼠乙醇代謝酶的影響

ADH和ALDH是乙醇代謝的關(guān)鍵酶，其活力的變化會直接影響血液中的乙醇濃度[19]。如表3所示，與正常組相比，模型組肝臟中ADH和ALDH活力顯著升高（P＜0.05），表明飲酒會增強(qiáng)大鼠體內(nèi)乙醇代謝酶活力。與模型組相比，陽性對照組及RRTP低、中、高劑量組均能顯著增強(qiáng)AAH大鼠肝臟ADH活力（P＜0.05）；中、高劑量RRTP組中ALDH活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），但低劑量RRTP組ALDH活力無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明RRTP可以通過增強(qiáng)ADH和ALDH活力加快乙醇代謝，從而降低血液中的乙醇水平。

表3 RRTP對大鼠肝臟ADH和ALDH活力的影響（n＝10）Table 3 Effect of RRTP on ADH and ALDH activities in liver of rats (n = 10)

2.3 RRTP對AAH大鼠肝損傷的影響

血清ALT、AST和TG水平是評價急性肝損傷的重要指標(biāo)，過量飲酒會導(dǎo)致肝臟受損，引起血清ALT、AST和TG水平顯著升高[20]。如表4所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST和TG水平顯著上升（P＜0.05），表明AAH會誘導(dǎo)肝臟發(fā)生損傷，提示急性酒精性肝損傷模型建立成功；與模型組相比，陽性對照組和RRTP各劑量組均能顯著降低大鼠血清中ALT、AST和TG水平（P＜0.05），表明RRTP對肝臟具有一定的保護(hù)作用。

表4 RRTP對大鼠血清中ALT、AST和TG水平的影響（n ＝10）Table 4 Effect of RRTP on serum ALT, AST and TG levels in rats (n = 10)

2.4 RRTP對AAH大鼠氧化應(yīng)激的影響

低水平SOD、GSH-Px、CAT、GSH和高水平MDA是肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志[21]。如表5所示，與正常組相比，模型組大鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量均顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.05），表明乙醇致肝損傷大鼠肝臟抗氧化能力降低，氧化應(yīng)激增強(qiáng)。與模型組相比，RRTP各劑量組均能顯著增加大鼠肝臟SOD、GSH-Px活力，顯著降低MDA水平（P＜0.05）；其次，RRTP也能明顯增加CAT和GSH水平，盡管僅在RRTP高劑量組中觀察到統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)果說明RRTP能改善肝臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表5 RRTP對大鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活力和GSH、MDA水平的影響（n＝10）Table 5 Effect of RRTP on SOD, CAT and GSH-Px activities, and GSH and MDA levels in liver of rats (n = 10)

2.5 RRTP對Nrf2、HO-1 mRNA相對表達(dá)水平的影響

圖1A、B分別顯示了Nrf2、HO-1在AAH大鼠肝臟中的表達(dá)情況。與正常組比較，模型組大鼠肝組織中Nrf2、HO-1mRNA相對表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），表明乙醇可以抑制Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號通路。與模型組比較，陽性對照組大鼠肝組織Nrf2、HO-1mRNA的表達(dá)量顯著提升（P＜0.05），不同的RRTP劑量組HO-1mRNA相對表達(dá)水平均顯著提升（P＜0.05），Nrf2mRNA相對表達(dá)水平只有中、高劑量組顯著升高（P＜0.05），說明RRTP可以劑量依賴的激活Nrf2/ARE通路，提高機(jī)體抗氧化體系能力。

圖1 RRTP對大鼠肝組織中Nrf2（A）和HO-1（B）mRNA相對表達(dá)水平的影響Fig.1 Effect of RRTP on mRNA expression of Nrf2 (A) and HO-1 (B)in liver of rats

2.6 RRTP對AAH大鼠肝臟的組織病理學(xué)影響

由圖2肝臟HE染色結(jié)果可知，正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肝索排列規(guī)則，在中央靜脈呈放射狀排列，胞漿內(nèi)無脂滴，肝竇未見明顯淤血擴(kuò)張及炎性浸潤。模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)局部壞死，肝索排列紊亂，胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不一的脂滴，并伴有少量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，陽性對照組及3 個RRTP劑量組肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，陽性對照組肝索排列整齊，肝竇無擴(kuò)張，少量肝細(xì)胞出現(xiàn)輕微的變性和壞死；RRTP低劑量組有少量肝細(xì)胞發(fā)生變性壞死，胞漿內(nèi)有部分脂滴出現(xiàn)；RRTP中、高劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，肝索形狀排列比較清晰，胞漿內(nèi)無脂滴出現(xiàn)，脂肪變性程度輕于低劑量組。

圖2 大鼠肝臟組織病理學(xué)變化Fig.2 Histological observations of liver tissues

3 討 論

AAH是由過量飲酒引起的，對全球發(fā)病率和死亡率有重要影響[22]。研究表明，攝入的乙醇經(jīng)胃腸道吸收后迅速分散到血液中，引起血液乙醇含量的上升，之后被輸送到肝臟中進(jìn)行代謝而清除[23]。ADH和ALDH是體內(nèi)參與乙醇代謝的關(guān)鍵酶，主要存在于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。乙醇經(jīng)ADH氧化成乙醛，再通過ALDH氧化為乙酸，乙酸進(jìn)一步代謝成H2O和CO2排出體外，從而顯著降低血液中的乙醇含量[24]。本研究結(jié)果顯示，AAH大鼠血液中的乙醇質(zhì)量濃度急劇上升，肝臟ADH和ALDH活力增加；相比于模型組，RRTP預(yù)處理顯著降低血液乙醇水平（P＜0.05），且ADH和ALDH活力進(jìn)一步增強(qiáng)。說明RRTP能通過提高ADH和ALDH活力加快乙醇代謝，降低血液乙醇質(zhì)量濃度，具有一定的解酒作用。該結(jié)果與Kaviarasan等[25]對葫蘆巴多酚解酒機(jī)理的研究結(jié)果相同。

ALT和AST是存在于肝細(xì)胞漿和線粒體的兩種主要轉(zhuǎn)氨酶。正常情況下，ALT和AST在血清中的含量很少，但當(dāng)肝臟受到損傷時，肝細(xì)胞膜通透性增加，ALT和AST就會滲透至血液中，所以血清中的ALT和AST水平可反映肝臟的健康狀況[26]；TG水平升高是肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性的早期表現(xiàn)；臨床上通常將ALT、AST和TG水平作為反映肝損傷程度的血清學(xué)指標(biāo)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清ALT、AST和TG水平顯著升高，病理組織切片也顯示肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，胞漿內(nèi)有大量脂滴出現(xiàn)；而RRTP組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整，脂肪變性程度減輕，且ALT、AST和TG水平均降低，表明AAH會引起大鼠肝細(xì)胞變性或壞死，補(bǔ)充RRTP能顯著減輕乙醇引起的肝損傷。與邢佳等[28]研究的石榴葉多酚能夠降低血清ALT、AST和TG水平，對急性酒精性肝損傷具有保護(hù)作用的結(jié)論一致。

大量研究表明，乙醇造成的肝損傷與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)密切相關(guān)。乙醇在體內(nèi)代謝主要依賴于肝臟，攝入過量乙醇會超過肝臟的代謝能力，促進(jìn)大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，這些ROS會破壞機(jī)體內(nèi)部氧化-抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)失衡[29]，而在體內(nèi)過度累積會引發(fā)脂質(zhì)過氧化進(jìn)而損傷肝細(xì)胞。因此，AAH易導(dǎo)致酒精性肝損傷。在內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中，SOD/GSH-Px/CAT是最主要的一組抗氧化酶，它們共同抵御機(jī)體受到的氧化應(yīng)激損傷。SOD主要將ROS轉(zhuǎn)化為過氧化氫，然后經(jīng)GSH-Px和CAT將過氧化氫進(jìn)一步分解成水[30]。此外，GSH也是抵抗氧化應(yīng)激的重要防御線，可直接清除體內(nèi)的ROS[31]。這些抗氧化劑均能保護(hù)肝臟免受氧化應(yīng)激的損害，但很容易被脂質(zhì)過氧化物清除。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，其不僅會干擾抗氧化防御，還會引起肝細(xì)胞的變性和壞死，使血液中ALT、AST和TG水平升高[32]。在本研究中，模型組大鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量顯著下降（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），表明AAH后機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力降低，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的積累從而引起肝細(xì)胞損傷。而預(yù)處理RRTP能夠明顯增加肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量，降低MDA含量，表明RRTP可通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來改善急性酒精引起的肝損傷，與相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果[33]一致。

Nrf2/ARE通路作為抵抗內(nèi)外界氧化的防御性信號通路，在維持機(jī)體的抗氧化體系中占有重要的地位[34]。Nrf2是調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，能進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合形成Nrf2/ARE通路，調(diào)控下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。HO-1是Nrf2/ARE通路調(diào)節(jié)的主要抗氧化防御基因，具有清除自由基、保護(hù)細(xì)胞的作用[35]。因此，Nrf2/ARE抗氧化信號通路可能會成為治療酒精性肝損傷的有效靶點(diǎn)[36]。Shu Guangwen等[37]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇暴露會下調(diào)Nrf2、HO-1表達(dá)量，本實(shí)驗顯示急性乙醇攝入會顯著降低肝組織Nrf2及其下游的HO-1mRNA相對表達(dá)水平，而RRTP能夠劑量依賴地提高Nrf2和HO-1mRNA相對表達(dá)水平，說明RRTP可能通過調(diào)控Nrf2/ARE通路提高機(jī)體抗氧化防御能力，發(fā)揮對急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

RRTP具有良好的解酒和護(hù)肝作用，可改善因乙醇引起的醉酒和肝損傷，其解酒機(jī)制可能與增強(qiáng)乙醇代謝酶活力有關(guān)；能夠通過抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化而改善肝損傷，其抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制可能與上調(diào)肝組織Nrf2/ARE信號通路中Nrf2表達(dá)和激活其下游抗氧化酶HO-1相關(guān)。因此，RRTP可作為功能保健食品緩解因乙醇引起的AAH，其能否改善晚期酒精性肝損傷如纖維化、肝硬化等仍有待研究。