溫永平，唐季清，韓 冬，孫 健，劉 軍，江正強(qiáng),*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，中國(guó)輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司，北京 101107）

機(jī)體免疫是人體抵御感染性疾病、降低腫瘤及其他免疫性相關(guān)疾病發(fā)生的關(guān)鍵[1-2]。人體胃腸道中的上皮細(xì)胞、大型噬菌體、樹(shù)突細(xì)胞和微生物之間的相互作用可誘導(dǎo)T細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響人體的免疫調(diào)節(jié)。因此，人體胃腸道系統(tǒng)被認(rèn)為是人體最大的免疫器官[3]。早在1994年，就有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)由La1嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌發(fā)酵的酸奶具有提高人體內(nèi)沙門(mén)氏菌Ty21a特異性免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）及總IgA的含量和增強(qiáng)機(jī)體體液免疫能力的功能[4]。酸奶中雙歧桿菌不僅可以通過(guò)腸道表皮細(xì)胞附著，刺激腸道免疫細(xì)胞并調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，還可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物組成及結(jié)構(gòu)改善腸道免疫[5-7]。此外，牛乳中含有的寡糖等經(jīng)益生菌發(fā)酵后產(chǎn)生的肽類等可以進(jìn)一步提高酸奶的免疫調(diào)節(jié)活性[8]。因此，酸奶因其富含免疫活性物質(zhì)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫中呈現(xiàn)較大的潛力。

益生元主要包括膳食纖維和功能性低聚糖等，可被益生菌代謝利用從而促進(jìn)其增殖并提高活性，發(fā)揮改善人體健康的功效[9]。魔芋甘露寡糖（konjac mannanoligosaccharides，KMOS）是由β-D-甘露糖和β-D-葡萄糖殘基組成的一種功能性低聚糖，通過(guò)魔芋葡甘露聚糖水解制備[10]。KMOS的益生活性已得到廣泛證實(shí)，且具有多種有益人體健康的生理功能，如抗氧化、抗菌、抗炎、通便以及調(diào)節(jié)腸道炎癥等[11-12]。Liu Xiaoyan等[13]研究發(fā)現(xiàn)KMOS具有緩解便秘、改善腸道微環(huán)境的功效。經(jīng)體外糞便培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，KMOS可以顯著提高人糞便中雙歧桿菌以及奇異菌等有益菌的相對(duì)豐度，并降低普雷沃氏菌的比例[14]。飼喂KMOS的黃顙魚(yú)腸道中雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加，且大腸桿菌及產(chǎn)氣單胞菌的數(shù)量顯著降低[15]。此外，KMOS還具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性，可促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞分泌一氧化氮、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10以及IL-6[16]。KMOS對(duì)于糖代謝紊亂也具有一定的效果，可調(diào)節(jié)餐后血糖[17]。

益生元被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，如乳制品、焙烤食品、肉制品及休閑食品等。其中，低聚果糖、低聚木糖、菊粉等益生元已在發(fā)酵乳制品中大量應(yīng)用[18]。添加益生元可以提高酸奶中的活菌數(shù)量，增強(qiáng)酸奶的益生功能，調(diào)節(jié)宿主健康[19]。通過(guò)影響酸奶中微生物的生長(zhǎng)和代謝，益生元的添加可改變酸奶中風(fēng)味物質(zhì)（如乳酸、乙酸、乙醛等）的產(chǎn)生，從而影響酸奶感官品質(zhì)，提升酸奶的風(fēng)味和質(zhì)地[20]。酸奶中添加益生元可改變酸奶的保水性、流變性和黏度等，從而提高酸奶的穩(wěn)定性[21]。此外，益生元的添加還可以強(qiáng)化酸奶的營(yíng)養(yǎng)功效，開(kāi)發(fā)具有功能活性的酸奶制品。益生元能夠促進(jìn)結(jié)腸對(duì)礦物質(zhì)的吸收，在酸奶中添加益生元有助于提高人體對(duì)酸奶中鈣的吸收率[22]。Minekus等[23]將平均分子質(zhì)量為20 000 Da的瓜爾豆交部分水解物（partially hydrolyzed guar gum，PHGG）（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，溶液黏度約10 mPa·s）添加到酸奶中，設(shè)計(jì)3%和6%兩組添加量，利用體外胃腸道模型研究酸奶對(duì)腸道利用脂肪和膽固醇的影響，發(fā)現(xiàn)添加PHGG的酸奶能夠降低脂肪和膽固醇的利用率，酸奶中添加3%、6%的PHGG能使脂肪利用率由79.4%（對(duì)照，未添加PHGG）分別降低至70.8%、60.1%，膽固醇利用率由82.2%（對(duì)照，未添加PHGG）分別降低至75.4%、64.0%。進(jìn)一步的人體實(shí)驗(yàn)表明，添加PHGG的酸奶具有降血脂作用[24]。目前，關(guān)于KMOS在酸奶中的應(yīng)用及其對(duì)酸奶健康功效影響的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺（cyclophosphomide，CTX）誘導(dǎo)建立免疫抑制小鼠模型評(píng)價(jià)KMOS添加對(duì)酸奶免疫調(diào)節(jié)活性的改善作用，通過(guò)對(duì)小鼠腸道內(nèi)容物進(jìn)行菌群分析，評(píng)價(jià)添加KMOS的酸奶對(duì)于免疫抑制小鼠腸道菌群組成及結(jié)構(gòu)的影響，研究結(jié)果可為益生元功能性發(fā)酵乳制品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

BALB/C雄性小鼠（8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0010）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

酸奶樣品由蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司提供，制備方法如下：以鮮牛乳為原料，KMOS添加量分別為0（對(duì)照組不添加KMOS）、0.5%（以鮮牛乳質(zhì)量計(jì)，下同）、1.0%、2.0%，蔗糖添加量為7%，物料在65 ℃下攪拌均勻，95 ℃殺菌5 min。待物料冷卻至40 ℃左右時(shí)，接種普通發(fā)酵劑Mild 1.0，接種量為1×106CFU/g，同時(shí)接種1×107CFU/g動(dòng)物雙歧桿菌BB-12。接種后攪拌均勻并置于42 ℃發(fā)酵箱進(jìn)行發(fā)酵（5 h）。發(fā)酵結(jié)束后，攪拌破乳（150 r/min、1 min），水浴冷卻至20 ℃以下，置于4 ℃冰箱中后熟16 h。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料（D12450B） 北京科奧協(xié)力飼料有限公司；KMOS（分子質(zhì)量約342.3～1 639.44 Da，甘露糖與葡萄糖的物質(zhì)的量比1.45∶1，聚合度2～10）西安源森生物科技有限公司；CTX 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國(guó)Thermo Fisher公司；中性紅、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、WST-1美國(guó)Sigma公司；胎牛血清 以色列Biological Industries公司；IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Biolegend公司。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜 濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；液氮生物容器 樂(lè)山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司；LDX-30KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)熱電公司；XDL-2型倒置生物顯微鏡 重慶廣電儀器有限公司；GL-20B高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Multiskan FC型酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 BALB/C小鼠飼養(yǎng)及分組

BALB/C小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件：溫度（20±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%、12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，所有實(shí)驗(yàn)小鼠自由攝食和飲水。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將BALB/C小鼠隨機(jī)分為7 組（n＝10）：正常組（NC組）：生理鹽水（10 mL/kgmb）；模型組（MC組）：CTX（80 mg/kgmb）；RY組：CTX（80 mg/kgmb）+酸奶（BB-12）；NBB組：CTX（80 mg/kgmb）+酸奶（1.0% KMOS）；LKM組：CTX（80 mg/kgmb）+酸奶（0.5% KMOS+BB-12）；MKM組：CTX（80 mg/kgmb）+酸奶（1.0%KMOS+BB-12）；HKM組：CTX（80 mg/kgmb）+酸奶（2.0% KMOS+BB-12）。實(shí)驗(yàn)第1、2、6天，除正常組外，其他各組小鼠腹腔注射CTX（80 mg/kgmb），誘導(dǎo)建立免疫抑制模型。實(shí)驗(yàn)第3～9天，每天給各正常組和處理組小鼠分別灌胃10 mL/kgmb生理鹽水和酸奶樣品。實(shí)驗(yàn)期間，除適應(yīng)期外，每天測(cè)量一次體質(zhì)量。每日灌胃期間，觀察并記錄所有實(shí)驗(yàn)小鼠的活動(dòng)狀態(tài)、毛色、攝食、飲水及大、小便等情況。末次處理24 h后，眼眶取血并收集血清。將各處理組第9天小鼠體質(zhì)量與處理前（適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后）小鼠體質(zhì)量的差值除以第9天小鼠體質(zhì)量記為體質(zhì)量增長(zhǎng)率。將各處理組第9天小鼠脾臟質(zhì)量與小鼠體質(zhì)量的比值記為脾臟臟體比。

本研究嚴(yán)格遵守北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例，本研究的所有操作程序和方法均遵守中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范及倫理委員會(huì)規(guī)范。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞分離

頸椎脫臼處死BALB/C小鼠，采用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液浸泡小鼠3 min后腹腔注射5 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.05 mol/L、pH 7.0，下同），輕揉腹部2 min并小心剪開(kāi)腹壁，用吸管吸取腹腔液于離心管中，反復(fù)收集3 次。將所得腹腔液1 000×g離心8 min，去上清液，用含體積分?jǐn)?shù)10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)的比例超過(guò)95%。在5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，除去未貼壁細(xì)胞，收集得到純化的腹腔巨噬細(xì)胞。

無(wú)菌分離摘取脾臟，稱質(zhì)量后用剪刀剪碎，在200 目不銹鋼網(wǎng)上用注射器交塞輕輕壓碎，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗過(guò)濾，收集細(xì)胞懸浮液，1 200×g離心15 min，加入紅細(xì)胞裂解液反應(yīng)5 min后中止裂解，1 200×g條件下離心15 min，除去上清液，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，收集未貼壁的細(xì)胞懸液即為脾淋巴細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)比例超過(guò)95%。

1.3.3 巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅吞噬活性測(cè)定

將分離所得腹腔巨噬細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，向96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入200 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度1×105個(gè)/孔。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入1 mg/mL的中性紅溶液（溶劑為PBS），于CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h。傾去上清液，用PBS沖洗3 次，每孔加入細(xì)胞裂解液（乙醇、冰醋酸體積比1∶1）100 μL，室溫下放置2 h，待細(xì)胞溶解后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其在540 nm波長(zhǎng)處的OD值。對(duì)照組為分離所得腹腔巨噬細(xì)胞與PBS共培養(yǎng)，空白組不含分離所得腹腔巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞吞噬率按式（1）計(jì)算[25]。

1.3.4 脾淋巴細(xì)胞增殖率測(cè)定

取分離所得脾淋巴細(xì)胞，按5×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度加入至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，向各孔分別加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL LPS以及5 μg/mL ConA。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL WST-1溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。對(duì)照組采用等體積的蒸餾水代替LPS與ConA。脾淋巴細(xì)胞增殖率按式（2）計(jì)算[26]。

1.3.5 血清免疫球蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

取小鼠血清，通過(guò)免疫比濁法并采用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清樣本中IgA、IgG和IgM的水平[27]。

1.3.6 巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放水平的測(cè)定

將分離得到的腹腔巨噬細(xì)胞按5×105個(gè)/孔的密度加入至24 孔板，加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS，于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MCP-1的質(zhì)量濃度。

1.3.7 基于盲腸內(nèi)容物的16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序的腸道菌群分析

小鼠處死后切開(kāi)腹腔，取盲腸內(nèi)容物并于-80 ℃保存于凍存管中備用。采用DNA提取試劑盒并按照操作說(shuō)明對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物中的總DNA進(jìn)行提取，選擇16S rRNA基因V3～V4區(qū)域引物（341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增并建立全長(zhǎng)466 bp的16S rDNA擴(kuò)增子文庫(kù)，實(shí)驗(yàn)中各處理組隨機(jī)選擇7 個(gè)獨(dú)立樣品并采用Illumina MiSeq-PE250系統(tǒng)上機(jī)測(cè)序。采用QIIME2軟件進(jìn)行擴(kuò)增子高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控、標(biāo)定和分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)整理分析采用SPSS 24.0軟件，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，作圖采用Origin 8.0和GraphPad Prism 7軟件。采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加KMOS酸奶對(duì)小鼠體質(zhì)量和脾臟臟體比的影響

體質(zhì)量增長(zhǎng)率和脾臟臟體比可反映實(shí)驗(yàn)小鼠基本生理狀態(tài)。如圖1所示，與NC組相比，經(jīng)CTX誘導(dǎo)后小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)率以及脾臟臟體比顯著降低。灌胃酸奶（0% KMOS+BB-12、1% KMOS、0.5% KMOS+BB-12及1% KMOS+BB-12）可顯著抑制由于CTX誘導(dǎo)引起的小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率下降，緩解由于CTX誘導(dǎo)引起的小鼠脾臟臟體比下降。與CTX處理組（MC組）相比，灌胃含0.5% KMOS及動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的酸奶（LKM組）可顯著提高小鼠脾臟臟體比，提高了75.5%，而灌胃單純含1% KMOS（NBB組）或動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的酸奶（RY組）雖可提高免疫抑制小鼠脾臟臟體比，但提升效果不顯著。結(jié)果表明，KMOS的添加可以進(jìn)一步改善含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶對(duì)CTX誘導(dǎo)引起的小鼠基本生理狀態(tài)惡化。

圖1 添加KMOS酸奶對(duì)免疫抑制小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率（A）和脾臟臟體比（B）的影響Fig.1 Effect of yogurt fortified with KMOS on percentage body mass gain (A) and spleen to body mass ratio (B) of immunosuppressed mice

2.2 添加KMOS酸奶對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

巨噬細(xì)胞是固有免疫的重要組成部分，其吞噬能力是巨噬細(xì)胞最關(guān)鍵和基礎(chǔ)的功能，部分反映了機(jī)體固有免疫活性[28]。如圖2所示，經(jīng)CTX誘導(dǎo)后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬率顯著降低，而灌胃添加KMOS的酸奶緩解了由于CTX誘導(dǎo)引起的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率下降。與CTX處理組（MC組）相比，灌胃添加0.5%、1.0% KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的酸奶（LKM/MKM組）可顯著提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率，且含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶中KMOS的添加對(duì)于免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的改善作用優(yōu)于單純含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶（RY組）。結(jié)果表明，灌胃添加KMOS的酸奶可有效緩解CTX誘導(dǎo)引起的小鼠固有免疫活性下降。

圖2 添加KMOS酸奶對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.2 Effect of yogurt fortified with KMOS on the phagocytic activity of peritoneal macrophages from immunosuppressed mice

2.3 添加KMOS酸奶對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響

淋巴細(xì)胞是機(jī)體獲得性免疫的重要組成部分，其增殖活性部分反映了機(jī)體獲得性免疫活性[29]。如圖3所示，與正常組（NC組）相比，CTX處理組（MC組）小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA和LPS分別誘導(dǎo)后增殖率均顯著降低。對(duì)于由CTX處理引起的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的降低，灌胃添加0.5% KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶（LKM組）可起到顯著改善作用，而灌胃單純含1.0% KMOS的酸奶（NBB組）無(wú)顯著改善作用。KMOS的添加可進(jìn)一步提高含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶對(duì)ConA和LPS誘導(dǎo)后的免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率，其中灌胃添加0.5% KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶（LKM組）的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率顯著高于其他各組。以上結(jié)果表明添加KMOS可增強(qiáng)含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶對(duì)免疫抑制小鼠獲得性免疫活性的改善作用。

圖3 KMOS添加酸奶對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響Fig.3 Effect of yogurt fortified with KMOS on the proliferation rate of splenic lymphocytes from immunosuppressed mice

2.4 添加KMOS酸奶對(duì)小鼠血清免疫球蛋白質(zhì)量濃度的影響

血清中IgG、IgM和IgA質(zhì)量濃度可部分反映機(jī)體體液免疫活性[30]。如圖4所示，CTX誘導(dǎo)處理顯著降低了小鼠血清中IgG、IgM和IgA的質(zhì)量濃度，而相較于CTX處理組（MC組），灌胃單純含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶（RY組）后，小鼠血清中IgG、IgM和IgA的質(zhì)量濃度分別提高了43.8%、76.3%和44.9%；灌胃添加1.0% KMOS酸奶（NBB組）的小鼠血清中IgM質(zhì)量濃度提高了46.1%，IgG和IgA的質(zhì)量濃度無(wú)顯著變化。灌胃添加0.5% KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶（LKM組）較單一添加KMOS和動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶對(duì)免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白質(zhì)量濃度的效果更好，LKM組的小鼠血清中IgG、IgM和IgA的質(zhì)量濃度較CTX處理組（MC組）分別提高127.3%、108.2%和61.1%。因此，添加KMOS可提高含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶對(duì)于免疫抑制小鼠體液免疫活性抑制的緩解作用。

圖4 添加KMOS酸奶對(duì)免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of yogurt fortified with KMOS on serum levels of immunoglobulins in immunosuppressed mice

2.5 添加KMOS酸奶對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放的影響

巨噬細(xì)胞激活后可釋放炎癥因子，活化機(jī)體的獲得性免疫反應(yīng)并加速炎癥細(xì)胞的聚集[31]。如表1所示，CTX誘導(dǎo)顯著降低了小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MCP-1的釋放。與CTX處理組（MC組）相比，灌胃單純含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶（RY組）的免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MCP-1的釋放水平分別提高155.8%、111.1%、184.9%、85.2%和86.6%，而灌胃單純添加1% KMOS酸奶（NBB組）的免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放水平與CTX處理組（MC組）無(wú)顯著差異。含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶中添加0.5% KMOS可進(jìn)一步促進(jìn)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放，經(jīng)灌胃后免疫抑制小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MCP-1水平較MC組分別提高374.5%、231.5%、277.0%、195.8%和205.1%。而對(duì)于MKM、HKM組小鼠，腹腔巨噬細(xì)胞中IL-1β及IL-6的釋放水平與MC組相比無(wú)明顯變化，而IL-10、TNF-α和MCP-1的釋放水平較MC組顯著提高。因此，添加KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶可有效緩解CTX誘導(dǎo)引起的小鼠固有免疫活性的下降。

表1 添加KMOS酸奶對(duì)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放的影響Table 1 Effect of yogurt fortified with KMOS on inflammatory cytokine release from peritoneal macrophages from immunosuppressed mice

2.6 添加KMOS酸奶對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響

菌群分析結(jié)果如圖5所示，灌胃添加KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶可影響小鼠腸道微生物組成。通過(guò)16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序?qū)π∈竺つc內(nèi)容物中的腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，與MC組相比，不同處理組小鼠腸道內(nèi)容物中擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的相對(duì)豐度均未發(fā)生明顯改變，而灌胃添加2.0% KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶（HKM組）小鼠腸道內(nèi)容物中非優(yōu)勢(shì)菌門(mén)腸道菌群變化顯著，其中嗜熱絲菌門(mén)（Caldiserica）、迷蹤菌門(mén)（Elusimicrobia）和纖維桿菌門(mén)（Fibrobacteres）腸道菌群的相對(duì)豐度明顯上升（圖5A）。

圖5 添加KMOS酸奶對(duì)免疫抑制小鼠腸道內(nèi)容物菌群組成的影響Fig.5 Effect of yogurt fortified with KMOS on the composition of intestinal microbiota in immunosuppressed mice

通過(guò)各處理組小鼠腸道內(nèi)容物的16S rDNA測(cè)序結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，灌胃添加2.0% KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶（HKM組）可顯著增加小鼠腸道中非優(yōu)勢(shì)菌種的數(shù)量，如α變形菌綱（Alphaproteobacteria）、β變形菌綱（Betaproteobacteria）和芽孢桿菌目（Bacillus）細(xì)菌（圖6A～C）。α變形菌綱內(nèi)多株菌株對(duì)宿主健康具有調(diào)節(jié)作用。研究人員從伊朗傳統(tǒng)酸奶中分離出兩株α變形菌綱的醋酸桿菌（Acetobacteria），可以在低pH值（2.5）、低膽酸鹽（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%）環(huán)境中保持較高活菌數(shù)并對(duì)多種食源致病菌具有抑制作用。此外，部分醋桿菌屬的菌株對(duì)癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒害作用。CTX處理（MC組）顯著提高了小鼠腸道內(nèi)容物中梭菌屬（Clostridium）的相對(duì)豐度（圖6D）。而灌胃添加1%、2% KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶（MKM、HKM組）可明顯緩解由CTX誘導(dǎo)引起的梭菌屬數(shù)量的增加。梭菌屬中很多菌株對(duì)宿主腸道健康可產(chǎn)生不利影響，如艱難梭菌（Clostridium difficile）及產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）等菌株作為食源性致病菌可導(dǎo)致宿主腸道炎癥。

圖6 添加KMOS酸奶對(duì)小鼠腸道內(nèi)容物中菌群ASV數(shù)量的影響Fig.6 Effect of yogurt fortified with KMOS on the number of amplicon sequence variants from intestinal microbiota in immunosuppressed mice

3 討 論

酸奶具有獨(dú)特的風(fēng)味、豐富的營(yíng)養(yǎng)以及良好的健康功效，消費(fèi)量日益增長(zhǎng)[32]。隨著大眾健康意識(shí)不斷提高，對(duì)于功能性食品的需求亦持續(xù)增長(zhǎng)。因此，功能性強(qiáng)化酸奶產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)已成為食品研究的熱點(diǎn)之一[33]。益生元如膳食纖維和功能性低聚糖等，具有良好的加工性能及功能活性，在酸奶中的應(yīng)用正逐漸增加。酸奶作為一種發(fā)酵乳制品，是益生菌的良好載體。KMOS作為一種功能性低聚糖，其在酸奶中的應(yīng)用研究較少。因此，本研究采用CTX誘導(dǎo)BALB/C小鼠免疫抑制模型評(píng)價(jià)了添加KMOS對(duì)于酸奶的免疫調(diào)節(jié)及其對(duì)腸道菌群的影響。酸奶中添加KMOS可提高其對(duì)于CTX誘導(dǎo)引起的小鼠免疫抑制的改善作用。此外，灌胃添加KMOS的酸奶可提高免疫抑制小鼠腸道菌群的多樣性，增加小鼠腸道中非優(yōu)勢(shì)菌種的數(shù)量，抑制由于CTX誘導(dǎo)引起的梭菌屬的增殖。

雙歧桿菌作為腸道益生菌的典型代表，具有多種生理活性并有益人體健康[34]。雙歧桿菌現(xiàn)已作為膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑廣泛用于各類食品中。動(dòng)物雙歧桿菌BB-12是其中研究和應(yīng)用最為廣泛的一株益生菌，其發(fā)酵液中的多種活性成分，如多糖、多肽及脂肪酸等，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等功能活性[35]。人體實(shí)驗(yàn)研究表明（30 名18～40 歲健康志愿者），食用含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12（lg（10.0±0.5）CFU/d））酸奶4 周后，動(dòng)物雙歧桿菌BB-12可與外周骨髓細(xì)胞的Toll樣受體（Tolllike receptor，TLR）-2結(jié)合，增加外周血液中CD14+HLA-DR+單核細(xì)胞的含量，抑制促炎因子TNF-α的釋放[36]。一項(xiàng)隨機(jī)雙盲實(shí)驗(yàn)表明，呼吸系統(tǒng)感染的普通健康人經(jīng)10 d抗生素治療后食用含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的酸奶可激活免疫細(xì)胞并控制炎癥反應(yīng)。含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的酸奶干預(yù)（11 d）后第3天，受試者血液中GATA3、CD80、CXCL10及TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，但TLR2、TLR4及TLR9的表達(dá)并未發(fā)生顯著變化[37]。CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠經(jīng)灌胃含0.5% KMOS及動(dòng)物雙歧桿菌BB12酸奶（LKM組）后，小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率及脾臟臟體比與MC組相比得到顯著提高（圖1），小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性（圖2）、脾淋巴細(xì)胞增殖率（圖3）以及血清中免疫球蛋白質(zhì)量濃度顯著上升（圖4），腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放水平顯著提高（表1）。因此，含動(dòng)物雙歧桿菌BB12酸奶可以改善CTX誘導(dǎo)免疫抑制小鼠固有免疫、獲得性免疫以及體液免疫等機(jī)體多層次免疫體系的活力。

益生元作為一類功能性食品配料，通過(guò)選擇性調(diào)節(jié)人體腸道中菌群的增殖及活性等發(fā)揮有益人體健康的作用[9]。益生元已在食品中廣泛應(yīng)用，尤其是功能性低聚糖類益生元，如低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖及KMOS等[38]。在28 d的低溫貯藏期內(nèi)，低聚果糖可以顯著提高酸奶中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的存活率[39]。添加交聯(lián)型菊粉（平均聚合度為7和15）的凝固型酸奶中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的存活率比添加天然菊粉（平均聚合度為4和11）的酸奶更高[40]。相似地，與未添加KMOS的酸奶相比，添加KMOS顯著促進(jìn)了酸奶中嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌及動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的增殖（數(shù)據(jù)未顯示）。此外，在21 d的貯藏期內(nèi)，添加KMOS的酸奶中益生菌的存活率顯著高于對(duì)照組（未添加KMOS）（數(shù)據(jù)未顯示）。通過(guò)研究灌胃CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠發(fā)現(xiàn)，添加0.5% KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB12酸奶組（LKM組）小鼠基本生理狀態(tài)（圖1）、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率（圖2）、脾淋巴細(xì)胞增殖率（圖3）、血清中免疫球蛋白質(zhì)量濃度（圖4）以及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放水平（表1）均優(yōu)于僅只含動(dòng)物雙歧桿菌BB12酸奶組（RY組）。

KMOS本身具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性，可以刺激固有免疫應(yīng)答，進(jìn)而誘發(fā)可控炎癥反應(yīng)[16]。KMOS的良好益生活性可促進(jìn)腸道中有益菌增殖和代謝，腸道中有益菌可與病原菌競(jìng)爭(zhēng)附著位點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等并陰礙其定植，其代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）可降低腸道環(huán)境的pH值，抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)[41]。腸道免疫細(xì)胞可辨別腸道益生菌和病原菌，誘導(dǎo)并激活固有免疫反應(yīng)，產(chǎn)生炎癥因子等并激活獲得性免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)[42]。SCFAs可被腸道免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)受體識(shí)別，刺激杯狀細(xì)胞并激活炎性小體，增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能。隨后，SCFAs通過(guò)組蛋白乙?；种坪宿D(zhuǎn)錄因子-κB活化，降低腸道黏膜中促炎因子的表達(dá)并調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)，維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)[43]。通過(guò)研究灌胃CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠發(fā)現(xiàn)，添加0.5% KMOS的含動(dòng)物雙歧桿菌BB12酸奶組（LKM組）小鼠基本生理狀態(tài)（圖1）、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率（圖2）、脾淋巴細(xì)胞增殖率（圖3）、血清中免疫球蛋白質(zhì)量濃度（圖4）以及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放水平（表1）均優(yōu)于單純只含KMOS酸奶組（NBB組）。結(jié)果表明，KMOS可通過(guò)促進(jìn)酸奶中的益生菌如動(dòng)物雙歧桿菌BB-12增殖及代謝，從而提高酸奶的免疫調(diào)節(jié)活性。

腸道免疫失衡是造成肥胖、糖尿病等慢性免疫相關(guān)疾病的重要原因之一[41]。研究認(rèn)為酸奶中的益生菌可以通過(guò)腸道固有免疫的識(shí)別顯著提高機(jī)體免疫力[6]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[44]，健康人群中酸奶攝入量與腸道菌群組成之間存在關(guān)聯(lián)，但這種關(guān)聯(lián)受參與者性別、年齡、生活方式、文化背景等因素影響。此外，基于小鼠模型的實(shí)驗(yàn)表明，長(zhǎng)期攝入傳統(tǒng)酸奶可以有效維持腸道微生物組成的穩(wěn)態(tài)，并且通過(guò)調(diào)節(jié)菌群代謝產(chǎn)物維持宿主體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，其中主要表現(xiàn)為腸道通透性下降和基礎(chǔ)免疫應(yīng)答增強(qiáng)[45]。Lollo等[46]通過(guò)大鼠動(dòng)物模型結(jié)合離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含有益生菌的酸奶可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群組成，改善血液中免疫細(xì)胞組成（中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）以及細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平。通過(guò)灌胃添加KMOS的酸奶發(fā)現(xiàn)，KMOS的添加可顯著提高小鼠腸道菌群多樣性和改變腸道菌群結(jié)構(gòu)（圖5），并且其對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響主要是通過(guò)對(duì)非優(yōu)勢(shì)菌群豐度的改變，不僅可以增加腸道中對(duì)健康有益的菌屬豐度，也可抑制CTX誘導(dǎo)引起的梭菌屬豐度增加（圖6）。因此，添加KMOS酸奶可能通過(guò)腸道菌群調(diào)節(jié)作用緩解CTX誘導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究采用CTX誘導(dǎo)免疫抑制BALB/C小鼠模型評(píng)價(jià)了KMOS添加對(duì)酸奶的免疫調(diào)節(jié)活性的影響。與單純添加KMOS的酸奶或只含有動(dòng)物雙歧桿菌BB-12的酸奶相比，添加0.5% KMOS并含動(dòng)物雙歧桿菌BB-12酸奶可進(jìn)一步改善CTX誘導(dǎo)引起的小鼠免疫抑制，提高免疫抑制小鼠腸道中非優(yōu)勢(shì)菌群豐度，抑制梭菌屬豐度增加并促進(jìn)益生菌增殖，從而提高小鼠腸道菌群的多樣性。綜上，KMOS能強(qiáng)化酸奶的免疫調(diào)節(jié)活性，在功能性發(fā)酵乳制品中具有良好的應(yīng)用前景。