何萍萍，鄭雅君，鄭明靜,2,3,4，姜澤東,2,3,4,*，杜希萍,2,3,4，朱艷冰,2,3,4，倪 輝,2,3,4，李清彪,2,3,4,*

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；3.廈門南方海洋研究中心，經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；4.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

紅毛藻（Bangia fusco-purpurea）又稱為紅毛菜，是我國東南沿海特色的食用海藻資源。紅毛藻在福建、廣東沿海分布較廣，“莆田紅毛菜”是國家地理標(biāo)志的名優(yōu)海藻。紅毛藻富含蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、游離脂肪酸和維生素，有較高的營養(yǎng)價(jià)值，在我國及東南亞地區(qū)具有悠久的食用歷史[1-3]。多糖是紅毛藻中主要的膳食營養(yǎng)活性成分之一。研究報(bào)道紅毛藻多糖（Bangia fusco-purpureapolysaccharide，BFP）主要由半乳糖（66.55%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）和硫酸基團(tuán)（10.34%）以及少量的糖醛酸（7.27%）、甘露糖（6.04%）和葡萄糖（5.92%）等組成，其平均分子質(zhì)量約133.18 kDa[1]。BFP具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶[4]、免疫誘導(dǎo)[5]、抑菌[5]、抑制α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶[1]等多種有益的生物活性，在食品、生物醫(yī)藥以及化妝品領(lǐng)域具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。此外，研究證明，BFP對(duì)·OH、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基以及脂質(zhì)過氧化體有清除作用，具有體外抗氧化活性[6]。本課題組近期研究表明，BFP表現(xiàn)出優(yōu)良的抵抗人皮膚成纖維細(xì)胞光氧化損傷的能力[7]。隨著人們對(duì)食品安全和飲食健康的日益關(guān)注，天然抗氧化劑的研究和開發(fā)日益受到重視。目前，關(guān)于BFP的抗氧化損傷相關(guān)機(jī)理還鮮見報(bào)道。因此，BFP作為高效安全的天然抗氧化劑具有廣闊的研究和開發(fā)應(yīng)用前景。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)大量產(chǎn)生和積累活性氧（reactive oxygen species，ROS）[8]。ROS的過量產(chǎn)生和累積會(huì)破壞胞內(nèi)生物分子，如脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷等，從而引起機(jī)體產(chǎn)生炎癥、癌癥、神經(jīng)變性等病理變化[9-11]。腸上皮在吸收營養(yǎng)方面極為重要，也是機(jī)體與外部環(huán)境之間的物理屏障[12]。人類炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的發(fā)病機(jī)理與ROS引起的腸上皮細(xì)胞氧化損傷密切相關(guān)[11]。潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是IBD的一種主要形式，在許多國家發(fā)病率和患病率都很高。UC患者通常會(huì)出現(xiàn)嘔吐、厭食、緊急腹瀉和直腸出血等癥狀[13]。目前，盡管尚未完全了解UC的發(fā)病機(jī)制，越來越多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究證據(jù)表明氧化應(yīng)激在結(jié)腸炎的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[14-15]。在結(jié)腸炎發(fā)展過程中，彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤和小腸黏膜隱窩膿腫會(huì)誘導(dǎo)ROS的大量產(chǎn)生，從而引起氧化應(yīng)激損傷結(jié)腸細(xì)胞和影響腸上皮屏障的通透性，導(dǎo)致病原體侵襲、炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥的過度損壞[16]。另外，過量生成的ROS會(huì)降低內(nèi)源性抗氧化酶的活性，包括過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），并消耗受損細(xì)胞中的非酶類抗氧化物谷胱甘肽（glutathione，GSH）[17]。許多研究者提出可以通過抗氧化劑和ROS靶向治療來預(yù)防或減輕結(jié)腸炎癥[15,18-19]。因此，篩選和研究能夠有效調(diào)控氧化應(yīng)激引起結(jié)腸細(xì)胞損傷的抗氧化劑，是預(yù)防和輔助治療結(jié)腸炎、改善患者生活質(zhì)量的有效策略之一。

綜上，可推測(cè)BFP可能對(duì)腸上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷同樣具有保護(hù)作用，其或許有助于預(yù)防和緩解由氧化應(yīng)激損傷引起的腸道疾病。人結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞是用于研究腸道屏障損傷發(fā)生與修復(fù)機(jī)制的經(jīng)典體外細(xì)胞模型，當(dāng)細(xì)胞長滿時(shí)表現(xiàn)出特征性的腸上皮細(xì)胞分化現(xiàn)象，并具有與腸上皮細(xì)胞相似的代謝酶系和分泌功能[20]。H2O2是體內(nèi)氧化代謝的中間產(chǎn)物，會(huì)引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[21]。因此，本研究采用H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型，探討B(tài)FP對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用以及由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制作用，旨在闡明紅毛藻的食藥用功效機(jī)理，為紅毛藻作為精準(zhǔn)營養(yǎng)食品的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2） 美國模式培養(yǎng)物集存庫；高糖Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；胎牛血清 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、H2O2美國西格瑪奧德里奇有限公司；RIPA裂解液 北京索萊寶科技有限公司；SOD、CAT、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdelyde，MDA）檢測(cè)試劑盒 南京建成科技有限公司；Hoechst 33258熒光染色試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、Caspase 3和Caspase 9活力檢測(cè)試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HERAcell VIOS 160i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾科技公司；Avanti J26XP高速冷凍離心機(jī) 德國貝克曼公司；Cytation? 5細(xì)胞成像多模式檢測(cè)儀 美國伯騰儀器有限公司；TS100倒置生物顯微鏡、50i熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 BFP的提取和純化

BFP的提取和純化參考文獻(xiàn)[1]并稍作修改。紅毛藻粗多糖經(jīng)Sevag法[22]脫除蛋白質(zhì)后，利用丙烯葡聚糖凝交S-400 HR柱層析（1.6 cm×100 cm）純化[23]，采用0.1 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫，利用自動(dòng)樣品收集器按4 mL/管進(jìn)行收集，并用苯酚-硫酸法于490 nm波長處測(cè)定吸光度以進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，490 nm波長處吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制洗脫曲線。收集洗脫峰處多糖溶液，經(jīng)3 500 Da透析膜透析后得到BFP溶液，冷凍干燥得到BFP。

1.3.2 BFP的Caco-2細(xì)胞毒性分析

采用MTT法[24]測(cè)定BFP干預(yù)后Caco-2細(xì)胞活力。細(xì)胞于高糖DMEM生長培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 IU/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素）中進(jìn)行常規(guī)及傳代培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的濃度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。細(xì)胞長滿單層后，用不同質(zhì)量濃度的BFP生長培養(yǎng)基（0、31.25、62.50、125、250、500、1 000 μg/mL）處理細(xì)胞。經(jīng)過24 h孵育，除去上清液，每孔加入50 μL的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% MTT的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育30 min。移去上清液后，每孔用pH 7.4 0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗2 次，加入100 μL的二甲基亞砜，振蕩20 min，甲瓚完全溶解后，于CytationTM5細(xì)胞成像多模式檢測(cè)儀測(cè)定570 nm波長處光密度值（OD570nm），并根據(jù)公式（1）計(jì)算細(xì)胞活力。以細(xì)胞活力大于等于90%為標(biāo)準(zhǔn)，確定BFP的安全劑量。

式中：ODT、ODC和ODB分別是實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組在570 nm波長處的光密度值。對(duì)照組用不含BFP的DMEM生長培養(yǎng)基處理，實(shí)驗(yàn)組用含有不同質(zhì)量濃度BFP的DMEM生長培養(yǎng)基處理，空白組為DMEM生長培養(yǎng)基。

1.3.3 H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型建立

采用An Jun等[25]報(bào)道的方法建立H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型。實(shí)驗(yàn)分組包括對(duì)照組和H2O2氧化損傷模型組。將處于對(duì)數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞以3×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。細(xì)胞長滿單層后，移除生長培養(yǎng)基。對(duì)照組細(xì)胞中加入100 μL DMEM生長培養(yǎng)基；H2O2氧化損傷模型組細(xì)胞中每孔加入100 μL不同濃度H2O2的DMEM生長培養(yǎng)基（H2O2終濃度分別為100、200、400、800、1 200、1 600、2 000 μmol/L）。處理后的細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，采用1.3.2節(jié)方法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.4 H2O2誘導(dǎo)氧化損傷Caco-2細(xì)胞經(jīng)BFP干預(yù)后細(xì)胞活力的測(cè)定

參照Liang Rong等[26]報(bào)道的方法分析BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分組包括空白組、對(duì)照組、H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組和BFP干預(yù)保護(hù)組。空白組每孔加入100 μL DMEM生長培養(yǎng)基，其余組別每孔加入100 μL處于對(duì)數(shù)生長期Caco-2細(xì)胞懸液（3×104個(gè)/孔），于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。細(xì)胞長滿單層后，移除生長培養(yǎng)基?？瞻捉M、對(duì)照組和H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組每孔加入100 μL DMEM生長培養(yǎng)基，BFP干預(yù)保護(hù)組加入100 μL含BFP（終質(zhì)量濃度分別為100、200、500 μg/mL）的DMEM生長培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。孵育結(jié)束后，H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組和BFP干預(yù)保護(hù)組每孔加入含H2O2（終濃度為800 μmol/L）的DMEM生長培養(yǎng)基，空白組和對(duì)照組加入等體積的DMEM生長培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h，采用1.3.2節(jié)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.5 H2O2誘導(dǎo)氧化損傷Caco-2細(xì)胞經(jīng)BFP干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)的觀察

采用1.3.2節(jié)中的方法將處于對(duì)數(shù)生長期Caco-2細(xì)胞接種到96 孔板，按1.3.3節(jié)方法處理細(xì)胞后，使用50i熒光顯微鏡（放大倍數(shù)400）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并分別拍攝空白組、對(duì)照組、H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組和BFP干預(yù)保護(hù)組中的Caco-2細(xì)胞的形態(tài)，比較各組之間細(xì)胞形態(tài)的差異[27]。

1.3.6 H2O2誘導(dǎo)氧化損傷Caco-2細(xì)胞經(jīng)BFP干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定

利用二氯熒光乙酰乙酸鹽熒光探針測(cè)定Caco-2細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS含量[28]。將Caco-2細(xì)胞接種到96 孔黑色聚苯乙烯微孔板，按1.3.3節(jié)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的方法處理細(xì)胞后，按照ROS檢測(cè)試劑盒說明書操作步驟測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度，根據(jù)公式（2）計(jì)算ROS相對(duì)含量。

1.3.7 H2O2誘導(dǎo)氧化損傷Caco-2細(xì)胞經(jīng)BFP干預(yù)后細(xì)胞中SOD活力、CAT活力、GSH含量和MDA含量的測(cè)定

采用1.3.2節(jié)方法，將Caco-2細(xì)胞接種到6 孔板，按1.3.3節(jié)的方法誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷后，收集并裂解細(xì)胞，離心取上清液。按照相應(yīng)的試劑盒說明書操作步驟測(cè)定細(xì)胞SOD、CAT活力和GSH、MDA含量。

1.3.8 H2O2誘導(dǎo)氧化損傷Caco-2細(xì)胞經(jīng)BFP干預(yù)后細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活力測(cè)定

采用Hoechst 33258染色法檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞凋亡[29]。Caco-2細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長滿單層后，按1.3.3節(jié)方法處理各組細(xì)胞。按照相應(yīng)的試劑盒說明書采集圖像并測(cè)定酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

為了確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度，進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS 17.0軟件，使用單因素方差中的Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05、P＜0.01分別表示差異顯著、極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BFP對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響

采用MTT法分析BFP對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖1所示。在BFP質(zhì)量濃度為0～1 000 μg/mL范圍內(nèi)，細(xì)胞活力均大于90%，與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BFP在測(cè)試質(zhì)量濃度（0～1 000 μg/mL）范圍內(nèi)對(duì)Caco-2細(xì)胞沒有顯著毒性作用，所以本研究選取100、200、500 μg/mL作為BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的干預(yù)劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 BFP對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of BFP at different concentrations on the viability of Caco-2 cells

2.2 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的影響

H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型建立的結(jié)果如圖2所示。在不同濃度的H2O2處理Caco-2細(xì)胞4 h后，與對(duì)照組相比，100 μmol/L的H2O2對(duì)Caco-2細(xì)胞活力無顯著影響，隨著培養(yǎng)基中H2O2濃度的升高，Caco-2細(xì)胞活力顯著下降，表明在測(cè)試條件下，培養(yǎng)基中H2O2濃度在200～2 000 μmol/L范圍內(nèi)可有效誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷，并且存在濃度依賴性。當(dāng)培養(yǎng)基中H2O2濃度為800 μmol/L時(shí)，Caco-2細(xì)胞活力抑制率接近50%。因此，后續(xù)選取培養(yǎng)基中H2O2濃度為800 μmol/L作用細(xì)胞4 h為建立Caco-2細(xì)胞氧化損傷的誘導(dǎo)條件。

圖2 不同濃度的H2O2對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of H2O2 at different concentrations on the viability of Caco-2 cells

BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組中Caco-2細(xì)胞活力顯著降低，為（51.3±4.1）%；經(jīng)不同質(zhì)量濃度的BFP（100、200、500 μg/mL）處理的BFP干預(yù)保護(hù)組中Caco-2細(xì)胞活力隨著多糖質(zhì)量濃度增加顯著升高，分別達(dá)到（77.4±2.2）%、（83.3±2.8）%和（90.9±2.1）%，與H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組相比，分別提高了50.9%、62.4%和77.2%。以上結(jié)果表明，BFP預(yù)處理能有效緩解H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，并且在測(cè)定的質(zhì)量濃度（0～500 μg/mL）范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系，提示BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。

圖3 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of BFP at different concentrations on H2O2-induced oxidative damage in Caco-2 cells

2.3 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞形態(tài)的影響

H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，對(duì)照組中Caco-2細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞密度大，細(xì)胞間銜接緊密，生長狀態(tài)良好（圖4A）；H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組中Caco-2細(xì)胞數(shù)量明顯減少，貼壁性變差，出現(xiàn)明顯皺縮或膨大，生長狀態(tài)較差（圖4B）；與H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組中的細(xì)胞相比，經(jīng)BFP預(yù)處理后的細(xì)胞，其形態(tài)隨著多糖質(zhì)量濃度的增加得到顯著改善，細(xì)胞密度顯著增大，細(xì)胞間銜接增加，生長狀態(tài)趨于正常（圖4C～E）。以上結(jié)果表明，BFP能有效改善H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的Caco-2細(xì)胞形態(tài)。

圖4 H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×400）Fig.4 Morphological observation of H2O2-induced oxidative damage in Caco-2 cells (× 400)

2.4 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

ROS引起的腸上皮細(xì)胞氧化損傷與IBD的發(fā)病機(jī)理息息相關(guān)[11]。2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯自身無熒光，可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而被胞內(nèi)的酯酶水解，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)熒光的2’,7’-二氯熒光素（無法穿過細(xì)胞膜）。因此，通過檢測(cè)二氯熒光素的熒光強(qiáng)度可反映出細(xì)胞內(nèi)ROS的水平[30-31]。Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量測(cè)定結(jié)果如圖5所示。H2O2處理能顯著誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高（P＜0.05），而經(jīng)不同質(zhì)量濃度BFP（100、200、500 μg/mL）干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)ROS生成水平被顯著抑制，并隨多糖質(zhì)量濃度升高呈下降趨勢(shì)。當(dāng)BFP質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平達(dá)到最低。以上結(jié)果表明，BFP能有效降低H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平。ROS是細(xì)胞氧化損傷的一種重要的標(biāo)志因子，BFP干預(yù)能夠顯著降低H2O2誘導(dǎo)氧化損傷Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而緩解氧化損傷，保護(hù)細(xì)胞[32]。

圖5 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞內(nèi)相對(duì)ROS水平的影響Fig.5 Effect of BFP at different concentrations on ROS levels in Caco-2 cells induced by H2O2

2.5 BFP對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)SOD活力、CAT活力、GSH含量和MDA含量的影響

BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞內(nèi)SOD活力、CAT活力、GSH水平和MDA含量的影響如表1所示。與對(duì)照組相比，H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組中Caco-2細(xì)胞內(nèi)SOD活力、CAT活力和GSH含量顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組相比，BFP干預(yù)保護(hù)組中Caco-2細(xì)胞內(nèi)的SOD活力、CAT活力和GSH含量總體顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA含量極顯著降低（P＜0.01），并呈現(xiàn)出較好的多糖質(zhì)量濃度依賴性。研究報(bào)道，SOD和CAT是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的重要組成部分，能有效清除ROS，陰止脂質(zhì)過氧化，提升機(jī)體的抗氧化能力[33-35]。GSH是一種重要的非酶類抗氧化物，具有清除自由基、解毒等多種生理功能。GSH水平是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素[36]。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量是反映脂質(zhì)過氧化物和ROS水平的重要指標(biāo)[37]。ROS的過量產(chǎn)生和積累致使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，最終引起細(xì)胞的氧化損傷或凋亡，所以MDA的含量也可間接反映出細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度[32,37]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BFP能顯著提高H2O2誘導(dǎo)氧化損傷Caco-2細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活力以及GSH水平，有效清除氧化損傷細(xì)胞內(nèi)的ROS，陰止脂質(zhì)的過氧化，顯著降低MDA含量，從而保護(hù)Caco-2細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷。這和上述BFP能通過顯著降低H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞內(nèi)ROS水平來緩解細(xì)胞氧化損傷的結(jié)果相一致。

表1 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷Caco-2細(xì)胞內(nèi)SOD活力、CAT活力、GSH含量和MDA含量的影響（n＝6）Table 1 Effect of BFP at different concentrations on SOD activity, CAT activity, GSH level and MDA content in Caco-2 cells induced by H2O2 (n = 6)

2.6 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加和/或抗氧化劑含量的減少、氧化還原穩(wěn)態(tài)破壞以及脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的不可逆氧化修飾等氧化應(yīng)激均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡信號(hào)產(chǎn)生[38]。凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是機(jī)體正常細(xì)胞更新、免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育、激素依賴性細(xì)胞萎縮、胚胎發(fā)育和化學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡等過程的重要組成部分，但不適當(dāng)?shù)募?xì)胞凋亡（太少或太多）是誘發(fā)多種疾病（如神經(jīng)退行性疾病、缺血性損傷、自身免疫性疾病和多種類型的癌癥等）的重要因素之一[39]。BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡調(diào)控作用的結(jié)果如圖6所示。對(duì)照組中，正常生長的Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)出彌散均勻的低強(qiáng)度藍(lán)色熒光，表明Caco-2細(xì)胞沒有發(fā)生顯著的凋亡現(xiàn)象（圖6A）；H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組中，Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮致密高度染色的高強(qiáng)度藍(lán)色熒光，表明Caco-2細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡現(xiàn)象（圖6B）；H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度的BFP干預(yù)保護(hù)后，細(xì)胞核染色的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出顯著的多糖質(zhì)量濃度依賴性變化，熒光強(qiáng)度隨著多糖質(zhì)量濃度升高逐漸降低（圖6C～E），高質(zhì)量濃度多糖干預(yù)的氧化損傷細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度明顯減弱，細(xì)胞核呈現(xiàn)出彌散均勻的低強(qiáng)度藍(lán)色熒光狀態(tài)（圖6E）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BFP能夠有效抑制H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，緩解細(xì)胞的氧化損傷。

圖6 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of BFP at different concentrations on apoptosis in Caco-2 cells induced by H2O2

2.7 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活力的影響

Caspases是富含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶，Caspase家族信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡的發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用[40-41]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶，其活化與細(xì)胞DNA斷裂和細(xì)胞凋亡的形成聯(lián)系極為密切[42]。Caspase-9是線粒體凋亡途徑的上游分子，Caspase-9的激活與ROS有密切關(guān)系[43]。因此，本實(shí)驗(yàn)分析了BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活力的影響。如圖7所示，與對(duì)照組相比，H2O2誘導(dǎo)氧化損傷組中的Caco-2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活力顯著升高；經(jīng)不同質(zhì)量濃度的BFP干預(yù)保護(hù)后，H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活力隨多糖質(zhì)量濃度增加顯著下降，表明BFP能夠有效抑制H2O2氧化損傷引起的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)Caco-2細(xì)胞。這和上述BFP能夠有效緩解H2O2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡的結(jié)果相符合。

圖7 BFP對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞Caspase-3（A）、Caspase-9（B）活力的影響Fig.7 Effect of BFP at different concentrations on the activities of caspase-3 (A) and caspase-9 (B) in Caco-2 cells induced by H2O2

3 討 論

氧化應(yīng)激是常見的應(yīng)激損傷，內(nèi)源性和/或外源性不良刺激會(huì)打破氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)相對(duì)平衡的狀態(tài)，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[44]。氧化應(yīng)激主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡等[9]。胃腸道是體內(nèi)ROS與膳食抗氧化劑相互作用的重要部位，ROS的過量產(chǎn)生會(huì)引起腸上皮細(xì)胞的損傷[45-46]。因此，人體的抗氧化系統(tǒng)需要外源抗氧化劑來有效地避免氧化應(yīng)激的發(fā)生。近年來，多糖作為天然抗氧化劑的研究與開發(fā)利用已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。王群[47]建立了Caco-2細(xì)胞模擬腸道屏障模型，證明了螺旋藻多糖能預(yù)防H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞的氧化損傷；王明星等[48]發(fā)現(xiàn)猴頭菌多糖能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞中MDA的含量，提高SOD活力及乳酸脫氫酶含量，提示猴頭菌多糖的抗UC活性與其減少細(xì)胞的氧化應(yīng)激相關(guān)；何傳波等[49]發(fā)現(xiàn)仙草多糖可增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧化物生成，有明顯的氧化損傷保護(hù)作用。這些研究表明，天然膳食多糖可作為潛在的機(jī)體外源抗氧化劑有效抵抗氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。

本實(shí)驗(yàn)利用H2O2建立Caco-2氧化損傷模型，分析了BFP對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BFP在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度（0～1 000 μg/mL）范圍內(nèi)對(duì)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞活力無顯著影響。經(jīng)800 μmol/L H2O2處理Caco-2細(xì)胞模型4 h之后，Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組（未經(jīng)H2O2處理）相比顯著升高，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[21]。與此同時(shí)，氧化損傷組中Caco-2細(xì)胞的抗氧化酶（SOD和CAT）活力和非酶類抗氧化物GSH水平與對(duì)照組相比顯著下降，MDA含量則顯著升高，表明在H2O2誘導(dǎo)下，Caco-2細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量超氧化物自由基，過量的自由基可能會(huì)抑制抗氧化酶活性，導(dǎo)致氧化損傷細(xì)胞內(nèi)的SOD、CAT和GSH水平與對(duì)照組相比顯著下降，自由基的清除能力減弱，進(jìn)一步加重細(xì)胞氧化損傷程度[35]。另一方面，過量的自由基使細(xì)胞內(nèi)的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA等代謝產(chǎn)物，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加[37]。此外，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活力顯著升高，加速了細(xì)胞凋亡。然而，在加入BFP進(jìn)行保護(hù)后，BFP能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷Caco-2細(xì)胞模型內(nèi)ROS的生成，有效清除ROS，顯著提高SOD、CAT活力和GSH的水平，并顯著降低細(xì)胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生量，陰止脂質(zhì)的過氧化。同時(shí)，BFP能夠顯著下調(diào)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的Caco-2細(xì)胞模型內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活力，緩解氧化應(yīng)激損傷引起的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞維持正常形態(tài)，保護(hù)Caco-2細(xì)胞免受氧化損傷。

綜上所述，BFP可有效緩解H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，具有潛在預(yù)防由氧化應(yīng)激引起的腸道炎癥的應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果可豐富紅毛藻的食品營養(yǎng)學(xué)理論基礎(chǔ)，為其開發(fā)預(yù)防腸道炎癥的精準(zhǔn)營養(yǎng)食品提供科學(xué)依據(jù)。