張 羽，汪 芳，翁澤斌，包伊凡，宋海昭,*，沈新春,*

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210000）

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）是機(jī)體代謝產(chǎn)生的一類氧化自由基，自由基過(guò)量或不足都會(huì)影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)主要由內(nèi)源性抗氧化劑（谷胱甘肽（glutathione，GSH）等）和抗氧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和過(guò)氧化物酶等）組成，能夠維持機(jī)體正常的ROS代謝平衡，使ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，保護(hù)機(jī)體不受氧自由基的侵害[1]。當(dāng)機(jī)體處于糖尿病和肥胖癥等代謝紊亂狀況下，無(wú)法清除自身的多余自由基，致使自由基過(guò)量累積，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。

大量研究表明，很多植物來(lái)源的天然化合物如多酚、多糖、肽等具有良好的抗氧化活性[2-4]，其中肽的抗氧化活性日益受到關(guān)注。抗氧化肽是一種具有抗氧化活性，能夠清除自由基，緩解氧化應(yīng)激的生物活性肽。食源性抗氧化肽具有低毒高效的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于食品及保健品行業(yè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。動(dòng)植物（如魚、牛奶、亞麻籽、苦蕎和小麥）來(lái)源的抗氧化肽已用于食品、藥品抗氧化劑的開發(fā)[5-9]。

小麥胚芽是小麥粉加工的副產(chǎn)物，含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)約30%的麥胚蛋白，其中，麥胚清蛋白（wheat germ protease，WGA）的酶解產(chǎn)物由于具有較強(qiáng)的抗氧化性，其在功能食品開發(fā)領(lǐng)域研究較多。殷微微等[10]分析了麥胚蛋白酶解物清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化物的作用，發(fā)現(xiàn)了其在亞油酸體系中具有較強(qiáng)的抗氧化效果，是有效的天然抗氧化劑。張麗萍等[11]采用中性蛋白酶水解麥胚蛋白，發(fā)現(xiàn)水解物的抗氧化活性和蛋白本身的結(jié)構(gòu)、肽鏈長(zhǎng)短及氨基酸殘基有關(guān)。楊銘澤等[12]通過(guò)采用4 種不同蛋白酶對(duì)麥胚蛋白分別進(jìn)行單酶水解、雙酶同步水解和分步水解，比較研究麥胚蛋白的酶解方法與水解物抗氧化功能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶分步水解為最佳工藝。本課題組在之前的研究中通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化WGA制備抗氧化肽條件，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶（底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.4%、加酶量5 900 U/g、酶解pH 7.04、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間4 h）為最佳用酶[13]?；诖耍狙芯恳訵GA中性蛋白酶酶解產(chǎn)物[13]為研究對(duì)象，通過(guò)超濾、凝交過(guò)濾層析、離子交換層析等技術(shù)對(duì)WGA酶解物（wheat germ protease hydrolysate，WGAH）進(jìn)行逐級(jí)分離，根據(jù)各級(jí)分離產(chǎn)物的抗氧化活性篩選具有較高抗氧化活性的目標(biāo)肽段，鑒定其氨基酸序列，并結(jié)合PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)活性預(yù)測(cè)結(jié)果篩選出抗氧化活性最高的肽序列，進(jìn)一步采用高糖誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）及H2O2誘導(dǎo)的HepG2和VSMCs建立細(xì)胞氧化損傷模型，檢測(cè)其生物活性，旨在為麥胚抗氧化肽產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Sephadex G-75、Sephadex G-25、Sephadex C-25中國(guó)GE醫(yī)療集團(tuán)；2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、熒光素（fluorescein，F(xiàn)L）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis[2-methylpropionamidine]dihydrochloride，AAPH）美國(guó)Sigma公司；HepG2細(xì)胞 南京中醫(yī)藥大學(xué)；VSMCs 北京市疾控中心；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM（dulbecco’s modified Eagle’s medium）培養(yǎng)基（低糖/高糖）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-胰蛋白酶（0.05%） 美國(guó)Gbico公司；小麥胚芽肽合成 金斯瑞生物工程有限公司；2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針、噻唑藍(lán)（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT） 美國(guó)Sigma公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Labscale小型切向流超濾系統(tǒng) 美國(guó)密理博公司；H1850R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司；2XZ旋片真空泵 浙江黃巖天龍真空泵廠；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)上海滬析分析儀器廠有限公司；MZE多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Molecular Devices公司；EksigentnanoLC-UltraTM2D納升液相色譜系統(tǒng)、TripleTOF 5600質(zhì)譜系統(tǒng) 美國(guó)AB SCIEX公司；FACSVerse流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；熒光倒置顯微鏡 德國(guó)卡爾-蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 麥胚清蛋白酶解物制備和超濾膜分離

WGAH參考文獻(xiàn)[13]制備。用pH 7.4、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的WGAH，然后用0.45 μm纖維素膜過(guò)濾。選用截留分子質(zhì)量分別為30 kDa和10 kDa的超濾膜，通過(guò)Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾分離，分離溫度為4 ℃，壓力小于0.1 MPa。將超濾得到的各級(jí)組分分別進(jìn)行脫鹽后冷凍干燥。得到3 個(gè)組分：WGAH-I（＞30 kDa）、WGAH-II（10～30 kDa）和WGAH-III（＜10 kDa）。

1.3.2 葡聚糖凝交柱層析

用Sephadex G-75凝交柱（2.6 cm×70 cm）進(jìn)行層析，將1.3.1節(jié)組分配制為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的樣品溶液（去離子水溶解），上樣量為柱體積的5%，流速0.5 mL/min，溫度4 ℃，檢測(cè)220 nm波長(zhǎng)處信號(hào)強(qiáng)度。去離子水洗脫，調(diào)節(jié)恒流泵。洗脫液收集速率為8 min/管。收集合并分離色譜圖中處于同一洗脫峰下的洗脫液并冷凍干燥，待測(cè)其抗氧化活性。

用Sephadex C-25陽(yáng)離子交換柱（1.6 cm×60 cm）進(jìn)行層析，加入含有0～2 mol/L NaCl的pH 4.0、0.02 mol/L醋酸鹽緩沖液，以2 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，洗脫液收集速率為2 min/管，收集合并分離色譜圖中處于同一洗脫峰下的洗脫液并冷凍干燥，待測(cè)其抗氧化活性。

用Sephadex G-25凝交柱（1.6 cm×60 cm）進(jìn)行層析，用去離子水以0.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，洗脫液收集速率為8 min/管，收集合并分離色譜圖中處于同一洗脫峰下的洗脫液并冷凍干燥，待測(cè)其抗氧化活性。

1.3.3 氧化自由基吸收能力測(cè)定

取20 μL質(zhì)量濃度為50 μg/mL的1.3.2節(jié)逐級(jí)層析樣品或合成多肽溶液于96 孔熒光板中，加入80 μL 175 nmol/L的熒光素鈉溶液，37 ℃混勻，孵育15 min后加入100 μL 24 nmol/L AAPH反應(yīng)，在激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為485 nm和538 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度（1 次/2 min）。利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品測(cè)得的熒光強(qiáng)度計(jì)算氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）[14]，結(jié)果以Trolox的當(dāng)量表示（μmol TE/g或μmol TE/μmol）。

1.3.4 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率測(cè)定

ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定參照Floch等[15]的方法。配制ABTS工作液，取96 孔板，每孔加入10 μL樣品溶液，190 μL的ABTS工作液，25 ℃避光反應(yīng)20 min，測(cè)定734 nm波長(zhǎng)處吸光度。按下式計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

式中：A0表示對(duì)照組（樣品溶解液和ABTS）的吸光度；A表示實(shí)驗(yàn)組的吸光度。

1.3.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對(duì)多肽樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)構(gòu)鑒定由上海博苑生物科技有限公司完成。將凍干的多肽樣品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中，分析柱采用ChromXP Eksigent C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm），流速0.4 mL/min，柱溫25 ℃，流動(dòng)相A：2%（體積分?jǐn)?shù)，后同）乙腈、0.1%甲酸；流動(dòng)相B：98%乙腈、0.1%甲酸。梯度洗脫條件：流動(dòng)相B由5%升高至35%（0～30 min）。采用TripleTOF 5600質(zhì)譜系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧III離子源，噴霧電壓為2.5 kV，霧化氣壓為5 psi，氣簾氣壓為30 psi，加熱器溫度為150 ℃，對(duì)Sephadex G-25凝交柱分離得到的抗氧化能力最佳的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。數(shù)據(jù)采用Mascot 2.3軟件處理分析。

1.3.6 化學(xué)多肽合成

化學(xué)多肽委托金斯瑞生物科技公司用化學(xué)法固相合成（合成多肽純度＞95%）。

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)

VSMCs培養(yǎng)：將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期用于實(shí)驗(yàn)。

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型建立

高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型：將VSMCs以1×105個(gè)/mL的濃度接種于96 孔板，于溫度37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后吸除培養(yǎng)液，加入不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)液。16 h后，隨機(jī)分為3 組：正常組，不作任何處理；高糖組，加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%的葡萄糖溶液，使其最終葡萄糖濃度為25 mmol/L；實(shí)驗(yàn)組，加入最終濃度為25 mmol/L的葡萄糖和不同濃度（5、10、20、40 μmol/L）的抗氧化肽，培養(yǎng) 8 h后，使用MTT法[9]測(cè)定細(xì)胞存活率。

H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型：將HepG2細(xì)胞與VSMCs以1×105個(gè)/mL的濃度接種于96 孔板中，培養(yǎng)48 h后，每孔加入作用濃度為25、50、100、150、200 μmol/L的H2O2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，除去培養(yǎng)液，使用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，選取細(xì)胞存活率接近50%的H2O2濃度作為最適濃度，建立H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，在此基礎(chǔ)上加入不同濃度（5、10、20、40 μmol/L）的抗氧化肽，培養(yǎng)12 h后使用MTT法測(cè)細(xì)胞存活率。

1.3.9 活性氧水平的測(cè)定

將兩種細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的濃度接種于6 孔板中，培養(yǎng)48 h后，按上述造模加樣的方法處理細(xì)胞后，吸除培養(yǎng)液，用pH 7.2、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3 次，加入0.8 mL濃度為10 μmol/L的DCFH-DA溶液反應(yīng)30 min，消化清洗細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，每次上樣1×104個(gè)細(xì)胞，用各處理組細(xì)胞與正常組細(xì)胞（未經(jīng)高糖或H2O2誘導(dǎo)）熒光強(qiáng)度的比值表示活性氧水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾法分離麥胚清蛋白酶解物

30 kDa和10 kDa兩種超濾膜將WGAH截留分成3 個(gè)組分：WGAH-I（分子質(zhì)量＞30 kDa）、WGAH-II（分子質(zhì)量為10～30 kDa）和WGAH-III（分子質(zhì)量＜10 kDa）。ORAC法可以檢測(cè)物質(zhì)抑制過(guò)氧化自由基誘發(fā)氧化反應(yīng)的水平，能夠直接反映待測(cè)物質(zhì)陰斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的能力[16]；ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力也常用作抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究應(yīng)用ORAC法與ABTS法測(cè)定這3 個(gè)WGAH組分的體外抗氧化性。如表1所示，WGAH及其組分的分子質(zhì)量和抗氧化活性具有顯著的負(fù)相關(guān)性。WGAH超濾得到的3 個(gè)組分的抗氧化活性隨著分子質(zhì)量的減小而升高，其中WGAH-III組分抗氧化活性最高，其ORAC為1 258.98 μmol TE/g，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率為62.27%，分別為WGAH的1.14 倍和1.15 倍，是酶解前WGA的1.41 倍和2.68 倍（P＜0.05）。結(jié)果表明，WGAH分子質(zhì)量越小，其抗氧化活性越高。有研究認(rèn)為生物活性肽活性與分子質(zhì)量的大小有關(guān)，例如Zhang Jixian[17]、Hu Fei[18]等在分別提取小麥胚芽肽和山核桃蛋白肽時(shí)均發(fā)現(xiàn)低分子質(zhì)量肽具有較高的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，并選擇WGAH-III（＜10 kDa）組分進(jìn)行下一步層析分離。

表1 不同組分的ORAC與ABTS陽(yáng)離子清除率Table 1 ORAC values and ABTS cation radical-scavenging activity of different separation fractions

2.2 WGAH-III組分的層析分離

葡聚糖凝交柱根據(jù)分子質(zhì)量大小分離目標(biāo)化合物，已被廣泛應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)水解物中的肽段[19-20]。本研究采用交聯(lián)葡聚糖Sephadex G-75凝交柱分離WGAH-III組分，如圖1A1所示，可以看出WGAH-III組分經(jīng)過(guò)Sephadex G-75分離后，得到5 個(gè)洗脫峰，分別為峰A、B、C、D、E。收集凍干后，分別測(cè)定5 個(gè)峰的ORAC，結(jié)果如圖1A2所示，C、D組分的ORAC最高且無(wú)顯著性差異。此外，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率結(jié)果顯示D組分的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率為81.04%，明顯高于C組分（71.85%）（數(shù)據(jù)未列出），因此本研究選擇D組分進(jìn)行Sephadex C-25陽(yáng)離子交換柱分離。

圖1 層析色譜圖以及不同組分的抗氧化活性Fig.1 Chromatogram and antioxidant activity of different separation fractions

離子交換色譜主要用于分離離子或可解離的化合物，因?yàn)樗梢愿鶕?jù)其對(duì)離子交換樹脂的親和力來(lái)分離帶電分子[21]。蛋白質(zhì)水解物包含各種堿性或酸性氨基酸殘基的肽，這些肽易于吸附到固體載體（陽(yáng)離子或陰離子交換樹脂）上，相互作用的強(qiáng)度取決于分子和官能團(tuán)上的電荷的數(shù)量和位置[7,21]。如圖1B1所示，WGAH-III-D組分經(jīng)過(guò)Sephadex C-25陽(yáng)離子交換柱分離后，分離得到3 個(gè)峰，其中峰2的強(qiáng)度較高，分別對(duì)分離得到的3 個(gè)峰進(jìn)行分段收集，脫鹽凍干后，進(jìn)行ORAC抗氧化能力的測(cè)定，結(jié)果如圖1B2所示，峰2的ORAC抗氧化能力最高，峰3活性最低。該結(jié)果表明，經(jīng)離子交換色譜分離，峰2具有最強(qiáng)的抗氧化能力。因此選擇峰2組分進(jìn)行Sephadex G-25凝交柱分離。

Sephadex G-25凝交柱分離原理與Sephadex G-75凝交柱相同，根據(jù)分子質(zhì)量不同分離目標(biāo)化合物。Sephadex G-25凝交柱可分離的分子質(zhì)量為1～5 kDa，如圖1C1所示，Sephadex G-25凝交柱對(duì)組分WGAH-III-D-2分離得到5 個(gè)峰，分別收集凍干后測(cè)定ORAC。如圖1C2所示，V組分的ORAC顯著高于其他4 個(gè)組分（P＜0.05），說(shuō)明其抗氧化能力最強(qiáng)，這說(shuō)明分子質(zhì)量最小的V組分具有最高的抗氧化活性。因此，選取組分WGAH-III-D-2-V進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3 凝交柱層析產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定與PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)

采用LC-MS/MS對(duì)WGAH-III-D-2-V組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并通過(guò)Mascot 2.3軟件分析得到與小麥胚芽蛋白質(zhì)組中同源性最高的20 個(gè)短肽。如表2所示，這些肽均由6～10 個(gè)氨基酸組成。大量研究證實(shí)這種由10 個(gè)以下氨基酸組成短肽的抗氧化活性要高于其母蛋白及多肽[22]，因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)水解的過(guò)程中，肽鏈斷裂使具有高抗氧化活性的肽段暴露出來(lái)，有利于清除自由基、螯合過(guò)氧化金屬離子和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[23]。本研究通過(guò)PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這20 種短肽進(jìn)行活性預(yù)測(cè)分析。PeptideRanker是一個(gè)較為系統(tǒng)的肽數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置閾值為0.50，即預(yù)測(cè)值為0.50以上的肽被認(rèn)為具有生物活性，且值越大生物活性越高。根據(jù)PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)活性預(yù)測(cè)結(jié)果，按其活性指數(shù)排序，并選取活性最高的8 種肽序列進(jìn)行人工合成以進(jìn)一步驗(yàn)證其抗氧化活性。

表2 目標(biāo)肽段的鑒定及生物活性的預(yù)測(cè)Table 2 Amino acid sequences of potent peptides identified by LC-MS/MS and biological activity of potent peptides predicted by PeptideRanker

2.4 活性肽的篩選

根據(jù)PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)活性預(yù)測(cè)結(jié)果選取活性最高的8 種肽序列，測(cè)定其ORAC及ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。如表3所示，LNYPPY具有最高的ORAC（3.01 μmol TE/μmol）且清除ABTS陽(yáng)離子自由基活性最強(qiáng)，清除率為95.58%。許多研究表明，肽的生物活性取決于氨基酸序列，氨基酸種類，以及分子質(zhì)量。較小分子質(zhì)量的肽具有較大的生物活性。多肽中氨基酸的特定位置影響其生物活性[24-25]，當(dāng)多肽的末端含有疏水性（Leu、Val和Gly）和芳香族氨基酸（Phe和Tyr）時(shí)，具有較高的抗氧化活性[26]。肽序列中，疏水性氨基酸（Leu、Val和Gly）、親水性氨基酸（Pro）以及芳香族氨基酸（Phe和Tyr）的存在有助于其總體具有較高的抗氧化活性[27]。Fan Jian等[28]發(fā)現(xiàn)肽序列中含有Tyr有助于提高其抗氧化活性，與Tyr中含有酚羥基可以作為氫供體的特殊能力有關(guān)，特別是Tyr存在于肽末端。如表3所示，YDWPGGRN與LNYPPY都具有較高的自由基清除能力，推測(cè)與末端的Tyr有關(guān)，且LNYPPY含有兩個(gè)Tyr。其次，肽序列LNYPPY具有最強(qiáng)的抗氧化能力，與其N端具有較強(qiáng)疏水性和較低帶電性的Leu有關(guān)且其分子質(zhì)量較小。因此，選取LNYPPY進(jìn)行下一步研究，LNYPPY二級(jí)質(zhì)譜圖如圖2所示。

表3 不同肽的ORAC與ABTS陽(yáng)離子自由基清除率Table 3 ORAC and ABTS cation radical scavenging activity of different peptides

圖2 肽段LNYPPY的二級(jí)擬合質(zhì)譜圖Fig.2 TOF-MS/MS spectrum of the peptide (LNYPPY）

2.5 LNYPPY對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用的影響

許多研究表明，高糖環(huán)境會(huì)使平滑肌細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量增加，一方面高糖加劇了細(xì)胞內(nèi)葡萄糖有氧氧化，超出了線粒體呼吸鏈的處理能力而發(fā)生單電子傳遞，使ROS產(chǎn)生量增加；另一方面高糖能夠激活細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶，使其表達(dá)量增加，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生量增多，所以高糖誘導(dǎo)的VSMCs氧化應(yīng)激模型被廣泛用于體外抗氧化活性研究[29-30]。如圖3所示，高糖能誘導(dǎo)VSMCs ROS水平極顯著上升并使細(xì)胞異常增殖（P＜0.01），抗氧化肽LNYPPY的添加并沒(méi)有顯著抑制高糖誘導(dǎo)的VSMCs的異常增殖和ROS產(chǎn)生，說(shuō)明LNYPPY對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs氧化應(yīng)激損傷無(wú)保護(hù)作用。

圖3 LNYPPY對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖及ROS水平的影響Fig.3 Effect of LNYPPY on viability and ROS levels of VSMCs exposed to high glucose

除了高糖誘導(dǎo)的VSMCs氧化應(yīng)激模型，H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型也經(jīng)常用來(lái)檢測(cè)抗氧化肽的生物活性。H2O2是一種常見的氧自由基產(chǎn)生物，在機(jī)體中容易分解產(chǎn)生羥自由基或氧自由基導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)氧化損傷。已有研究表明不同濃度的H2O2會(huì)引起HepG2細(xì)胞不同程度的氧化損傷[31]。因此，本研究選用H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型來(lái)檢測(cè)LNYPPY的生物活性。

建立體外氧化應(yīng)激模型的關(guān)鍵是確定適宜的H2O2氧化損傷誘導(dǎo)濃度，本研究選取不同濃度的H2O2（濃度梯度為25、50、100、150、200 μmol/L）對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)損傷，如圖4A所示，加入H2O2處理12 h后，H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。當(dāng)50 μmol/L H2O2刺激HepG2細(xì)胞時(shí)，可極顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖（P＜0.01），當(dāng)H2O2濃度為150 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率降至50%，因此選擇添加150 μmol/L H2O2的HepG2為細(xì)胞氧化損傷模型。如圖4B所示，在150 μmol/L H2O2誘導(dǎo)處理的HepG2細(xì)胞中添加抗氧化肽LNYPPY共同培養(yǎng)后，隨著抗氧化肽濃度的增加（5、10、20、40 μmol/L），細(xì)胞存活率隨之提高，且抗氧化肽處理組（10、20、40 μmol/L）與模型組相比具有極顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明抗氧化肽LNYPPY能夠有效改善由H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的活力降低。如圖4C所示，當(dāng)H2O2濃度為150 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞ROS水平是正常細(xì)胞的3.26 倍，加入抗氧化肽LNYPPY后，隨著肽濃度的增加（5、10、20、40 μmol/L），ROS水平極顯著下降（P＜0.01），當(dāng)肽濃度為40 μmol/L時(shí)，該條件下ROS水平降至正常細(xì)胞的1.47 倍。說(shuō)明抗氧化肽LNYPPY能夠有效的減少由外源性H2O2引起的HepG2細(xì)胞ROS異常增多的現(xiàn)象，對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，從而維護(hù)細(xì)胞的代謝平衡。

圖4 LNYPPY對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率及ROS水平的影響Fig.4 Effect of LNYPPY on viability and ROS levels of cells exposed to H2O2

本研究還探討了LNYPPY對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs氧化損傷的作用。當(dāng)H2O2濃度為200 μmol/L時(shí)可使VSMCs存活率降低幅度大于30%，因此選擇200 μmol/L H2O2為建立模型的最適劑量，結(jié)果顯示加入不同濃度的LNYPPY能夠顯著改善由H2O2誘導(dǎo)的VSMCs活性降低的現(xiàn)象（圖4D、E）。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明抗氧化肽LNYPPY對(duì)H2O2誘導(dǎo)的VSMCs氧化應(yīng)激損傷具有很好的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激參與許多慢性疾病，如酒精性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生過(guò)程，研究氧化應(yīng)激模型對(duì)于篩選抗氧化藥物以及功能食品的開發(fā)具有重要意義[32]。肝臟及肌肉是體內(nèi)能量代謝的重要場(chǎng)所，也是慢性疾病發(fā)生的主要部位，肝細(xì)胞與肌細(xì)胞也經(jīng)常用作體外生物活性研究。因此本實(shí)驗(yàn)選用了兩種常用細(xì)胞（HepG2細(xì)胞和VSMCs）來(lái)建立氧化應(yīng)激模型研究抗氧化肽LNYPPY的體外抗氧化活性。研究結(jié)果顯示抗氧化肽LNYPPY對(duì)于H2O2誘導(dǎo)的HepG2和VSMCs氧化應(yīng)激損傷具有很好的保護(hù)作用，說(shuō)明抗氧化肽LNYPPY在生物體內(nèi)也具有很好的清除氧化自由基的功能，可作為抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用。

高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是通過(guò)刺激細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS，造成細(xì)胞代謝紊亂，而H2O2對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷的原理主要是通過(guò)外源刺激細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS，從而破壞細(xì)胞代謝平衡，造成細(xì)胞存活率降低。本研究發(fā)現(xiàn)抗氧化肽LNYPPY對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs氧化應(yīng)激無(wú)作用，而對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞和VSMCs氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用，可能與其在細(xì)胞中的作用靶點(diǎn)及其相對(duì)應(yīng)的作用機(jī)制有關(guān)。有研究表明肽ADWGGPLPH能夠通過(guò)作用于PKC/AMPK/NOX4信號(hào)通路，從而改善高糖誘導(dǎo)的VSMCs氧化應(yīng)激損傷[30]，而H2O2是通過(guò)Nrf2/HO-1通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷[33-34]。Yao Yijun等[35]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)薏仁種子不溶性多酚提取物可以通過(guò)Nrf2信號(hào)通路改善H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷；Chen Lei等[36]發(fā)現(xiàn)覆盆子提取物可以通過(guò)Nrf2信號(hào)通路對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)肽LNYPPY在細(xì)胞內(nèi)可能作用于Nrf2/HO-1信號(hào)通路，而對(duì)PKC/AMPK/NOX4信號(hào)通路無(wú)明顯影響。關(guān)于抗氧化肽LNYPPY改善H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本研究利用超濾、Sephadex G-75凝交柱分離層析、Sephadex C-25陽(yáng)離子交換層析和Sephadex G-25凝交柱層析以及PeptideRanker數(shù)據(jù)庫(kù)活性預(yù)測(cè)技術(shù)從WGAH中分離篩選得到了具有較高抗氧化活性的肽LNYPPY，并進(jìn)一步通過(guò)高糖誘導(dǎo)VSMCs以及H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和VSMCs建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，發(fā)現(xiàn)LNYPPY對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs氧化應(yīng)激損傷無(wú)明顯改善作用，但對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞和VSMCs氧化應(yīng)激損傷具有很好的保護(hù)作用，且根據(jù)這一結(jié)果推測(cè)LNYPPY的抗氧化作用可能是通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的介導(dǎo)。本研究可為麥胚蛋白抗氧化肽的理論研究與開發(fā)應(yīng)用提供重要參考。