龔 鳴

腦卒中是威脅中國居民身體健康和生命安全的重大疾病之一，其中約70%腦卒中患者為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusiorc injury，CIRI），死亡率約10%，致殘率高達50%以上[1]。CIRI 指腦缺血一定時間恢復血液供應后，腦功能并未好轉(zhuǎn)，反而出現(xiàn)更嚴重功能障礙的現(xiàn)象[2]。CIRI 是缺血性腦血管病的主要病理過程，可通過炎癥反應、凋亡激活、細胞氧化、線粒體損傷等引起神經(jīng)細胞死亡[3]。巴戟天醇提物（radix Morindae officinalis-ethanolic extract，RMOEE）來源于雙子葉植物茜草科植物巴戟天，已有研究表明，其對心臟、腎臟的缺血再灌注損傷具有一定的保護作用[4-5]。本研究通過構(gòu)建腦缺血再灌注大鼠模型，探究RMOEE 對CIRI 的保護機制。

1 實驗材料

1.1 動物 健康清潔級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量200～240g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2013-0018，動物使用許可證號為SYXK（浙）2018-0012。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心，室溫（25±2）℃，相對濕度60%～70%。

1.2 藥物 中藥巴戟天購自安徽亳州中藥材市場。參考文獻[6]的方法進行提取，巴戟天干燥后反復粉碎，得到的粉狀物過100 目篩，與70%乙醇按體積比1∶10 混合，采用熱回流法將上清液過濾，旋蒸去除乙醇得到浸膏狀物。分別加入蒸餾水和正丁醇萃取3次后，得到醇提物正丁醇萃取部分和醇提物水溶部分，再次旋蒸得到各部分濃縮物，將RMOEE 水溶部分配成濃度為2g/mL 的母液備用。

1.3 試劑和儀器 水合氯醛購自美國Sigma 公司（批號為A5462），大鼠炎癥因子[腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）]檢測試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司（批號分別為201604、201803、201612、201701、201608），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號分別為10110034、0321A23），原位末端轉(zhuǎn)移酶標記（TUNEL）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號為P0173），抗體[絲裂原活化蛋白激酶1/2（MEK1/2）、激活型MEK1/2（p-MEK1/2）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）、激活型ERK1/2（p-ERK1/2）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 關(guān)聯(lián)X 蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）]為兔抗，均購自美國CST 公司（批號分別為4694、2338、4695、9101、3498、14796、9662、9502、2858），Infinite M200 PRO 型多功能酶標儀購自奧地利TECAN 公司，轉(zhuǎn)移脫色搖床購自姜堰市普康醫(yī)療機械廠，PowerPac Basic 電泳儀購自美國BIO-RAD 公司，3300 Mini 化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自中國CLinX 公司。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥 40 只SD 大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組及RMOEE 低、中、高（3、6、12g/kg）劑量組，每組8 只。參考文獻[7]線栓法制備腦缺血再灌注大鼠模型。由尾部將大鼠提起，保持懸空，左前肢屈曲內(nèi)收，活動時呈典型追尾征為造模成功。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同模型組和RMOEE 低、中、高劑量組。另外，RMOEE 低、中、高劑量組按照3、6、12g/kg 的藥物劑量，于每天上午8:30進行灌胃給藥，持續(xù)21 天，假手術(shù)組與模型組給予等體積5g/L 羧甲基纖維素鈉溶液。

2.2 神經(jīng)功能缺失評分 給藥結(jié)束后，采用Zea Longa 評分標準[8]對大鼠神經(jīng)功能進行評分。無神經(jīng)功能缺損癥狀計0 分；癱瘓側(cè)屈曲、內(nèi)收，不能自主伸展計1 分；行走時向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈計2 分；行走時向癱瘓側(cè)傾倒計3 分；嚴重神經(jīng)功能缺損，如行走障礙等計4 分。得分越高表明神經(jīng)功能缺失越嚴重。

2.3 腦含水量檢測 采用腦組織干濕重法檢測各組大鼠腦含水量，將各組大鼠麻醉后斷頭、取腦，去除小腦和低位腦干后稱重大腦組織重量，即為腦濕重；110℃恒溫烘烤48h 后稱重為腦干重，計算腦含水量：腦含水量（%）=（腦濕重－腦干重）/腦濕重×100%。

2.4 腦梗死體積百分比測定 采用TTC 染色法檢測腦梗死體積，取腦后于-20℃放置30min，除去小腦和嗅球，冠狀切片，從大腦的額葉至枕葉連續(xù)切5片。隨后將腦片放入1%的TTC 磷酸緩沖液中，37℃避光孵育5min，待顏色分明后取出（梗死區(qū)呈白色），用10%甲醛固定。采用Image Pro-Plus 測量梗死面積和整個大腦面積，體積=面積×厚度。腦梗死體積百分比=（梗死體積/整個大腦體積）×100%。

2.5 炎癥因子表達情況檢測 各組大鼠斷頭后，取缺血側(cè)腦組織，研磨勻漿，4℃下離心（3500r/min）5min，取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，通過酶標儀測定大鼠缺血側(cè)腦組織中TNF-α、IL-1β、ICAM-1 及VCAM-1 的含量。

2.6 HE 染色及TUNEL 染色 于冰上取腦后部分組織，利用10%多聚甲醛固定，經(jīng)過脫水浸蠟包埋后制備石蠟切片，連續(xù)切片后進行脫蠟水化處理，切片厚度為4μm。然后進行脫蠟、二甲苯浸泡，降梯度乙醇溶液脫水處理，隨后按照HE 染色試劑盒說明書進行操作，采用中性樹膠封片后通過顯微鏡觀察腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元病變；切片后采用4%多聚甲醛，PBS 清洗，Triton X-100通透，按照TUNEL 試劑盒說明書步驟進行染色，檢測凋亡情況，胞漿中呈現(xiàn)有棕黃色底物的細胞視作陽性凋亡細胞，利用Image Pro-Plus 分析軟件統(tǒng)計其中TUNEL 陽性細胞個數(shù)，取其平均值作為該樣本的陽性細胞數(shù)，凋亡細胞百分率（%）=陽性凋亡細胞數(shù)/（陽性凋亡細胞數(shù)+陰性凋亡細胞數(shù)）×100%。

2.7 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達 取大鼠患側(cè)腦皮質(zhì)組織，加入適量液氮，用研缽研磨后加入Lysis Buffer，組織勻漿機中進行勻漿，使組織盡量碾碎，冰上靜置裂解15～30min。將勻漿液放入離心管中離心5min，取上清轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，處理蛋白隨后上樣。用SDSPAGE 分離總蛋白，隨后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育2h 后采用ECL 顯色液顯影，化學發(fā)光成像系統(tǒng)上進行曝光拍照后，采用Image J 軟件進行灰度值分析。

2.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊性者采用兩獨立樣本t 檢驗，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分及腦含水量比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，RMOEE 低、中、高劑量組均有不同程度地降低（P<0.05 或P<0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦含水量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，RMOEE 中、高劑量組腦含水量顯著降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分及腦含水量比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分及腦含水量比較（±s）

注：假手術(shù)組和模型組予5g/L 羧甲基纖維素鈉溶液灌胃；RMOEE 低、中、高劑量組分別按照3、6、12g/kg 的劑量予RMOEE 溶液灌胃；Zea Longa 為神經(jīng)功能缺失評分；RMOEE 為巴戟天醇提物；與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，bbP<0.01

3.2 各組大鼠腦梗死體積百分比比較 假手術(shù)組無明顯白色梗死灶出現(xiàn)，模型組可見明顯的白色梗死灶，各RMOEE 加藥組中白色梗死灶大小均有不同程度的減?。ㄒ妶D1）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死體積百分比顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，RMOEE 中、高劑量組腦梗死體積百分比顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。見表2。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色情況

表2 各組大鼠大腦梗死體積百分比比較（%，±s）

表2 各組大鼠大腦梗死體積百分比比較（%，±s）

注：假手術(shù)組和模型組予5g/L 羧甲基纖維素鈉溶液灌胃；RMOEE 低、中、高劑量組分別按照3、6、12g/kg 的劑量予RMOEE 溶液灌胃；RMOEE 為巴戟天醇提物；與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，bbP<0.01

3.3 各組大鼠腦組織炎癥因子表達比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1 的表達量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，RMOEE 中、高劑量組能夠顯著降低大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1 及VCAM-1表達（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子表達比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子表達比較（±s）

注：假手術(shù)組和模型組予5g/L 羧甲基纖維素鈉溶液灌胃；RMOEE 低、中、高劑量組分別按照3、6、12g/kg 的劑量予RMOEE 溶液灌胃；RMOEE為巴戟天醇提物；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β 為白細胞介素-1β；ICAM-1 為細胞間黏附分子-1；VCAM-1 為血管細胞黏附分子-1；與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

3.4 各組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元病理學形態(tài)變化HE 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)層次清晰，排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)染色均勻，無異?，F(xiàn)象。而模型組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)明顯異常，排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)量減少，間隙增大，胞體腫脹變形，核仁變淺或消失。相比于模型組，RMOEE 各劑量組能夠有效改善海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的病理學改變，且隨著劑量的增大，改善效果逐漸明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元病理學形態(tài)變化（HE 染色×200）

3.5 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織細胞凋亡率顯著增高（P<0.01）；相對于模型組，RMOEE 低、中、高劑量組細胞凋亡率均顯著降低（P<0.05）。見表4，圖3。

表4 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較（%，±s）

表4 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較（%，±s）

注：假手術(shù)組和模型組予5g/L 羧甲基纖維素鈉溶液灌胃；RMOEE 低、中、高劑量組分別按照3、6、12g/kg 的劑量予RMOEE 溶液灌胃；RMOEE 為巴戟天醇提物；與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

圖3 各組大鼠腦組織細胞凋亡情況（TUNEL 染色×400）

3.6 各組大鼠腦組織相關(guān)蛋白表達比較 Western blot 檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠p-MEK1/2、p-ERK1/2、Bax、Caspase-3 以及Caspase-9蛋白表達量顯著增加（P<0.05 或P<0.01），Bcl-2 蛋白含量顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，RMOEE 中、高劑量組p-MEK1/2、p-ERK1/2、Bax、Caspase-3 以及Caspase-9 蛋白含量顯著下降（P<0.05 或P<0.01），Bcl-2 蛋白含量顯著增高（P<0.05 或P<0.01）。見圖4，表5。

圖4 各組大鼠腦組織中相關(guān)蛋白表達情況

表5 各組大鼠腦組織相關(guān)蛋白相對表達量比較（±s）

表5 各組大鼠腦組織相關(guān)蛋白相對表達量比較（±s）

注：假手術(shù)組和模型組予5g/L 羧甲基纖維素鈉溶液灌胃；RMOEE 低、中、高劑量組分別按照3、6、12g/kg 的劑量予RMOEE 溶液灌胃；RMOEE為巴戟天醇提物；MEK1/2 為絲裂原活化蛋白激酶1/2；p-MEK1/2 為激活型絲裂原活化蛋白激酶1/2；ERK1/2 為細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2；p-ERK1/2 為激活型細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2；Bcl-2 為B 淋巴細胞瘤-2；Bax 為Bcl-2 關(guān)聯(lián)X 蛋白；Caspase-3 為半胱氨酸蛋白酶-3；Caspase-9為半胱氨酸蛋白酶-9；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與假手術(shù)組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，bbP<0.01

4 討論

中醫(yī)藥在治療腦缺血再灌注方面有著獨特的作用和優(yōu)勢[9-11]，中藥巴戟天是茜草科巴戟天屬植物巴戟天的干燥根，味甘、辛，微溫，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效[12]，其醇提物已被證實對大鼠CIRI 具有一定的保護作用[13]，然而其具體的作用機制未被闡明。本研究結(jié)果表明，RMOEE 能夠顯著降低腦缺血再灌注大鼠的Zea Longa 評分，明顯減少腦含水量以及腦梗死體積百分比，提示RMOEE 能夠在一定程度上減輕腦缺血再灌注所造成的神經(jīng)功能損傷，改善腦水腫以及腦梗死情況。HE 染色結(jié)果表明，RMOEE 干預能夠改善腦缺血再灌注模型大鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的病理學改變。

炎癥因子的釋放加劇了血腦屏障的通透性，進而加重腦組織水腫，促使炎癥因子透過血腦屏障，加重炎癥反應和細胞凋亡[14]。細胞凋亡是CIRI 引起神經(jīng)細胞死亡的重要原因[15]。因此，炎癥反應和細胞凋亡與CIRI 密切相關(guān)。本研究檢測大鼠腦組織炎癥因子（TNF-α、IL-1β、ICAM-1 及VCAM-1）的表達變化，結(jié)果表明，模型組大鼠炎癥因子表達明顯增高，而RMOEE 干預后能夠有效降低上述炎癥因子的表達，證實RMOEE 能夠顯著抑制模型大鼠腦缺血再灌注所造成的炎癥反應。此外，TUNEL 染色結(jié)果表明RMOEE 能夠有效降低腦缺血再灌注模型大鼠的細胞凋亡率，并通過Western blot 實驗從蛋白層面驗證了RMOEE 干預能夠抑制腦缺血再灌注模型大鼠細胞凋亡。

MAPK/ERK信號通路是由激酶級聯(lián)反應介導的信號傳導通路，能夠通過一系列的級聯(lián)反應，激活靶基因轉(zhuǎn)錄，參與細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程[16]。目前已有研究證實，MAPK/ERK信號通路的異常激活與CIRI 密切相關(guān)[15]。MEK1/2和ERK1/2 是MAPK/ERK信號通路的標志性蛋白。本研究結(jié)果表明，相對于假手術(shù)組，模型組大鼠MEK1/2和ERK1/2 的磷酸化水平顯著增強，表明MAPK/ERK通路在腦缺血再灌注模型大鼠中呈異常激活狀態(tài)，而RMOEE 能夠明顯降低p-MEK1/2和p-ERK1/2 的表達，證明RMOEE能夠有效抑制MAPK/ERK通路活性。

綜上所述，RMOEE 可能通過調(diào)控MAPK/ERK信號通路，降低炎癥因子表達以及抑制凋亡，進而對大鼠CIRI 起到一定的保護作用。