黃 義，顏 彥，黃友軍

食管癌是癌癥相關(guān)死亡的重要原因之一，近年來食管癌發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，嚴重威脅人類健康[1]。種族因素、遺傳因素和生活方式等在食管鱗狀細胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。深入研究食管癌的發(fā)病原因和機制，早期診斷和治療，對于延長食管癌患者生存時間意義重大。微小RNA(miRNA)是非編碼、進化保守的短RNA，通過結(jié)合mRNA的3＇ 非翻譯區(qū)(3＇ UTR)調(diào)控基因mRNA的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)基因表達，不僅可維持細胞正常生物學過程，還在腫瘤和炎癥等疾病病理過程中發(fā)揮重要的作用[2]。miR-30-5p屬于miR-30家族成員，有研究顯示miR-30-5p在結(jié)直腸癌和胃癌等腫瘤中表達升高，促進轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮促癌的生物學作用[3-4]。細胞因子信號傳導抑制因子1(SOCS1)的編碼基因位于人類16號染色體短臂，編碼蛋白可以抑制細胞因子信號傳導因子的生物學功能。有研究表明，SOCS1在人類肝細胞肝癌和卵巢癌等腫瘤中表達下降，誘導STAT3-Mcl1軸過度激活，促進腫瘤惡性進展[5-6]。Lin等[7]學者發(fā)現(xiàn)，SOCS1是miR-30家族的重要下游靶基因，miR-30家族成員能夠抑制IFN/JAK/STAT信號通路的傳導，導致病毒感染過程中的免疫逃逸。miR-30-5p和SOCS1在食管癌中的表達及相互關(guān)系現(xiàn)尚不清楚。本研究通過檢測miR-30-5p和SOCS1在食管癌中的表達，初步探討其臨床意義,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月—2017年1月郴州市第一人民醫(yī)院收治的符合納入及排除標準接受手術(shù)治療的食管癌85例作為研究對象。85例中男52例，女33例；年齡(53.4±6.2)歲；病程(3.5±1.2)個月;腫瘤位置：上胸段18例，中胸段40例，下胸段27例；腫瘤直徑:≤5 cm 39例，>5 cm 46例；病理分級：高分化22例，中分化28例，低分化35例；腫瘤分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期40例，Ⅲ期18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有37例，無48例。本研究符合“赫爾辛基宣言”，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準同意執(zhí)行。自出院之日起對入選患者進行隨訪，以電話方式隨訪，每月1次，隨訪3年，隨訪截至2020年1月，隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結(jié)束。

1.2納入及排除標準 納入標準：①初次就診，無外院診治史；②術(shù)前無放化療等治療史；③經(jīng)病理檢查明確診斷為食管癌；④無食管狹窄和反流性食管炎等食管良性疾??；⑤患者和(或)其家屬對本研究知情同意并簽署相關(guān)知情同意書。排除標準：①合并胃腸炎和腸結(jié)核等急性感染性疾病患者；②伴心肺功能衰竭患者；③伴免疫缺陷性疾病和精神障礙等患者。

1.3qRT-PCR檢測組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達 取食管癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣2 cm以上)，液氮中研磨，Trizol法提取RNA，分光光度計檢測RNA的濃度及純度，OD 260/OD 280介于1.8～2.1。以RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，進行qRT-PCR?？傮w系20 μl，包括SYBR Green 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，雙蒸水6 μl。miR-30-5p上游引物：5＇-AGTTGGACGAAGCAAATCCTC-3＇，下游引物：5＇-AGGTCGTGAGAGTAGCGACA-3＇;內(nèi)參U6上游引物:5＇-TTCGGCAGCACATATACTAAAATTGG-3＇，下游引物:3＇-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5＇；SOCS1 mRNA上游引物:5＇-CATTCAGACGGAGCGTGCTTAC-3＇，下游引物:5＇-TGCATCTTCATCTTCGTCAC-3＇；內(nèi)參GAPDH上游引物:5＇-AGCCGACCGGTTCTGTCAT-3＇，下游引物:3＇-GGTCATAACCTGGTTCATCATCAC-5＇。miR-30-5p反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。SOCS1 mRNA反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 25 s，70 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。miR-30-5p和SOCS1 mRNA的相對表達量以2-ΔΔCt值表示。以miR-30-5p和SOCS1 mRNA相對表達量的平均數(shù)1.850和0.875為界，分別將其分為高表達患者和低表達患者[5]。

1.4免疫印跡法檢測組織中SOCS1蛋白表達 將食管癌組織和癌旁組織剪碎后勻漿器勻漿，離心去沉淀，取上清加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解10 min。取上清BCA定量，加入SDS緩沖液，95 ℃金屬浴10 min。后進行聚丙烯凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V，恒流300 mA轉(zhuǎn)印90 min。5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。SOCS1一抗(1∶1000，購自Abcam公司，貨號：ab9870)4 ℃過夜；二抗(1∶5000)中孵育，室溫1 h。電化學發(fā)光法顯影照相，出現(xiàn)灰色條帶則判定為蛋白陽性表達。

1.5觀察指標 比較食管癌組織和癌旁組織中miR-30-5p及SOCS1 mRNA和蛋白表達，分析食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達與食管癌患者臨床病理特征關(guān)系，探討食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達的相關(guān)性，預(yù)測食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA的結(jié)合位點，分析食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA不同表達與食管癌患者預(yù)后關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1食管癌組織和癌旁組織中miR-30-5p及SOCS1 mRNA和蛋白表達 食管癌組織和癌旁組織中miR-30-5p的相對表達量分別為1.850±0.432和0.612±0.117，SOCS1 mRNA的相對表達量分別為0.875±0.120和2.143±0.635。食管癌組織中miR-30-5p相對表達量高于癌旁組織，而SOCS1 mRNA相對表達量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1a。食管癌組織和癌旁組織中SOCS1蛋白表達陽性率分別為12.9%(11/85)、94.1%(80/85)，SOCS1蛋白表達陽性率食管癌組織低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。SOCS1蛋白免疫印跡條帶見圖1b。

圖1 食管癌組織和癌旁組織中miR-30-5p及SOCS1 mRNA和蛋白表達

2.2食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達與食管癌患者臨床病理特征關(guān)系 食管癌患者不同病理分級、腫瘤分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；而食管癌患者不同性別、年齡、病程、腫瘤位置和腫瘤直徑食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 食管癌組織miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達與食管癌患者臨床病理特征關(guān)系

2.3食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達相關(guān)性及結(jié)合位點預(yù)測 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達呈明顯負相關(guān)(r=-0.547,P<0.001)，見圖2a。Target Scan Human 7.2生物信息軟件預(yù)測食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA結(jié)合位點結(jié)果顯示，SOCS1 mRNA序列3＇ UTR的285～292堿基位置處含有與miR-30-5p互補結(jié)合位點，見圖2b。

圖2 食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達相關(guān)性及結(jié)合位點預(yù)測

2.4食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA不同表達與食管癌患者預(yù)后關(guān)系 食管癌85例中無失訪病例，隨訪3～36(27.1±6.2)個月，隨訪期間死亡53例，3年總體生存率為37.6%(32/85)。3年總體生存率食管癌組織中miR-30-5p高表達患者和低表達患者分別為19.0%(8/42)和55.8%(24/43)，SOCS1 mRNA高表達患者和低表達患者分別為56.1%(23/41)和20.5%(9/44)。Kaplan-meier生存分析結(jié)果顯示，3年總體生存率食管癌組織中miR-30-5p高表達患者低于低表達患者，SOCS1 mRNA高表達患者高于低表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3a和3b。

圖3 食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA不同表達與食管癌患者預(yù)后關(guān)系

3 討論

食管癌是起源于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，我國每年食管癌新發(fā)病例約26萬例，死亡病例約19萬例，嚴重威脅人們身體健康[8]。食管癌早期常無明顯臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時多已處于中晚期，喪失手術(shù)治療最佳時機，導致預(yù)后不良。食管癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，遺傳因素和環(huán)境因素等共同作用促進食管癌的發(fā)生和發(fā)展[9]。探討食管癌發(fā)病原因及機制，對食管癌的預(yù)防和臨床新藥研發(fā)等具有重要臨床意義。

近年來，分子生物學研究不斷發(fā)展，特別是分子靶向藥物及免疫檢查點藥物等的臨床應(yīng)用為腫瘤治療帶來新的希望。細胞內(nèi)的miRNA是調(diào)節(jié)細胞生物學行為的重要分子，長度19～23個核苷酸，成熟的miRNA與Dicer等構(gòu)成RNA誘導的沉默復(fù)合物，結(jié)合并抑制靶基因mRNA的表達，調(diào)控細胞增殖、分化及衰老等生理病理過程[10-11]。有研究表明，腫瘤組織中多種miRNA表達異常，并影響腫瘤細胞的增殖和遷移等生物學行為，與腫瘤惡性進展密切相關(guān)[12]。miR-30-5p位于人類6號染色體，在多種人類腫瘤中異常表達，通過影響下游轉(zhuǎn)錄因子Snail下游信號通路的傳導，發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展的生物學作用[13]。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-30-5p相對表達量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義。miR-30-5p表達升高的具體機制現(xiàn)尚不清楚。Huang等[14]報道，miR-30-5p受到核因子κB(NF-κB)正調(diào)控作用的影響，腫瘤發(fā)生時NF-κB信號通路激活促進miR-30-5p表達升高。本研究結(jié)果還顯示，食管癌患者不同病理分級、腫瘤分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌組織miR-30-5p表達差異有統(tǒng)計學意義。表明食管癌組織miR-30-5p表達水平升高促進食管癌惡性進展。有研究報道，miR-30-5p表達升高能夠直接激活Wnt信號通路的信號傳導，促進腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，導致腫瘤細胞遷移和侵襲能力增強，造成腫瘤易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，病理分級和腫瘤分期增加[15]。

SOCS1屬于細胞因子信號傳導抑制因子家族的成員，其編碼蛋白能夠負性調(diào)控JAK/STAT信號通路[16-17]。SOCS1具有進化保守的Src同源域2結(jié)構(gòu)域，是結(jié)合JAK并發(fā)揮負性調(diào)控功能的主要結(jié)構(gòu)域[18-19]。有研究表明，SOCS1作為一種抑癌基因，在磷酸化激活后能夠以二聚體的形式發(fā)揮生物活性功能，抑制腫瘤的進展[20]。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中SOCS1 mRNA相對表達量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義，分析其機制可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常有關(guān)。Zhang等[21]研究表明，miR-155等非編碼RNA能夠與SOCS1 mRNA 3＇ UTR結(jié)合，并降解SOCS1 mRNA抑制SOCS1蛋白表達。本研究結(jié)果顯示，食管癌患者不同病理分級、腫瘤分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌組織SOCS1 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義。分析其機制可能是SOCS1 mRNA低表達導致與p53相互作用減弱，抑制p53抑癌基因功能，進而促進腫瘤G2/M期轉(zhuǎn)換，加快腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移等行為[22]。本研究Kaplan-meier生存分析結(jié)果顯示，3年總體生存率食管癌組織中miR-30-5p高表達患者低于低表達患者，SOCS1 mRNA高表達患者高于低表達患者，差異有統(tǒng)計學意義。表明食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達水平對食管癌患者預(yù)后具有一定預(yù)測價值。有研究報道，miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達水平能夠影響順鉑類抗癌藥物治療的敏感性，體外細胞實驗證實二者能夠逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥性形成[23-24]。此外，本研究結(jié)果還顯示，食管癌組織中miR-30-5p和SOCS1 mRNA表達呈明顯負相關(guān)，SOCS1 mRNA序列3＇ UTR的285～292堿基位置處含有與miR-30-5p互補結(jié)合位點，提示SOCS1 mRNA可能受到miR-30-5p的靶向調(diào)控。Lin等[7]研究證實，miR-30家族能夠抑制SOCS1的表達，進而促進下游IFN/JAK/STAT信號的傳導。

綜上所述，食管癌組織中miR-30-5p表達升高，而SOCS1 mRNA和蛋白表達降低，其與食管癌患者病理分級、腫瘤分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，共同促進食管癌惡性進展。miR-30-5p和SOCS1有望作為評估食管癌患者預(yù)后的腫瘤標志物，但二者在食管癌中的相互作用機制及臨床應(yīng)用有待深入研究。