崔素芬 魯玉杰 劉志誠 邱江平

(江蘇科技大學糧食學院1，鎮(zhèn)江 212100)(上海交通大學農業(yè)與生物學院2，上海 200240)

氧氣是好氧生物利用有氧呼吸產生ATP的必需物質。當氧氣不足時，呼吸代謝被抑制，ATP產量減少，活性分子增多，引起機體氧化應激反應，致使組織損傷甚至死亡[1]。氣調儲糧技術即是利用這個原理，在密閉倉儲環(huán)境中隔絕外界O2或者人工充入N2或CO2降低O2比例，達到害蟲防治、綠色儲糧的目的[2]。氣調儲糧是我國未來生態(tài)儲糧的重要方式之一，目前已在綿陽、南京、上海、九江、蘇州等糧庫推廣應用[3]。

然而，經過長期進化，昆蟲形成了較強的低氧抗性，給這項技術帶來挑戰(zhàn)?，F實證明，一些鞘翅目、鱗翅目、直翅目、雙翅目、等翅目昆蟲等可以從數小時甚至數天缺氧中恢復[4-7]。在氣調儲糧時，將氧氣體積分數降至2%～5%、維持2～3個月可以有效地控制害蟲發(fā)展，當氧氣濃度恢復時，害蟲可能再次爆發(fā)[8-10]。這種能力在哺乳動物中罕見。因此，揭示昆蟲低氧適應機制，有助于推動氣調儲糧技術廣泛應用、構建新型害蟲防治策略。現對儲糧害蟲低氧適應策略及相關機制進行綜述。

1 儲糧害蟲低氧應答策略

生物通過行為趨避、組織改變、代謝重構、基因調控、遺傳變異等策略，形成了較強的低氧適應性。

1.1 昆蟲改變生物學行為適應低氧脅迫

當短時間低氧處理時，昆蟲及時調節(jié)氣孔開閉、增加腹部蠕動以暫時獲取外部氧氣；當仍不能滿足氧氣需求時，昆蟲抑制覓食、生長發(fā)育、繁殖行為，降低ATP所需，降低組織過氧化性損傷。另外，昆蟲可以調整食物結構，提高能源物質攝入比例，減少不必要的能量消耗。例如，四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)、綠豆象(Callosobruchuschinensis)、粉斑螟(Ephestiacautella)等昆蟲被低氧處理后生長發(fā)育減緩或停止，繁殖能力下降，但是子代孵化率卻提高[11-14]。這表明，氣調儲糧時，需將糧倉內氧氣降至極低，且維持足夠長時間才可充分抑制害蟲種群繁衍。

1.2 昆蟲改變組織形態(tài)適應低氧脅迫

當長時間低氧處理時，昆蟲通過改變細胞、體型體積大小，氣管系統結構等補償性策略來提高抗低氧脅迫能力[15,16]。當一些非脊椎動物或靠體表呼吸的脊椎動物體型增大，氣體交換效應減弱。因此，低氧耐受型赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)等昆蟲體型減小，有利于提高氣體交換效應即氧氣利用率[17,18]。

隨著形態(tài)學表征設備及技術提升，昆蟲體型大小、氣管結構等表型變化被直觀地體現。例如，利用 X線源相位對比技術，發(fā)現體型較大的昆蟲將身體大部分用于氣管系統，表明氣管投入與昆蟲體型大小成正相關[19]。低氧條件下，昆蟲氣管系統內大型多細胞傳導氣管(直徑<2 mm)和微小型氣管(直徑>90 nm)結構變化情況被逐步揭示。例如，利用同步輻射計算機斷層掃描技術(SR-μCT)、共焦顯微鏡分析，發(fā)現果蠅飛行肌內氣管形態(tài)補償變化主要發(fā)生在小的、遠端氣管和微氣管，而那些主分支和次分支氣管變化不明顯。此時，這些氣管直徑變大、分支增多，線粒體內氣管投入增加、氣管容積比增大，增加氧氣供應、減小ATP損耗，提高昆蟲低氧適應性[16,20]。昆蟲氣管分支過程具有高度可控性和保守性。某些糖基水解酶、disc生長因子等在果蠅氣管幾丁質-角質層合成與分解、維持管道功能穩(wěn)定過程起關鍵作用[21]。因此，深入分析這些因子對氣管組分影響，將有助于揭示低氧條件下昆蟲氣管結構穩(wěn)定性和可塑性機制。

1.3 昆蟲調整分子代謝適應低氧脅迫

生物表型發(fā)生變化時，必然伴隨著一系列分子代謝水平的變化。近年來， “組學”技術的發(fā)展為揭示一些非模式種如儲糧害蟲低氧適應機制提供了便利。在低氧條件下，有氧代謝被抑制，厭氧代謝被激活，供應ATP和能量，同時生成大量的代謝產物。其中，一些物質如乳酸、丙氨酸、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、乙醇、檸檬酸、醋酸鹽、甘油-3 磷酸鹽等易對昆蟲造成過氧化性損傷；而一些物質如肌醇、山梨糖醇、亞油酸、絡氨酸、色氨酸、脯氨酸、谷氨酸、4-氨基丁酸、甘油、甘露糖、木糖醇等可能有利于昆蟲適應低氧環(huán)境[12,22]。此時，葡萄糖的利用率提高，每分子葡萄糖生成ATP增多、電子減少[23]。

昆蟲發(fā)育階段不同，分子代謝響應機制有可能不同。研究發(fā)現，在缺氧條件下，果蠅成蟲體內木糖醇、甘露糖醇、甘氨酸、牛磺酸等保護性物質的含量明顯增加；而幼蟲體內甘露糖、木糖醇、甘油、絲氨酸、絡氨酸等物質明顯減少[24]。這說明，昆蟲根據需求來調控最初代謝方向、增強環(huán)境適應能力。成蟲階段側重于增加保護性物質、提高免疫防御能力，而幼蟲階段更傾向于增加能量、抗氧化代謝、與變性蛋白綁定等相關物質，為后續(xù)生存、發(fā)育做準備。

一些關鍵的代謝物功能及調控機制正在逐步被揭示。研究發(fā)現，琥珀酸鹽的累積，除了帶來組織缺血再灌注性損傷以外，激活低氧誘導因子(Hypoxia inducible factors，HIFs)信號途徑，誘導氣管重塑，使昆蟲在低氧條件下生存幾天甚至幾周時間[25]。因此，琥珀酸脫氫酶變化也會影響抗低氧脅迫過程。例如，低氧耐受型果蠅線粒體內琥珀酸脫氫酶活性降低，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產量降低，且伴隨著復合物Ⅰ和Ⅲ活性提高、復合物Ⅱ活性降低等生理現象[26]。琥珀酸脫氫酶等位基因調節(jié)昆蟲代謝率變化、HIF信號途徑激活，影響氣管發(fā)育、氧氣輸送、生存狀況以及種群繁衍等生物過程[27]。除琥珀酸以外，其他代謝產物如ROS、α-酮戊二酸等對生物低氧適應性的調控機制正被逐漸揭示[28]。

1.4 昆蟲改變基因表達模式適應低氧脅迫

當代謝水平發(fā)生改變時，往往伴隨著轉錄水平改變。大量研究表明，昆蟲體內大部分糖酵解基因表達量上調，線粒體代謝被抑制，一個轉錄因子hairy被誘導產生，抑制下游三羧酸循環(huán)(TCA)代謝通路的基因表達；一些關鍵消化酶編碼基因及其酶活性降低。涉及Notch、Toll/Imd、表皮生長因子(EGF)、胰島素受體、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等信號途徑的基因表達量上調或被誘導產生，相關信號通路及效應分子被激活[5,18,29,30]。這些信號途徑的激活、細胞呼吸蛋白調控、代謝酶多態(tài)性差異性變化等，不僅對提高昆蟲低氧適應能力至關重要，可能在保護哺乳動物免受低氧損傷方面也發(fā)揮了關鍵的作用。

基因表達模式往往隨著物種、齡期和處理方式改變。例如，經低氧篩選獲的低氧耐受型果蠅在成蟲、幼蟲基因變化情況差異明顯，其中，幼蟲體內差異基因(DEGs)比成蟲DEGs多；僅有少量DEGs同時出現在成蟲和幼蟲體內，大部分上調基因涉及免疫蛋白，下調基因涉及代謝酶類[18]。這也解釋了“成蟲與幼蟲在低氧響應時代謝傾向的不同”。同樣，在不同處理方式如連續(xù)低氧(CH)和間歇低氧(IH)，昆蟲基因數目和種類也存在明顯差異[31]?；虮磉_也受物種影響。上述研究也表明，赤擬谷盜、四紋豆象、綠豆象等低氧響應不同，基因表達模式也存在差異。在低氧條件下，綠豆象體內涉及TCA循環(huán)大部分基因表達量增加，這與滯育果蠅情況相似，與四紋豆象情況相反[32]。

目前，一些低氧響應基因如呼吸蛋白、線粒體氧化酶c、熱激蛋白、TCA循環(huán)相關酶、鐵氧還原蛋白等變化對生物低氧適應性有影響，具體功能正在不斷揭示中。例如，呼吸蛋白(Glob)被認為與氧氣供應有關。低氧時，Glob在大多數脊椎動物和水生生物如搖蚊(Chironomusspp)表達量增加；而果蠅Glob1基因表達量卻降低，在恢復常氧時表達量升高[33]。另外，研究還發(fā)現，Glob與卵細胞形成有關，并且可能受HIF調控，但是具體功能及調控機制仍不清?；凇敖M學”研究思路，利用已獲得低氧響應基因或代謝物，通過構建共表達分析，可以快速獲得關鍵調控因子即未來新型防治策略靶標位點，進一步揭示該調控因子的作用機制。

2 低氧應答調控機制

目前，關于昆蟲低氧抗性機制的研究多以模式生物為對象，針對非模式類儲糧害蟲的相關研究較少。無論脊椎或非脊椎動物的生長發(fā)育過程具有高度保守性和可塑性。因此，大量關于模式生物的相關研究必將為揭示儲糧害蟲低氧應答調控機制提供基礎和參考。將昆蟲低氧應答調控模式分為兩大類：HIF依賴型和非HIF依賴型調控模式。

2.1 HIF依賴型調控模式

近30年來，HIF一直被認為是生物低氧轉錄應答響應的關鍵調控因子。HIFs是一系列具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋/時鐘-芳香烴受體核轉位子-專一性蛋白結構域(bHLH/PAS)結構的蛋白，由α和β亞基構成，具有高度保守性。果蠅與哺乳動物HIFα和HIFβ同源的基因分別是sima和tango，在線蟲(Caenorhabditiselegans)體內分別是hif-1和aha-1。常氧時，HIFα亞基在脯氨酰羥化酶(PHD)和天冬氨酰羥化酶(FIH)作用下發(fā)生羥基化后，迅速與希佩爾-林道蛋白(VHL)結合而降解。低氧時，HIFα增加，轉運至細胞核與HIFβ形成異源二聚體(HIFα/ARNT)后，與低氧響應元件(Hypoxia responsive elements, HREs)綁定、誘導下游靶標基因表達，調控生長發(fā)育、新陳代謝、血紅蛋白合成、氣管重塑等[34,35](見圖1)。

圖1 HIF信號途徑調控模式

除了HREs以外，低氧響應基因序列中還存在其他順式作用元件，協同調控RNA轉錄起始和效率。例如，除HREs以外，四紋豆象HSP27、HSP21基因序列還存在熱休克元件(HSES)、CREB、GATA2、TATA等其他順式元件，它們與相應的轉錄因子結合調控HSP表達，如HSP啟動子序列中HSEs與熱休克轉錄因子HREs與HIF結合等共同誘導HSP表達，提高四紋豆象低氧適應能力[5]。這些順式作用元件與轉錄因子結合效應，影響HIF在低氧響應基因表達與調控過程中的功能。隨著研究深入，越來越多低氧響應基因被發(fā)現與HIF功能相關，這些基因序列結構、功能逐漸被揭示。例如，組蛋白脫甲基酶-2(KDM2)，一類人類癌癥中的解除管制因子，在果蠅、人類細胞中廣泛存在。研究證實，低氧時，KDM2啟動子與HIF1綁定后，共同參與調控果蠅低氧適應過程、人類癌癥細胞發(fā)育過程等[36]。

HIF發(fā)揮功能取決于HIF1α亞基與VHL蛋白綁定過程，與氧感受器(PHD和FIH)活性密切相關。在低氧條件下，PHD催化脯氨?；?Pro402和Pro564)，FIH天冬氨酰基(Asn803)發(fā)生羥基化反應。已知PHD和FIH活性受到多種因子影響(見圖2)。一些因子發(fā)揮正調控作用，如O2、Fe、VC等增加PHD2活性，降低HIF1α穩(wěn)定性；一些因子發(fā)揮負調控作用，如ROS、NO等抑制PHD2活性，提高降低HIF1α穩(wěn)定性，而PHD2是HIF1α負調控因子[18,34,37]。

注：“+”表示正調控，“-”表示負調控。圖2 生物體內各因子對HIF功能調控關系圖[35]

大部分調控因子的產生與線粒體功能有關。線粒體是重要氧氣感受器，對生物低氧響應起著觸發(fā)器的作用。低氧時，線粒體內代謝發(fā)生重構，氧化還原電位發(fā)生改變，調控胞質信號通路以防御低氧應激損傷。線粒體呼吸電子傳遞鏈(ETC)構成部分如細胞色素C復合物Ⅲ、復合物Ⅰ，Reike-iron硫蛋白、線粒體DNA、ATP合酶活性抑制因子1(ATPIF1)等，有助于HIF蛋白穩(wěn)定；線粒體內氧化還原電位、Fe2+、O2、代謝產物如TCA代謝產物、ROS、NO、VC、等，調控PHD活性，調控細胞內信號通路適應低氧脅迫[38]。這些因子的調控功能正逐步被研究。例如，在線粒體內，谷胱甘酸在谷氨酰胺酶作用下生成后，進入TCA循環(huán)，通過α-酮戊二酸轉換成琥珀酸，脂多糖(TLPs)累積，從而激活HIF功能[39]；TCA代謝產物檸檬酸鹽被輸送至細胞核生成胞質乙酰輔酶A，調控蛋白乙酰化，引起細胞信號通路核及表觀遺傳狀態(tài)[40]；線粒體代謝生成ROS，通過氧化信號蛋白結構中半胱氨酸殘基硫醇基團，調控細胞增殖、分化以及低氧脅迫[29]。

另外，一些調控因子屬于多蛋白復合物Branma/SWI/SNF、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/雷帕霉素信號靶點(TOR)、真核起始因子2(elF2)和真核翻譯延伸因子2(eEF2)等，在HIF功能調控過程發(fā)揮重要的作用[41]?？梢姡琀IF功能受多個不同因子協同調控。例如，sima和tango是果蠅HIF重要的調控因子，當敲除sima和tango功能時，Fatiga和IDH表達量明顯下降[42]。Fatiga是PHD氧受體之一，它通過調控HIF/Sima功能，影響昆蟲生長發(fā)育過程。當Fatiga缺失時，果蠅蛹、細胞體積變小；當Fatiga過表達時，果蠅成蟲翅膀細胞體積增大；當fatiga和sima基因同時過表達時，蛹的體積不變；另外，當fatiga過表達時，果蠅成蟲過度生長，但是HIFs蛋白表達量卻無顯著提高[43]。據猜測，fatiga可能通過一種不依賴于Sima/Tango信號途徑調控生長發(fā)育，但是具體調控模式仍未知。

2.2 非HIF依賴型調控模式

盡管HIF1激活作用具有一定的共性，但不同生物體的低氧耐性卻有很大差異。在低氧條件下，大部分低氧敏感性高的生物試圖補償ATP需求，而耐低氧的生物則減少ATP的供應和消耗[44-46]。這表明，除了HIF1以外，其他調控因子也參與了生物低氧適應過程。野生型與HIF1缺失型線蟲mRNA低氧應答情況相比基因表達量變化明顯[47]；昆蟲熱激蛋白被誘導產生需HIF1，而氣管末端向氧氣匱乏區(qū)補償發(fā)育則需HIF1和不依賴HIF1的組分協同作用等，進一步驗證了HIF1并不是唯一的低氧應答調控途徑[5,48,49]。在低氧條件下，NO/cGMP/PKG信號途徑被激活，通過誘導下游線粒體ATP敏感型鉀離子通道(KATP)，啟動細胞適應性保護機制，降低昆蟲細胞死亡率[50]；轉錄因子(FOXO)被誘導產生，調控下游葡萄糖代謝影響昆蟲低氧抗性；先天免疫轉錄因子NF-kappa B/Relish(FOXO靶標因子)及下游靶標基因被誘導產生；FOXO、Relish編碼基因被敲除時，昆蟲死亡率提高[51]；當TORC1途徑受抑制，脂肪體內脂質代謝受干擾，昆蟲生長發(fā)育減緩[5]； Wnt途徑被激活時，低氧耐受型果蠅成蟲羽化率提高；在腫瘤細胞里Wnt途徑也被激活[52]。Warts是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有抑制細胞生長調控功能，當Warts基因功能缺失、胰島素受體基因過表達時，氣管重塑加劇、氧氣供應量增加，低氧耐受性增強[15]。研究表明，除上述因子以外，Toll、JNK、Notch、胰島素受體、絡氨酸受體等參與了昆蟲低氧適應過程，具體調控機制正在研究中[18,53-55]。

2.3 其他

除了與HREs綁定以外，HIF與其他轉錄因子，共同調控生物低氧適應過程。例如，激活AKT-mTOR-HIF1α信號途徑，有助于增強細胞內糖酵解反應過程[56]。將埃及伊蚊(Aedesaegypti)腸道感染大腸桿菌后發(fā)現，組織內HIFα增加，HIF信號途徑啟動，同時下游胰島素/胰島素類生長因子(IGF-1)被激活，腺苷單磷酸激酶(AMPK)信號途徑被抑制，協同調控幼蟲生長與代謝過程[36]。HIF與其他轉錄因子結合、調控靶標基因表達的過程受磷酸化和亞硝基化水平影響[57]。隨著“組學”、分子生物技術發(fā)展，昆蟲低氧應答調控過程將被逐步揭示。

3 總結與展望

盡管氣調儲糧技術可以有效抑制害蟲種群發(fā)展，然而儲糧害蟲較強的低氧適應能力給這項技術實質應用帶來了挑戰(zhàn)。在長期密閉環(huán)境中，儲糧害蟲形成了一系列策略如改變生物學行為特征、組織結構、代謝與轉錄水平等來適應低氧脅迫。在這個過程中，多種信號轉導因子參與并發(fā)揮了重要調控功能。其中，低氧誘導因子(HIF)在誘導低氧響應基因表達，調控昆蟲生長發(fā)育、免疫、氣管重塑等過程發(fā)揮了關鍵作用。除HIF以外，Toll、NF-κB/、JNK、Notch、腫瘤抑制蛋白、SP因子、NO/cGMP/PKG、mTOR、Wart、FOXO等因子也發(fā)揮了重要的作用。這些調控因子彼此影響，共同參與調控昆蟲低氧適應過程。

目前，國際上關于昆蟲低氧適應性機制的研究多以模式生物如果蠅為對象，而以非模式類儲糧害蟲為研究對象的罕見。盡管它們會共享一些保守途徑，但是不同的生活方式、種類的昆蟲低氧響應過程也存在不同。轉錄組學分析表明，赤擬谷盜、四紋豆象、綠豆象等儲糧害蟲低氧適應時，基因表達模式與果蠅存在明顯差異。通過篩選關鍵調控因子或關鍵靶標基因，分析相關調控途徑，進一步揭示儲糧害蟲低氧適應性機制、彌補昆蟲低氧抗性研究的不足，為構建新型害蟲防治策略甚至人類癌癥治療提供有效靶標提供依據和參考。