穆渴心 蔡 俊 劉 棗 張 佳

(湖北工業(yè)大學(xué)，武漢 430070)

真菌可侵染多種初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品，不僅影響人畜健康，同時(shí)可造成大量經(jīng)濟(jì)損失。真菌毒素是一類由真菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的次生有毒代謝產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，易進(jìn)入食物鏈，造成人畜患病甚至死亡[1-3]?；谡婢c真菌毒素特性及其在農(nóng)副產(chǎn)品中廣泛分布的特點(diǎn)，目前已經(jīng)開發(fā)了薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)[4]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry，HPLC-MS)[5，6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid Chromatography Mass Spectrometry，LC-MS)[7]、酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)[8]、膠體金免疫技術(shù)(Colloidal Gold Immunochromatography)[9]等多種分析方法用于食品和農(nóng)產(chǎn)品中真菌與真菌毒素的測定[10]。HPLC-MS、LC-MS、TLC等理化方法的結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏，但通常耗時(shí)長、破壞性大，不適合在線應(yīng)用。ELISA、膠體金技術(shù)等屬于免疫學(xué)方法，特異性較強(qiáng)。但ELISA操作步驟繁瑣、對檢測人員的技術(shù)要求較高。膠體金技術(shù)其膠體溶液的穩(wěn)定性較差、存放時(shí)間相對較短及靈敏度受到多種因素的影響。近年來，隨著多種現(xiàn)代無損檢測技術(shù)的發(fā)展，在真菌與真菌毒素領(lǐng)域，已有近紅外光譜(Near-infrared spectroscopy，NIRS)和中紅外光譜(Mid-infrared spectroscopy，MIRS)、電子鼻(Electronical nose，EN)、高光譜成像(Hyperspectral imaging，HSI)、熒光光譜法(Fluorescence spectroscopy，F(xiàn)S)和太赫茲時(shí)域光譜(THz time-domain spectroscopy，THz-TDS)應(yīng)用于不同的農(nóng)產(chǎn)品中真菌和真菌毒素的檢測研究，本文綜述了不同分析方法與化學(xué)計(jì)量學(xué)算法的結(jié)合應(yīng)用，并討論了無損檢測技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法檢測真菌毒素技術(shù)的未來趨勢和挑戰(zhàn)。

1 真菌及真菌毒素

農(nóng)產(chǎn)品易被曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉菌屬(Penicillium)和鏈格孢屬(Alternaria)侵染。產(chǎn)生的真菌毒素包括黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFs)、赭曲霉毒素 (Ochratoxin)、赭曲霉毒素包含OTA、OTB、OTC、展青霉素(Patulin，PAT)和鐮刀菌屬毒素(Fusarium toxins)，鐮刀菌屬毒素包括單端孢霉烯族化合物(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON、雪腐鐮刀菌醇、3-乙酰-DON、15-乙酰-DON、T-2和HT-2毒素以及其他化學(xué)相關(guān)化合物)、伏馬菌素(Fumonisins，F(xiàn)B)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZON)和玉米赤霉烯酮衍生物(Zearalenone derivatives，ZONs)等，目前共發(fā)現(xiàn)真菌毒素400余種[11]。

其中，AFB1已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為第1類致癌物。黃曲霉毒素可造成機(jī)體肝臟和膽囊癌變、致畸、致突變；OTA和橘霉素可造成腎臟病變；DON和PAT可造成胃腸道病變；FB和鏈格孢菌毒素可引起人體食道癌[12，13]。農(nóng)副產(chǎn)品中真菌和真菌毒素的分布不均勻，且難以從糧食等農(nóng)副產(chǎn)品中分離[14]，增加了檢測難度，因而需要無損、快速的檢測手段。

2 快速無損檢測方法

2.1 近紅外光譜(NIRS)和中紅外光譜(MIRS)

作為農(nóng)副產(chǎn)品理化性質(zhì)檢測技術(shù)，NIRS和MIRS以其高效的優(yōu)勢逐步成為廣泛應(yīng)用于產(chǎn)毒真菌和真菌毒素快速無損檢測的手段[15]。Tripathi等[16]采用偏最小二乘回歸模型對含AFB1(15～500 μg/kg)的紅辣椒粉漫反射率數(shù)據(jù)進(jìn)行了定量檢測，驗(yàn)證了MIRS檢測AFB1含量的可行性。Moscetti等[17]將板栗3個(gè)不同部位的漫反射光譜數(shù)據(jù)融合，將重度霉變、中度霉變、對照組完全分開，分類準(zhǔn)確度高達(dá)97%。Durmus等[18]為鑒別黑曲霉侵染的無花果，采用NIRS成功區(qū)分出侵染與未侵染的無花果，并發(fā)現(xiàn)200～1 100 nm含有特征信息較多。Zheng等[19]發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素產(chǎn)生的前體物質(zhì)為雜色曲菌素，通過對雜色曲菌素的檢測，可以預(yù)警黃曲霉毒素的產(chǎn)生，其定量模型采用極端梯度提升算法，均方根誤差為3.57 μg/kg。

波長篩選是常用的提高檢測效率的方法。Teean等[20]以1 120、1 300和1 650 nm作為特征波長對感染不同時(shí)間黃曲霉的水果進(jìn)行了分類，得到91%～100%不等的分類精度，發(fā)現(xiàn)二次判別分析分類精度高于線性判別分析。Williams等[21]利用NIRS收集被真菌侵染的玉米粒光譜數(shù)據(jù)，選取1 405 nm(淀粉的特征吸收)、1 660 nm(芳香結(jié)構(gòu)的特征吸收)、1 900 nm(淀粉的特征吸收)、2 136 nm(蛋白質(zhì)的特征吸收)作為特征波長進(jìn)行PLS分析，在包含時(shí)間變量的模型中發(fā)現(xiàn)玉米粒腐敗程度與侵染時(shí)間存在正相關(guān)關(guān)系，R2為0.98。

NIRS和MIRS可以采用透射、漫透射、漫反射等各種光譜測量方式，反射光譜可以收集被侵染的農(nóng)產(chǎn)品的表面信息，透射光譜則可以獲得樣品的內(nèi)部特征信息[22]。建模方法中，已經(jīng)普遍認(rèn)為非線性方法比線性方法具有更強(qiáng)的模型適應(yīng)能力。同時(shí)，運(yùn)用合適的波長選擇算法，如競爭性自適應(yīng)重加權(quán)、隨機(jī)森林、連續(xù)投影算法等[23]可篩選出含有特異性信息較多的波長，對復(fù)雜信息變量進(jìn)行優(yōu)化，簡化模型。

2.2 電子鼻(EN)

考慮到不同氣敏傳感器的特異性，采用多特征融合表征的模型構(gòu)建方法，可以提高EN的預(yù)測能力[30-32]。郝銀鳳[33]研究了多特征組合表征測定AFB1、ZON、嘔吐毒素含量，結(jié)果顯示基于核變換 FDA的 BPNN誤差均小于 0.6%。

利用EN對真菌毒素直接進(jìn)行分析的研究相對較少，目前EN主要用于產(chǎn)毒真菌的檢測，對真菌毒素含量較低的樣本進(jìn)行定量時(shí)需要改良或優(yōu)化儀器[34]。

2.3 高光譜成像(HSI)

HSI是集合了光譜與圖像的新型分析技術(shù)，能夠同時(shí)收集樣本的光譜和空間特性，獲得內(nèi)外部的品質(zhì)信息，因而可以用于檢測糧油中的真菌和真菌毒素[35]。

Kimuli等[36]采用VNIR-HSI收集了400～1 000 nm范圍內(nèi)含AFB1為0.003 3～0.5 μg每粒的4個(gè)濃度梯度共600粒玉米粒的光譜，應(yīng)用PCA進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，F(xiàn)isher線性判別分析進(jìn)行分類預(yù)測，準(zhǔn)確率>96%。Kheiralipour等[37]利用NIR-HSI檢測開心果中的AFB1，發(fā)現(xiàn)QDA對不同菌種和不同時(shí)期的健康籽粒和感染籽粒的分類準(zhǔn)確度更高。Barbedo等[38]將DON污染的小麥按照不同濃度分類，二分類準(zhǔn)確率為81%，三分類準(zhǔn)確率為72%。Chu等[39]采用短波紅外高光譜成像技術(shù)對玉米中AFB1濃度<20 μg/L、20～100 μg/L、≥ 100 μg/L進(jìn)行了檢測。選取1 317、1 459、1 865、1 934、2 274 nm作為特征波長進(jìn)行模型簡化，支持向量機(jī)準(zhǔn)確率為82.5%，R2=0.70。

HSI相較二維光譜技術(shù)可獲取更多有效信息，但由于HSI屬于3-D “數(shù)據(jù)立方體”[40]，其中包含了大量冗余數(shù)據(jù)，因而在應(yīng)用時(shí)需挖掘有效信息。此外，HSI不適用于液體或均質(zhì)樣品，因?yàn)楦吖庾V的成像功能旨在可視化空間異質(zhì)性[41]。

2.4 熒光光譜法(FS)

FS是一種利用物質(zhì)熒光性質(zhì)進(jìn)行無損檢測的方法。激光誘導(dǎo)熒光(LIFS)、單光子誘導(dǎo)熒光在真菌毒素檢測中應(yīng)用較廣泛[42]。AFB和AFG在受到紫外線照射時(shí)會(huì)產(chǎn)生青黃色熒光(Bright Greenish Yellow Fluorescence，BGYF)，這使得FS分析黃曲霉毒素的侵染成為可能[43]。Smeesters等[44]應(yīng)用單光子誘導(dǎo)熒光和雙光子誘導(dǎo)熒光光譜對AFB1侵染的玉米進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在365、 405、 730、 750、 780、810 nm波長下，被侵染的玉米和未被侵染的玉米均存在光譜差異，其中，365 和780 nm波長下的光譜差異最大。Yao等[45]利用FS對AFB1污染的玉米粒進(jìn)行檢測，采用兩種分類算法(最大似然法和二進(jìn)制編碼法)，將玉米粒分為“對照組”和“污染組”。準(zhǔn)確率分別為87%和88%。Davis等[46]應(yīng)用FS對AFB1含量<15 μg/kg與AFB1含量>15 μg/kg的花生樣本建立模型，識(shí)別準(zhǔn)確率超過80%。Smeesters等[47]發(fā)現(xiàn)熒光光譜下，AFB1含量<1 μg/kg與AFB1含量>70 μg/kg的玉米粒在400～550 nm內(nèi)可完全分開。

LIFS已成功地用于農(nóng)產(chǎn)品中痕量真菌毒素的測定。Wu等[48]采用LIFS對2種開心果中的AFB1進(jìn)行了檢測。標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)對混合樣品AFB1污染具有良好的判別能力(精度≥98.4%)。這些結(jié)果初步表明LIFS對人工污染AFB1的樣本進(jìn)行篩選是可行的，但對天然污染樣品的性能還需要進(jìn)一步的研究。

學(xué)者已經(jīng)驗(yàn)證了LIFS檢測AFB1的可行性，但仍然存在一些問題。首先，目前只進(jìn)行了自建LIFS系統(tǒng)的靜態(tài)實(shí)驗(yàn)，無法滿足實(shí)際在線檢測分析的高通量要求[49]。其次，早期的研究主要集中在單一探測器的LIFS，一個(gè)激光探頭和一個(gè)探測探頭，很難收集樣本的全部信息。此外，由于樣品本身表面不均勻所產(chǎn)生的散射效應(yīng)，單個(gè)探測探針無法獲得完整的熒光信號(hào)。近年來，有學(xué)者采用高性能相機(jī)結(jié)合雙重紫外線激發(fā)光源收集玉米樣品的熒光圖像，單波段熒光數(shù)據(jù)(436 nm和532 nm)結(jié)合圖像數(shù)據(jù)用于分析樣本中黃曲霉毒素，實(shí)現(xiàn)了高速、大批量篩選，并獲得了較高精度的檢測結(jié)果[50]。為增強(qiáng)熒光信號(hào)，有學(xué)者嘗試增加生物傳感器或?qū)Υ郎y物進(jìn)行富集等方法，均獲得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[51]。

2.5 太赫茲時(shí)域光譜(THz-TDS)

太赫茲波是0.1～10 THz的電磁波，對應(yīng)輻射頻帶范圍為30～3 000 μm。THz波介于微波與紅外輻射之間，相比短波的紅外光，太赫茲波具有更高的穿透性[52]。太赫茲輻射的光子能量較低(1 THz的能量為4 meV)屬于非電離電磁波，非電離形式的THz波不會(huì)破壞活細(xì)胞的組織和生物分子結(jié)構(gòu)，因而可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[53]、包裝商品檢驗(yàn)[54]、食品檢驗(yàn)[55]、水污染檢測等領(lǐng)域[56]。

THz-TDS是最常用的太赫茲光譜技術(shù)[57]。Ge等[58]對乙腈溶液中AFB1進(jìn)行了測定，采用線性(PLS、PCR)回歸模型和非線性(SVM、PCA-SVM)回歸模型，在0.4～1.6 THz的頻率范圍內(nèi)，采用THz-TDS定量測定乙腈溶液中AFB1的濃度。結(jié)果表明，AB1濃度為1～50 μg/L時(shí)，非線性回歸模型優(yōu)于線性回歸模型。Liu等[59]用太赫茲光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)測定大豆油中的AFB1，發(fā)現(xiàn)BPNN結(jié)合T-SNE 檢測結(jié)果最佳(R2=0.994 8， RMSEP=0.712 4 μg/kg)，對于AFB1質(zhì)量濃度低于1 μg/kg的大豆油進(jìn)行檢測的準(zhǔn)確率高于90%。

作為基于光譜技術(shù)的新興檢測手段，太赫茲光譜技術(shù)有一定的應(yīng)用限制。第一，太赫茲輻射與生物分子間具有一定的相互作用，可以從微觀水平上解釋生物分子對太赫茲波的吸收規(guī)律，但需要運(yùn)用有效的數(shù)據(jù)分析方法降低信號(hào)噪聲，提高信噪比。第二，改進(jìn)太赫茲光譜儀器的硬件設(shè)備，如超材料，可提高太赫茲光譜的應(yīng)用范圍，增強(qiáng)儀器敏感性，提高分析準(zhǔn)確率[60]。

3 總結(jié)與展望

現(xiàn)代無損檢測技術(shù)以近紅外光譜和中紅外光譜、電子鼻、高光譜成像為代表，通過采集樣本的光學(xué)、電學(xué)及聲學(xué)特性結(jié)合信息學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中真菌生物量與真菌毒素侵染的準(zhǔn)確、快速檢測，為農(nóng)產(chǎn)品在線、實(shí)時(shí)、無損檢測提供研究基礎(chǔ)。

現(xiàn)代無損檢測技術(shù)的結(jié)果可靠性依賴于樣本數(shù)據(jù)庫的建立，受到采樣范圍、樣本狀態(tài)及待測物多樣性等因素的影響，然而，隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合模型傳遞與信息融合技術(shù)，現(xiàn)代無損檢測技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品真菌及真菌毒素侵染的定性與定量分析中的應(yīng)用必將得到更廣泛的應(yīng)用。